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    硫代乙酸/DNA修飾金電極的電化學(xué)行為研究

    2015-03-02 02:37:52環(huán)
    甘肅農(nóng)業(yè)科技 2015年9期

    張 環(huán)

    (甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所,甘肅 蘭州 730070)

    硫代乙酸/DNA修飾金電極的電化學(xué)行為研究

    張環(huán)

    (甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所,甘肅蘭州730070)

    摘要:采用循環(huán)伏安法,在K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液體系中,分別對裸金電極,硫代乙酸自組裝單分子膜(Self-assembled monolayers:SAMs)修飾的金電極、二次自組裝技術(shù)制備的Au/硫醇/DNA混合雙層膜(Hybrid Bilayer Membranes,HBMs)修飾的金電極的電化學(xué)行為進行了表征。結(jié)果表明,硫代乙酸自組裝單分子膜使DNA和可能與DNA相互作用的生物物質(zhì)避免了與金電極表面的直接接觸,從而防止可能發(fā)生的變性。利用自組裝單分子膜對電極的封閉作用,可以消除由吸附產(chǎn)生的對金屬電極的毒化。

    關(guān)鍵詞:自組裝單分子膜;硫代乙酸;DNA;修飾電極;循環(huán)伏安法

    SAMs作為制備超薄有序膜的一種新技術(shù),為研究表面和界面現(xiàn)象提供了分子水平上精確控制界面性質(zhì)的理想方法,從而迅速成為有關(guān)學(xué)科研究的焦點[1-5]。利用SAMs膜技術(shù)已成功地研制了一類優(yōu)良的化學(xué)修飾電極。該類型的SAMs包括有機硅烷在羥基化表面(SiO2/Si、Al2O3/Al、玻璃等);醇和胺在鉑表面,硫醇、二硫化物和硫化物在金、銀、銅表面;脂肪酸在金屬氧化物表面;膦酸在金屬磷酸鹽表面及異腈在鉑表面。近年來,有關(guān)硫化物在金表面形成單分子層的報道日益增多,將硫醇自組裝到金電極表面形成的單分子層膜因具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和有序性,而受到人們越來越多的關(guān)注[6],然而,對自組裝單分子層研究最廣泛并且最深入的是烷基硫醇類物質(zhì)在Au表面的自組裝。目前,利用自組裝單分子膜技術(shù)在分子水平上按人們預(yù)期的目標進行設(shè)計SAMs被廣泛研究[3,5],而通過巰基(—SH)在Au表面自組裝制備DNA修飾電極的方法尚未見報道。筆者采用先進的—SH化合物自組裝,得到自組裝單分子層(SAM)后,對其進行電化學(xué)測試,再在SAM上共價鍵合或吸附固定DNA的方法制備DNA修飾電極,并對得到的DNA修飾電極進行電化學(xué)表征,以期為基因傳感器、DNA與其他分子的相互作用、以及DNA識別分析提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1儀器與試劑

    1.1.1儀器電化學(xué)系統(tǒng)CH-Instruments work station660(美國CH公司)電極系統(tǒng)為傳統(tǒng)三電極系統(tǒng),鉑絲電極為對電極,飽和甘汞電極(SCE)為參比電極,工作電極為膜修飾的金電極)。Branson 200超聲清洗儀(美國),PHS3C型酸度計(上海)。

    1.1.2試劑硫代乙酸(CH3COSH,分析純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限責任公司生產(chǎn));小牛胸腺DNA(北京華美生物工程公司生產(chǎn));雙蒸水;電解質(zhì)[5 mmol/L的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液];丙酮(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限責任公司生產(chǎn));Tris(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限責任公司生產(chǎn));無水乙醇(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限責任公司生產(chǎn))。0.5 mol/L Tris溶液配制:先準確稱取3.028 5 g Tris,用雙蒸水定容至50 mL,用pH酸度計將pH調(diào)至5,使Tris溶液濃度為0.5 mol/L。

    1.2方法

    1.2.1金電極的預(yù)處理封裝金電極(D=3 mm純度大于99.99%)。首先將金電極分別用0.3 μm 和0.05 μm的Al2O3仔細拋光,分別在丙酮,乙醇和二次水中超聲波清洗,每次5 min,再用N2干燥,在-0.2~0.8 V范圍內(nèi)作循環(huán)伏安掃描,檢測電極是否達到實驗要求。支持電解質(zhì)溶液為:K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6(5 mmol/L)溶液體系,要求其氧化還原峰電位差ΔEp<75Mv。

    1.2.2硫醇自組膜的制備配制5 mmol/L硫代乙酸溶液,將處理好的金電極從無水乙醇中取出并置于裝有半瓶5 mmol/L硫代乙酸溶液的青霉素瓶中,蓋好塞子,并用膠帶纏好進行自組裝一定時間,通常不少于24 h[7]。金電極在5 mmol/L硫代乙酸/丙酮溶液中浸泡24 h,取出,用水沖洗后,即得到硫代乙酸自組裝單分子層修飾電極(SAM/Au),再依次用無水乙醇、二次蒸餾水沖洗,以除去表面物理吸附的分子,然后用高純N2吹干表面溶劑,立即進行電化學(xué)測試。測試溶液中含有相同濃度的Fe(CN)3-和Fe(CN)4-,測試前溶液通高純N2以除去溶解氧。

    1.2.3DNA修飾電極的制備取50 mL 0.5 mol/L Tris溶液配置成DNA的Tris溶液,然后將硫代乙酸自組裝單分子膜(SAMs)修飾后的金電極放入配置好的DNA的Tris溶液中靜置24 h。然后取出用水沖洗后即得到含有Au/硫醇/DNA雙層膜(Hybrid Bilayer Membranes,HBMs)的硫代乙酸自組裝層膜修飾電極(DNA/SAM/Au),再依次用無水乙醇、雙蒸水沖洗,以除去表面物理吸附的分子,然后用高純N2吹干表面溶劑,立即進行電化學(xué)測試。測試溶液中含有相同濃度的Fe(CN)63-和Fe(CN)64-,測試前溶液通高純N2以除去溶解氧。

    2 結(jié)果與分析

    2.1裸金電極電化學(xué)行為表征

    Fe(CN)63-和Fe(CN)64-與DNA具有很強的相互作用。以此為指示劑來表征DNA修飾電極,結(jié)果表明,裸金電極在5 mmol/L的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液中表現(xiàn)出可逆的電化學(xué)行為(圖1 a),其反應(yīng)由Fe(CN)63-/ Fe(CN)64-的擴散所控制,循環(huán)伏安曲線呈現(xiàn)一對可逆的氧化還原峰,當金被自組裝膜修飾后,在-0.2~0.8 V的掃描范圍內(nèi)Fe(CN)63-/Fe(CN)64-的氧化還原峰完全消失,并呈現(xiàn)倒“S”形的極化曲線。

    2.2硫代乙酸自組裝單分子膜修飾的金電極電化學(xué)行為表征

    (a,裸金電極;b,巰基乙酸修飾電極;c,DNA修飾電極。)圖1 DNA修飾電極在5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液中的循環(huán)伏安

    硫代乙酸自組裝單分子膜修飾的金電極在5mmol/L的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液中還原峰與氧化峰的差值明顯降低,表現(xiàn)出可逆的電化學(xué)行為(圖1 b),其反應(yīng)由Fe(CN)63-/Fe(CN)64-的擴散所控制。結(jié)果表明,硫醇自組裝膜對界面電子轉(zhuǎn)移有強烈的阻礙作用,當電極表面修飾自組裝膜后,F(xiàn)e(CN)63-/Fe(CN)64-溶液中的循環(huán)伏安行為則由可逆變成了循環(huán)伏安曲線上的氧化峰與還原峰之間的間距減小,峰變平緩,電極反應(yīng)的可逆性變差。

    2.3Au/硫代乙酸/DNA混合雙層膜修飾的金電極電化學(xué)行為表征

    Au/硫代乙酸/DNA混合雙層膜修飾的金電極在5 mmol/L的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液中的電化學(xué)行為,其反應(yīng)仍由Fe(CN)63-/Fe(CN)64-的擴散所控制(圖1)。結(jié)果表明,相比較硫代乙酸自組裝單分子膜修飾的金電極曲線b而言,圖象沒有太大的變化,但當電位為0.3~0.8 V時,峰電流還是有所降低;-0.2~0.3 V時,峰電流有所升高;0.8 V時,電流與硫代乙酸自組裝單分子膜修飾的金電極時的相同;0.3 V時,氧化還原峰電流達到一致;-0.2 V時,電流值增大到40 μA,電極反應(yīng)的可逆性相比裸金電極明顯變差。

    3 小結(jié)與討論

    1)應(yīng)用循環(huán)伏安法研究了硫代乙酸SAM修飾金電極,并利用二次自組裝技術(shù)制備了Au/硫醇/DNA混合雙層膜(HBMs)的金電極在含F(xiàn)e(CN)63-/ Fe(CN)64-溶液中的電化學(xué)行為,并對其進行了表征。結(jié)果表明,硫代乙酸自組裝單分子膜使DNA和可能與DNA相互作用的生物物質(zhì)避免了與金電極表面的直接接觸,從而防止可能發(fā)生的變性,同時利用自組裝單分子膜對電極的封閉作用,可以消除由吸附產(chǎn)生的對金屬電極的毒化。無“針孔”缺陷的SAM修飾電極在Fe(CN)63-/Fe(CN)64-溶液中表現(xiàn)出倒“S”形的極化曲線,還原峰與氧化峰差值較大;硫代乙酸自組裝單分子膜修飾的金電極在Fe(CN)63-/Fe(CN)64-溶液中,曲線平緩,還原峰與氧化峰差值小,電極反應(yīng)的可逆性變差,這種現(xiàn)象可能與自組裝膜自身的膜電阻有關(guān)。

    2)由于膜電阻的存在,使測得的電極電位包括了在膜上的電位降。當膜的電阻足夠大時,幾乎所有的電位降都集中在膜上,這時所表現(xiàn)出來的CV行為將主要反映膜的電阻隨電位變化特性[8]。Au /硫代乙酸/ DNA混合雙層膜修飾的金電極在Fe(CN)63-/Fe(CN)64-溶液中曲線平緩,與硫代乙酸自組裝單分子膜修飾的金電極相比,圖象沒有太大的變化,但峰電流有所降低。這可能是因為由于SAM的結(jié)構(gòu)特點,使其為DNA的固定提供了一個穩(wěn)定、均一、反應(yīng)位點多的理想表面,并可根據(jù)不同的需要,提供不同官能團的表面,SAM 使DNA和可能與DNA相互作用的生物物質(zhì)避免與電極表面的直接接觸,從而可以防止可能發(fā)生的變性。同時利用SAM對電極的封閉作用,可以消除由吸附產(chǎn)生的對金屬電極的毒化。采用在金表面先修飾硫代乙酸SAM,再自組裝Au/硫醇/DNA混合雙層膜(HBMs)是可靠和較理想的DNA修飾電極的制備方法,制備的DNA修飾電極將在電化學(xué)基因傳感器和DNA與其他分子的相互作用研究等方面有應(yīng)用價值。

    參考文獻:

    [1]H W GAO,P QIN,C LIN,et al. Electrochemical DNA biosensor for the detection of listeria monocytogenes using to luidine blue as a hybridization indicator[J]. Journal of the Iranian Chemical Society,2010,7(1):119-127.

    [2]KUI JIAO,TAO YANG,JIE YANG,et al. Immobilization and hybridization of DNA based on magnesium ion modified 2,6-pyridinedicarboxylic acid polymer and its application for label-free PAT gene fragment detection by electrochemical impedance spectroscopy[J]. Science in China Series B(Chemistry),2007,50(4):538-546.

    [3]HASHIMOTO K ITO K,ISHIMORI Y. Sequence-specific gene detection with a gold electrode modified with DNA probes and an electrochemically active dye[J]. Anal. Chem.,1994,66:3 830.

    [4]PANG D W,ABRUA H D. Micromethod for the investigation of the interactions between DNA and redox active molecules[J]. Anal. Chem.,1998,70(3):162-164.

    [5]KELLEY S O,BARTON J K,JACKSON N M,et al. Electrochemistry of methylene blue bound to a DNA modified electrode[J]. Bioconjugate Chem.,1997,8 (1):32-35.

    [6]汪海燕,楊繩巖,王世君.界面可控硫醇SAMs納米金修飾金電極的電化學(xué)行為研究[J].分析測試學(xué)報,2012,31(7):868-872.

    [7]李俊新,崔曉麗,童汝亭.金上硫醇自組裝膜研究進展[J].河北師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2000,26 (2):233-236.

    [8]崔曉麗,蔣殿錄,李俊新,等.硫醇在金電極上的SA單分子層膜的電化學(xué)研究[J].高等學(xué)?;瘜W(xué)學(xué)報,1999,20(5):800-802.

    (本文責編:楊杰)

    作者簡介:張環(huán)(1979—),女,甘肅會寧人,實驗師,主要從事分析化學(xué)及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測研究工作。聯(lián)系電話:(0)13919859386。E-mail:bxy0516@sina.com。

    收稿日期:2015-05-27;

    修訂日期:2015-06-11

    doi:10.3969/j.issn.1001-1463.2015.09.008

    中圖分類號:O657.1

    文獻標識碼:A

    文章編號:1001-1463(2015)09-0021-03

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