子宮結(jié)合帶干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

康康，王藹明，尹善德，趙勇，王明凱，黃紹敏

間充質(zhì)干細(xì)胞(m esenchym al stem cells，MSCs)屬于成體干細(xì)胞，是一種具有自我更新和多向分化能力的多能細(xì)胞[1]，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞在2004年被發(fā)現(xiàn)并分離出來，目前已應(yīng)用于多種臨床試驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[2-4]。雖然子宮內(nèi)膜再生能力強(qiáng)，其應(yīng)用價(jià)值已得到一定程度的肯定，但畢竟數(shù)量有限，而子宮結(jié)合帶組織標(biāo)本充足，與子宮內(nèi)膜具有相似性[5]和相同的胚胎起源[6-7]，其厚度變化與子宮內(nèi)膜一樣具有周期性，且探索子宮結(jié)合帶組織中是否含有MSCs具有重要意義。近年來，有學(xué)者提出子宮內(nèi)膜異位癥(EH)的干細(xì)胞學(xué)說，認(rèn)為EH病灶中的終末細(xì)胞不能維持病灶的長期發(fā)展[8-10]，且已有研究發(fā)現(xiàn)EH患者子宮結(jié)合帶的厚度發(fā)生改變，甚至有學(xué)者提出可通過結(jié)合帶的厚度改變來診斷EH[11]。若子宮結(jié)合帶中含有MSCs，即子宮結(jié)合帶干細(xì)胞(uterine junctional zone stem cells，uJZSCs)，其是否參與了EH的發(fā)生發(fā)展仍有待探究。本研究觀察子宮結(jié)合帶細(xì)胞形態(tài)，貼壁情況，表面標(biāo)志物表達(dá)情況，細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)特征以及成脂、成骨誘導(dǎo)分化能力，旨在綜合評(píng)估子宮結(jié)合帶是否可作為MSCs的來源。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及處理 子宮結(jié)合帶組織由海軍總醫(yī)院手術(shù)室提供，均取自育齡期女性，年齡30～52歲，因子宮肌瘤、宮頸癌、卵巢癌而行子宮切除術(shù)(術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未服用激素類藥物)。所取組織均遠(yuǎn)離患處2cm以上，首先去除子宮內(nèi)膜組織，用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗后，獲取子宮結(jié)合帶組織(均由病理學(xué)證實(shí)[12])，置入無菌生理鹽水中，2h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。所有子宮結(jié)合帶組織均經(jīng)病理檢查排除子宮內(nèi)膜，標(biāo)本留取經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，征得患者同意并簽署知情同意書。

樣本的處理及培養(yǎng)：樣本送至實(shí)驗(yàn)室后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)洗滌，直至去除紅細(xì)胞，將標(biāo)本剪成10mm3小塊，加入2倍體積0.25%胰酶，置于37℃水浴箱中消化30m in，加入等體積含10% FBS的IMDM培養(yǎng)基中止消化。以2500r/m in離心10m in，并用PBS洗滌2次，加入2倍體積0.1%膠原酶Ⅰ消化2h，2000r/m in離心8m in，用PBS清洗2次后接種到培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，72h后半量更換培養(yǎng)基，之后每周更換2次。

1.2 試劑與儀器 IMDM培養(yǎng)基及試劑購于Gib co公司，胎牛血清(FBS)購于四季清公司，CCK-8試劑盒購于Do jindo公司，CD13-FITC、CD29-APC、CD44-PE、CD90-FITC、CD14-APC、CD19-APC、CD34-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD105-PercP、CD166-PE、HLA-DR-APC、HLA-ABC-FITC購于BD公司。流式細(xì)胞儀(型號(hào)為BD FACS Calibu r)購于BD公司。

1.3 u JZSCs形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞接種后72h半量換液，7d后全量換液，去除未貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞融合程度達(dá)80%～90%時(shí)，用0.125%胰酶消化后傳代，并于每一代傳代前用倒置顯微鏡拍照記錄。

1.4 u JZSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物分析 取第3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析，鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs，用0.1%胰酶消化并采集細(xì)胞，制成1×106/m l的單細(xì)胞懸液，分別向預(yù)先加入抗體CD13-FITC、CD29-APC、CD44-PE、CD90-FITC、CD14-APC、CD19-APC、CD 34-PE、CD 45-FITC、CD73-PE、CD105-PercP、CD166-PE、HLA-DR-APC、HLAABC-FITC的Falcon管各加100μl細(xì)胞懸液，以大鼠IgG1-FITC、IgG1-APC、IgG1-PE、IgG1-PercP為陰性對(duì)照。避光孵育20m in，PBS洗滌2次，重懸后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用CellQuest Pro對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.5 u JZSCs細(xì)胞存活率測(cè)定 取第3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，0.1%胰酶消化，采集細(xì)胞，制成1×106/m l單細(xì)胞懸液，重懸，加7-AAD染色，渦旋震蕩均勻，避光15m in，PBS洗滌2次后，4℃避光保存，立即用流式細(xì)胞儀(型號(hào)為BD FACS Calibu r)進(jìn)行檢測(cè)。采用CellQuest Pro對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.6 u JZSCs細(xì)胞周期測(cè)定 取第3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，0.1%胰酶消化后采集細(xì)胞，制成1×106/m l的單細(xì)胞懸液，向Falcon管中加入－20℃預(yù)冷的75%乙醇2m l，再迅速加入100μl細(xì)胞懸液，渦旋震蕩均勻，－20℃放置3h。將固定好的細(xì)胞1500r/m in離心5m in，棄上清；渦旋震蕩均勻，加入RNaseA(20m g/m l)10μl，37℃水浴30m in；水浴后將樣品置于4℃冰箱10m in終止酶反應(yīng)；加入5μl的碘化丙啶(PI)溶液，4℃避光孵育30m in；渦旋震蕩均勻，離心，4℃避光保存，3h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。采用CellQuest Pro對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.7 u JZSCs生長曲線測(cè)定 將第3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以1×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔，分別于第1～8天同一時(shí)間加入10μl CCK-8，孵育2h后用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，在450nm條件下檢測(cè)吸光度(A)值，并繪制生長曲線。

1.8 u JZSCs誘導(dǎo)分化能力鑒定 成脂分化：將P5代細(xì)胞按照2.1×106/cm2密度接種，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全融合后更換成脂分化完全培養(yǎng)基A，72h后更換成脂分化誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基B，如此循環(huán)3～5次后，用成脂分化誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基B繼續(xù)維持7d，每3d換液1次；分化誘導(dǎo)完成后固定，油紅O染色，光鏡下觀察并拍照。

成骨分化：將P5代細(xì)胞按照3.1×103/cm2密度接種，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，直至間質(zhì)干細(xì)胞達(dá)到50%～70%融合，然后更換成成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，每3d換液1次；分化誘導(dǎo)完成后固定，茜素紅染色，光鏡下觀察并拍照。

成軟骨誘導(dǎo)分化：將P5代細(xì)胞按照5×105/m l密度加入成軟骨分化培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吸取10μl滴到6孔板上，放置24h后加入新鮮的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，21d后用阿利信藍(lán)染色，光鏡下觀察并拍照。1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 u JZSCs的形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 原代細(xì)胞接種后第3天半量換液，可見少量貼壁細(xì)胞；于第7天全量換液，此后細(xì)胞迅速貼壁，細(xì)胞集落明顯增大、增多，接種后第10～14天細(xì)胞達(dá)80%～90%融合。傳代后細(xì)胞3～6h貼壁，細(xì)胞融合并呈長梭形，漩渦狀生長，3～4d后細(xì)胞傳代(圖1)。

2.2 u JZSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物分析 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，第3代u JZSCs表面標(biāo)志物CD90、CD73、CD105、CD29、CD44、CD13、CD166、HLA-ABC的表達(dá)呈陽性，而造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45、CD14、HLA-DR、CD19呈陰性表達(dá)(圖2)。

2.3 u JZSCs細(xì)胞存活率分析 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，u JZSCs細(xì)胞存活率(94.32%±0.96%)較高，細(xì)胞生長狀態(tài)好，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)(圖3)。

圖1 u JZSCs的P0(A、B)和P3(C、D)代細(xì)胞(×100)Fig.1 u JZSCs at passage 0 (A and B) and passage 3 (C and D) (×100)

圖2 u JZSCs表面標(biāo)志物表達(dá)Fig.2 Exp ression of cell su rfactan ts in cu ltu red u JZSCs (Flow cytom etry)

圖3 u JZSCs細(xì)胞活率檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Cell viab ility of cu ltu red EnMSCs (Flow cytom etry)A. Ce ll d istribu tion; B. Histog ram of ce ll viab ility; C. Scatterp lo t of ce ll viab ility

2.4 u JZSCs細(xì)胞周期分析 采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各周期細(xì)胞的百分比，結(jié)果顯示處于DNA合成期的細(xì)胞比例較高(G2+S期為30.3%)，u JZSCs的增殖能力相對(duì)較強(qiáng)(圖4)。

2.5 u JZSCs細(xì)胞的生長曲線 細(xì)胞傳代后，增殖曲線呈S型，1～3d生長速度較慢，屬于潛伏期，4～6d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，于7～9d進(jìn)入平臺(tái)期，此時(shí)細(xì)胞已達(dá)到90%～95%融合(圖5)。

圖4 u JZSCs細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Cell cycle analysis of u JZSCs (Flow cytom etry)

圖5 u JZSCs細(xì)胞生長曲線Fig.5 The grow th curve of u JZSCs in p resent experim ent

2.6 u JZSCs成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化結(jié)果成脂分化：u JZSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化21d后，油紅O染色倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞質(zhì)中充滿紅色的油滴(圖6A)。成骨分化：u JZSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化21d后，采用茜素紅進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)染色，可見致密生長的細(xì)胞中散在出現(xiàn)大小不一的橘紅色礦化結(jié)節(jié)(圖6B)。成軟骨分化：u JZSCs經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)分化21d后，采用阿利辛藍(lán)對(duì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行染色，可見大小不一的藍(lán)色結(jié)節(jié)(圖6C)。

3 討 論

圖6 光鏡下觀察u JZSCs的誘導(dǎo)分化(×100)Fig.6 Induced d ifferen tiations of u JZSCs (×100)A. Ad ipogenic (Oil red O); B. Osteogenic (Alizarin red); C. Chond rogen ic (Alcian b lue)

骨髓是基礎(chǔ)研究和臨床治療所用MSCs的主要來源之一，但是獲取骨髓MSCs是有創(chuàng)的，且所獲細(xì)胞數(shù)量非常有限[13-15]。因此，人們一直在從更方便獲得和更優(yōu)質(zhì)兩方面努力尋找替代骨髓MSCs的新來源[16]。目前已從一些廢棄的組織，例如脂肪、乳牙、胎盤和臍帶中發(fā)現(xiàn)了M SCs[17]，但是這些MSCs是否可應(yīng)用于臨床治療，以及如何從這些新來源中選出更優(yōu)質(zhì)的MSCs仍有待探索。

本實(shí)驗(yàn)的取材主要是子宮肌層的內(nèi)1/3，即子宮結(jié)合帶，又稱黏膜下肌層[18]，其平滑肌束與內(nèi)膜基底層平行走行。核磁共振上顯示的子宮結(jié)合帶是分辨清晰的低信號(hào)帶影像，與結(jié)合帶內(nèi)側(cè)的內(nèi)膜高信號(hào)影像和結(jié)合帶外側(cè)的子宮外肌層中等信號(hào)影像界限清楚[19]。雖然子宮內(nèi)膜MSCs具有高度增殖能力及自我更新分化潛能[20]，且近年來因子宮肌瘤、宮頸癌、卵巢癌等婦科疾病切除子宮的患者也逐漸增多，但是從子宮內(nèi)膜基底層獲得的細(xì)胞仍很有限，且子宮內(nèi)膜與外界相通，容易發(fā)生污染，尤其是對(duì)于陰道炎和宮頸HPV感染的患者，而子宮結(jié)合帶部分占子宮組織的1/3，是充足的組織來源，可以獲得足夠用于干細(xì)胞治療的細(xì)胞數(shù)量且不易發(fā)生污染。

本研究結(jié)果顯示，u JZSCs呈梭形、放射狀生長，貼壁能力強(qiáng)，MSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)多數(shù)在90%以上，成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化能力強(qiáng)，從而證實(shí)從子宮結(jié)合帶分離出來的細(xì)胞為MSCs，符合國際鑒定MSCs的標(biāo)準(zhǔn)[1]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活率數(shù)據(jù)穩(wěn)定，以細(xì)胞的流速評(píng)價(jià)細(xì)胞數(shù)量，聯(lián)合使用區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞的染料，可用于細(xì)胞存活率的測(cè)定[21]。從本研究結(jié)果來看，細(xì)胞成活率很高，為94.32%±0.96%，比較容易適應(yīng)環(huán)境；從細(xì)胞周期結(jié)果來看，處于G2+S期的細(xì)胞百分比高，具有較強(qiáng)的增殖能力，在培養(yǎng)過程中，死亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片少，是干細(xì)胞治療較為理想的來源。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，可成功從子宮結(jié)合帶中分離出u JZSCs，且該干細(xì)胞表達(dá)典型的MSCs表面抗原，具有較強(qiáng)的增殖能力以成脂、成骨、成軟骨分化特性。此外，u JZSCs還具有組織充足，易分離，不易污染等優(yōu)勢(shì)。對(duì)于u JZSCs的研究，目前尚處于起步階段，相關(guān)研究仍有待進(jìn)一步深入。

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