硫利達嗪對乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7的殺傷效應(yīng)

童斯浩，汪 毅，龔 理，錢振玨，柯章敏，鮑揚漪

硫利達嗪對乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7的殺傷效應(yīng)

童斯浩1，汪 毅1，龔 理1，錢振玨2，柯章敏1，鮑揚漪1

摘要目的 觀察硫利達嗪對人乳腺癌細胞MDA-MB-231 和MCF-7的凋亡作用，并探討其機制。方法 采用MTT法測定硫利達嗪對細胞的抑制作用，計算半數(shù)抑制濃度（IC50）；流式細胞術(shù)檢測硫利達嗪對細胞周期分布和凋亡的影響；比色法測定藥物對細胞Caspase-3活性的影響；Western blot法檢測凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2、Bax表達的變化。結(jié)果

硫利達嗪作用24 h后，MDA-MB-231、MCF-7細胞增殖明顯呈劑量依賴性抑制，其IC50為18、22 μmol／L。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，隨著加入硫利達嗪濃度的提高，MDA-MB-231、MCF-7細胞均發(fā)生不同程度的G0／G1期阻滯、細胞凋亡程度增加及伴隨胞內(nèi)Caspase-3活性增加。各實驗組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Western blot法結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)、促凋亡蛋白Bax表達明顯上調(diào)，各實驗組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)論 硫利達嗪對乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7有顯著的增殖抑制作用且可顯著誘導腫瘤細胞發(fā)生G0／G1期阻滯及凋亡，伴隨Caspase-3活性的上調(diào)，其毒性機制可能與腫瘤細胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)、Bax上調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞乳腺癌；硫利達嗪；周期；凋亡；Caspase-3；Bcl-2；Bax

2014－12－29接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院腫瘤科，合肥 230061

2安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院腫瘤科，合肥 230001

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升且趨向低齡化；尤以雌激素、孕激素及人類表皮生長因子受體2表達陰性的三陰乳腺癌惡性程度更高，預后較差，如何有效針對三陰乳腺癌的新藥研究成為目前乳腺癌治療的重點［1－2］。硫利達嗪為吩噻嗪衍生物，廣泛用于治療嚴重的精神和情緒障礙，如精神分裂癥［3］。在惡性腫瘤治療方面，該藥物起初被用于治療腫瘤相關(guān)發(fā)熱、出汗與抑郁癥［4］。研究［5］證實硫利達嗪在體外可對抗多種腫瘤細胞活性，提示其可能作為一種新型抗癌藥物，應(yīng)用于以后的腫瘤臨床治療。該研究以硫利達嗪作用于三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞和乳腺癌MCF-7細胞，觀察其對乳腺癌細胞的周期變化及凋亡發(fā)生的影響，為乳腺癌的綜合治療提供實驗依據(jù)，為臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 主要儀器 FACS Calibur流式細胞儀購于美國BD公司；680全自動酶標儀購于美國BIORAD公司；8000DH型二氧化碳培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司；CKX41型倒置顯微鏡購于日本OLYMPUS公司。

1．1．2 實驗藥物與細胞株 硫利達嗪購自美國Gibco公司；乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞株購自中國科學院上海細胞庫，本實驗室傳代保存。

1．1．3 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素－鏈霉素雙抗、含乙二胺四乙酸（EDTA）胰酶、二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清購于美國Gibco公司；流式抗體Annexin V-FICT／PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒購于中國貝博公司；MTT法檢測試劑盒購于美國Sigma公司；小鼠抗人Bcl-2、Bax單克隆抗體購于美國Abcam公司。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養(yǎng)及藥物配制 人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7細胞接種于10%胎牛血清、1%雙抗（100 μg／ml的青霉素和鏈霉素）的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于溫度為37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。2～3 d換液，0.25%胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行各項實驗。硫利達嗪原藥以生理鹽水、DMSO輔助溶解，配成0.1 mol／L的原液，分裝后放置－80℃?zhèn)溆?。實驗時將分裝好的原液配制成相應(yīng)的工作液，DMSO終濃度小于0.1%。

1．2．2 細胞增殖抑制實驗 取對數(shù)生長期乳腺癌細胞，0.25%胰酶消化，1 000 r／min離心5 min，重復2次；調(diào)整細胞密度為4×104個／ml，100 μl／孔接種至96孔板。4～6 h待細胞貼壁后換液，37℃孵育過夜，實驗組（5、10、15、20、25、30 μmol／L硫利達嗪），

對照組（加入培養(yǎng)基），分別培養(yǎng)6、12、24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。實驗組與對照組均設(shè)3個復孔。MTT法檢測時每孔加入10 μl MTT（5 g／L），避光孵育4 h，棄上清液；每孔加入100 μl DMSO，室溫振蕩10 min，以酶標儀在490 nm雙波長檢測相應(yīng)的吸光度（absorbance，A）。抑制率（%）＝（對照組孔A值－實驗組孔A值）／對照組孔A值×100%。實驗重復3次。

1．2．3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡的變化 取對數(shù)生長期乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7，調(diào)整細胞密度至3×104個／ml，以每孔2 ml接種于6孔板；實驗組3孔，對照組1孔。硫利達嗪分別以15、20、25 μmol／L加入實驗組孔，對照組換液不加藥；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，胰酶消化細胞，1 000 r／min離心5 min，棄上清液；預冷PBS洗滌細胞2遍，再將細胞加入4℃70%無水乙醇溶液混勻，固定過夜。第2天，1 000 r／min離心5 min，棄乙醇溶液，預冷PBS洗滌細胞2遍后棄上清液；加入400 μl溴化丙啶（propidium iodide，PI）染液，4℃避光孵育40 min，流式細胞儀檢測細胞周期，實驗重復3次。以同樣上述體系培養(yǎng)、處理細胞，收集細胞（包括上清液中細胞），預冷的PBS洗滌2次，調(diào)整細胞密度為1×106／ml，取60 μl懸液加入流式管中，以10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI標記，震蕩混勻后室溫避光孵育15 min，PBS洗滌2遍后加入400 μl流式鞘液，以流式檢測細胞凋亡程度。Annexin V-FITC和PI標記的細胞即為凋亡細胞。細胞凋亡率（%）＝凋亡細胞數(shù)／總細胞數(shù)×100%。實驗重復3次。

1．2．4 Caspase-3活性的檢測 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度3×104個／ml培養(yǎng)于6孔板中；實驗組3孔，對照組1孔，每孔2 ml。待細胞4～6 h貼壁后換液，37℃孵育過夜，以15、20、25 μmol／L的硫利達嗪加入實驗組孔培養(yǎng)24 h；每孔分別胰酶消化，1 000 r／min離心5 min，PBS洗滌2遍；收集細胞并裂解，取樣本100 μl、Ac-DEVD-pNA（Caspase-3四肽熒光底物）10 μl共同加入96孔板中；37℃孵育1 h后于波長為405 nm處檢測樣本A值，以不加底物的樣本為空白對照，實驗重復3次。

1．2．5 Western blot法檢測蛋白表達 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度3×104個／ml培養(yǎng)于6孔板中，每孔2 ml；實驗組3孔，對照組1孔。待4～6 h細胞貼壁后換液，37℃孵育過夜，硫利達嗪分別以15、20、25 μmol／L加入實驗組孔，培養(yǎng)24 h；PBS洗滌2遍，收集細胞。蛋白裂解液冰上裂解30 min，4℃12 000 r／min離心30 min提取總蛋白。BCA法蛋白定量后加入5×Loading Buffer，100℃變形15 min；12% SDS-PAGE凝膠電泳，按照30 μg／孔上樣；12%SDSPAGE凝膠電泳，恒壓80 V電泳至分離膠，恒壓120 V至電泳結(jié)束，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上（220 mA、120 min）。TBST配制5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入小鼠抗Bcl-2（1∶1 000）、小鼠抗Bax（1∶1 000）一抗室溫孵育1 h，TBST沖洗3次，每次10 min。辣根過氧化酶標記山羊抗小鼠二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST沖洗3次，每次10 min；ECL顯影，暗室曝光成像。

1．3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用單因素方差分析及Dunnette-t檢驗。

2 結(jié)果

2．1 硫利達嗪對乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7增殖的影響 MTT法檢測結(jié)果顯示，硫利達嗪對兩株細胞的增殖抑制效應(yīng)呈劑量依賴性增強。藥物分別作用6、12、24 h，其中6 h中25 μmol／L濃度的硫利達嗪即可使MDA-MB-231的增殖抑制率達約76%，MCF-7達約70%。方差分析MDA-MB-231細胞MCF-7細胞組間差異均有統(tǒng)計學意義（F＝3.029E3、2.525E3，P＜0.01）。各實驗組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。通過SPSS 16．0軟件計算，硫利達嗪對MDA-MB-231和MCF-7的半數(shù)抑制濃度（IC50）值為18、22 μmol／L。細胞光鏡（×200倍）下觀察，硫利達嗪作用24 h后，對照組細胞呈現(xiàn)標準的貼壁生長，輪廓明確、清楚，生長旺盛；而隨著藥物濃度的增加，細胞明顯輪廓不清、貼壁不緊、體積縮小、邊緣透亮、間隙增加，甚至出現(xiàn)漂浮狀細。見圖2、3。

2．2 流式細胞術(shù)檢測硫利達嗪對MDA-MB-231、MCF-7細胞凋亡及周期的影響 流式細胞儀結(jié)果顯示，15、20、25 μmol／L藥物作用24 h后MDA-MB-231的凋亡率為9.33%、33.94%、78.71%，MCF-7凋亡率為10.47%、27.50%、60.62%。方差分析MDA-MB-231細胞、MCF-7細胞組間差異均有統(tǒng)計學意義（F＝4.137E3、3.099E3，P＜0.01）。各實驗組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），見圖4、5。周期分析顯示，MDA-MB-231、MCF-7在硫利達嗪作用24 h后均出現(xiàn)G0／G1期阻滯。G0／G1期方差分析MDA-MB-231細胞、MCF-7細胞，組間差異有統(tǒng)計學意義（F＝812.229、265.542，P＜0.01）。各實驗

組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖6、7。

2．3 硫利達嗪對MDA-MB-231、MCF-7細胞Caspase-3活性的影響 Caspase-3活性檢測結(jié)果顯示，藥物作用24 h后，隨著加入硫利達嗪濃度的增加，乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7的Caspase-3活性明顯增加。方差分析MDA-MB-231細胞、MCF-7細胞，組間差異均有統(tǒng)計學意義（F＝806.448、1.834E3，P＜0.01）。各實驗組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖8。

2．4 Western blot法檢測硫利達嗪對MDA-MB-231、MCF-7細胞相關(guān)凋亡蛋白表達的影響 不同濃度硫利達嗪作用24 h后，Western blot檢測結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)、促凋亡蛋白Bax表達明顯上調(diào)，各實驗組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖9、10。

3 討論

乳腺癌治療手段多樣，但在臨床治療中常伴隨易耐藥、易復發(fā)、轉(zhuǎn)移率高等特點，成為治療中的難題。硫利達嗪作為治療精神疾病的藥物已經(jīng)在臨床上廣泛運用，隨著研究的深入，其抗腫瘤的特性也得到證實。研究［6－7］顯示硫利達嗪可顯著降低人類急性髓細胞白血病細胞的增殖與自我更新能力。Byun et al［8］發(fā)現(xiàn)硫利達嗪可通過抑制FAK-mTOR通路下調(diào)腫瘤細胞血管內(nèi)皮生長因子的表達，從而降低宮頸癌細胞OVCAR-3、2774增殖速度和腫瘤的侵襲能力。Rho et al［9］發(fā)現(xiàn)硫利達嗪對宮頸癌細胞具有顯著的細胞毒性，并可下調(diào)周期蛋白CyclinD1和CDK4的合成，誘導腫瘤細胞發(fā)生G1期阻滯，并通過抑制PI3K／AKT途徑發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

細胞凋亡是細胞受環(huán)境刺激后，在基因調(diào)控下產(chǎn)生的主動死亡過程。Caspase級聯(lián)反應(yīng)、Bcl-2家族抗凋亡和促凋亡蛋白表達的改變等，都與凋亡的發(fā)生密

切相關(guān)［10］。Caspase家族中的Caspase-3在凋亡中起到關(guān)鍵作用，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分?；罨腃aspase-3可直接剪切多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶、DNA依賴性蛋白激酶等，從而影響細胞DNA的復制、轉(zhuǎn)錄及修復過程。Bcl-2家族蛋白通過維持線粒體外膜的完整性，從而控制線粒體內(nèi)細胞色素C等促凋亡分子的釋放。其中Bcl-2蛋白在線粒體膜外發(fā)揮作用，維持線粒體膜穩(wěn)定性，而Bax蛋白通過破壞線粒體膜的完整性發(fā)揮促凋亡作用［11］。Bcl-2和Bax通過同源和異源性二聚體來調(diào)節(jié)細胞凋亡，Bcl-2／Bax正常情況下在細胞中比例相對固定，若外界刺激使得Bcl-2表達增高時，可致Bax的同源二聚體分離且促使細胞出現(xiàn)抗凋亡作用，從而引起腫瘤的發(fā)生［12］。

本研究結(jié)果顯示，硫利達嗪于體外可顯著抑制乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7的增殖，增殖抑制率隨著時間的延長和濃度的增加而升高；細胞光鏡下的變化亦非常明顯，在20 μmol／L濃度時，乳腺癌細胞即明顯出現(xiàn)皺縮、數(shù)量降低。流式細胞術(shù)顯示，在不同硫利達嗪藥物濃度下，兩組乳腺癌細胞株均發(fā)生了G0／G1期阻滯，細胞凋亡率也隨著藥物濃度的增加而升高，而同比15、20、25 μmol／L濃度作用下，MDAMB-231 G0／G1期阻滯要明顯高于MCF-7；在20、25 μmol／L濃度下，三陰乳腺癌MDA-MB-231的凋亡率也要高于MCF-7，這為尋求三陰乳腺癌新的治療方法提供重要依據(jù)。本研究顯示，兩組乳腺癌細胞隨著藥物濃度增加，Caspase-3活性明顯增加，與此同時，兩組乳腺癌細胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)，且促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)，提示其促凋亡機制可能是硫利達嗪下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、上調(diào)促凋亡蛋白Bax，破壞了線粒體膜完整性而促發(fā)的。另外，因Bcl-2／Bax表達水平的改變，提示硫利達嗪在低濃度時可能會對腫瘤細胞具有一定的表觀遺傳修飾效應(yīng)。

綜上所述，硫利達嗪對乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7有著明顯的周期阻滯和凋亡效應(yīng)，尤以對雌激素、孕激素及人類表皮生長因子受體2陰性的乳腺癌細胞MDA-MB-231的殺傷效應(yīng)更為顯著，提示其可能具有潛在治療三陰乳腺癌的價值。但是，硫利達嗪對腫瘤細胞其他凋亡調(diào)節(jié)蛋白的表達影響，其與化療藥物及靶向藥物等治療手段的配伍協(xié)同效應(yīng)，以及在動物模型上抗癌效應(yīng)及機制的證實尚需進一步研究。

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Killing effect of thioridazine on the proliferation of breast cancer cells MDA-MB-231 and MCF-7

Tong Sihao，Wang Yi，Gong Li，et al
（Dept of Oncology，The Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230061）

AbstractObjectives To investigate the anti-proliferative and apoptosis-inducing effects and the possible molecular mechanisms of thioridazine on breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MCF-7．Methods The anti-proliferative effects of thioridazine on MDA-MB-231 and MCF-7 cells were measured with MTT and the values of IC50were calculated．Flow cytometry was used to measure the cell cycle arresting and apoptosis．Caspase-3 activity assay kit was

performed to detect Caspase-3 activity levels．The expression changes of the Bcl-2 and Bax were detected by western blot．Results After treated with thioridazine for 24 h，MDA-MB-231 and MCF-7 cells were significantly inhibited by the drug extracts．The values of IC50were respectively 18 μmol／L and 22 μmol／L．Flow cytometry showed cells’G0／G1phase arrest along with an increase of apoptosis and intracellular Caspase-3 activity with the increase of thioridazine concentration．Western blot showed concentration-dependant decrease in Bcl-2 and increase in Bax proteins．Each experimental group compared with the control group，the differences were statistically significant（P＜0.01）．Conclusion Thioridazine has obvious cytotoxic effect on breast cancer cells MDA-MB-231 and MCF-7．It obviously induces breast cancer cells G0／G1phase arresting and apoptosis，accompanied by up-regulation of Caspase-3 activity．The mechanism may be related to the down-regulation of Bcl-2 and up-regulation of Bax．

Key wordsbreast cancer；thioridazine；cell cycle；apoptosis；Caspase-3；Bcl-2；Bax

作者簡介：童斯浩，男，碩士研究生；鮑揚漪，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：761760565＠qq．com

基金項目：合肥市科技計劃項目［編號：合科（2013）183－28］

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0452－07

中圖分類號R 737.9；R 971．41