中國(guó)南北方食管癌患者中p53基因外顯子突變譜的差異研究

洪　強(qiáng)　譚家駒　姚維深　羅學(xué)平　周國(guó)華　謝敬廉　莫春生

作者單位：528200 廣東省佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院胸外科(洪　強(qiáng)，姚維深，羅學(xué)平，周國(guó)華，謝敬廉，莫春生)；528000 廣東省佛山市第一人民醫(yī)院胸外科(譚家駒)

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中國(guó)南北方食管癌患者中p53基因外顯子突變譜的差異研究

洪強(qiáng)譚家駒姚維深羅學(xué)平周國(guó)華謝敬廉莫春生

作者單位：528200 廣東省佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院胸外科(洪強(qiáng)，姚維深，羅學(xué)平，周國(guó)華，謝敬廉，莫春生)；528000 廣東省佛山市第一人民醫(yī)院胸外科(譚家駒)

【摘要】目的探討南北方食管癌患者中抑癌基因p53全部編碼外顯子基因突變譜的差異。方法各選取揭陽(yáng)居民食管癌患者42例，佛山患者52例，常規(guī)提取DNA，PCR擴(kuò)增p53第2-11外顯子全部編碼區(qū)和附近的一部分非編碼區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物用DHPLC進(jìn)行突變的篩查。篩查出的突變樣本進(jìn)行DNA純化測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行p53突變位點(diǎn)的比對(duì)和定位。結(jié)果高、低發(fā)區(qū)組中p53至少有1個(gè)外顯子基因突變的突變率分別為63.8%(28/42)和61.5%(32/52)，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.607>0.05)； p53有2個(gè)外顯子基因突變的突變率分別為14.3%(6/42)和15.4%(8/52)，兩者比較差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.881>0.05)。結(jié)論高低發(fā)區(qū)間可能具有相似的環(huán)境致癌物質(zhì)，通過(guò)相同的p53基因突變機(jī)制導(dǎo)致了兩地食管癌的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】食管癌；變性高效液相色譜；基因突變

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0039～0042)

食管癌發(fā)病率具有明顯的地理分布特征。氮循環(huán)病因假說(shuō)是現(xiàn)有多種食管癌的病因假說(shuō)之一，氮循環(huán)中的硝酸鹽、亞硝酸鹽；胺類、酰胺類。這兩類前體物進(jìn)入人體，合成亞硝酰胺及亞硝胺，引發(fā)肝癌、胃癌、食管癌[1]。p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因[2-4]，p53是致癌劑作用的靶基因之一，細(xì)胞暴露于不同的致癌劑時(shí)，常表現(xiàn)為不同的突變譜。本研究分析南方食管癌高低發(fā)區(qū)居民食管癌患者p53基因全部編碼外顯子基因突變譜的情況，比較兩者p53基因突變的差異，進(jìn)一步探索食管癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)變化，為兩者間是否存在相同或機(jī)似的環(huán)境致癌因素提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象

南方高發(fā)區(qū)組42例中男性32例，女性10例，年齡46～70歲，中位年齡59歲，來(lái)源于高發(fā)地區(qū)揭陽(yáng)市人民醫(yī)院的食管癌手術(shù)標(biāo)本。佛山低發(fā)區(qū)組52例中，男性45例，女性7例，年齡44～78歲，中位年齡61歲，來(lái)源于低發(fā)區(qū)佛山市第一人民醫(yī)院胸外科的食管癌手術(shù)標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放療和化療，手術(shù)標(biāo)本離體后迅速沿切緣到腫瘤方向從癌腫中間切分成兩半，每半包括癌組織、癌旁組織、手術(shù)切緣組織三個(gè)部分，將一半凍存于液氮中然后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱保存，另一半用10%福爾馬林液固定后送作病理診斷。所選標(biāo)本切除后病理檢查證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌，癌旁組織均超過(guò)癌腫邊緣3 cm。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA提取從-80℃冰箱中取出組織，切取食管癌組織25～30 mg，用TIANGEN組織基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段PCR反應(yīng)引物根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13]，并在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。擴(kuò)增的7個(gè)片段包括了p53外顯子、外顯子和內(nèi)含子交界區(qū)的非編碼序列。

1.2.3DHPLC檢測(cè)基因突變PCR產(chǎn)物不作任何純化處理，直接用于DHPLC分析。

1.2.4有突變峰型樣本DNA片段進(jìn)行基因測(cè)序經(jīng)DHPLC篩選出來(lái)的有突變峰型樣本DNA，在相同條件下PCR擴(kuò)增50 μl產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行DNA的純化測(cè)序。相同的突變峰型只選取一個(gè)樣本DNA進(jìn)行測(cè)序。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，記數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。取雙側(cè)P，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)N≥40，1≤T<5時(shí)，用連續(xù)性校正χ2值。N<40或有T<1時(shí)，用四格表的確切概率法。

2結(jié)果

將658份PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC的篩查，如DHPLC峰型圖譜顯示為單峰，則表示被檢測(cè)樣品沒(méi)有發(fā)生突變；如DHPLC峰型圖譜顯示為雙峰或多峰，則表示該檢測(cè)樣品有基因異常；如果被檢測(cè)樣品間的異常DHPLC 峰型圖譜相同，則表示這些被檢測(cè)樣品之間有相同的基因突變類型。

2.1高、低發(fā)區(qū)p53基因突變的發(fā)生與食管癌生物學(xué)行為的關(guān)系

兩組標(biāo)本的p53 基因突變與患者性別、年齡及癌腫部位無(wú)明顯的相關(guān)性(P>0.05)，與腫瘤組織分化、臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也無(wú)明顯的相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 高、低發(fā)區(qū)p53基因突變率的比較

高、低發(fā)區(qū)p53基因PCR產(chǎn)物突變率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.816>0.05)，見(jiàn)表2。

高低發(fā)區(qū)患者基因突變率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.065，P=0.607>0.05)，見(jiàn)表3。

表2　南方高低發(fā)區(qū)PCR產(chǎn)物突變情況比較/例

表3　南方高低發(fā)區(qū)患者基因突變情況比較/例

2.3突變基因測(cè)序結(jié)果

將DHPLC篩查出的有突變峰型病例的相應(yīng)外顯子在相同條件下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增出產(chǎn)物50 μL送廣州景瑞生物科技有限公司進(jìn)行純化測(cè)序。同一外顯子不同病例間有相同突變峰型的，只選取一個(gè)病例的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化測(cè)序，共36個(gè)樣品測(cè)序。

在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站，查找到p53基因全序列(U94788)及p53的密碼子序列(CCDS11118.1)，并在NCBI網(wǎng)站將各個(gè)樣本的測(cè)序結(jié)果與p53基因全序列及CDS序列分別進(jìn)行比對(duì)。在高發(fā)區(qū)居民的p53外顯子突變譜中，共有14種突變類型，共計(jì)41個(gè)突變位點(diǎn)，其中最多的突變類型是插入堿基C，共10例；其次為C→T轉(zhuǎn)換，共5例，G→T、T→G轉(zhuǎn)換均為4例。編碼區(qū)的突變類型有9種，14例，主要以G→T、T→C、G→A轉(zhuǎn)換為主，共計(jì)8例，占編碼區(qū)的突變類型的57.1%。在低發(fā)區(qū)居民的p53外顯子突變譜中，共有10種突變類型，共計(jì)35個(gè)突變位點(diǎn)，其中最多的突變類型是C→T、T→G轉(zhuǎn)換，各6例；其次為G→C、G→T、G→A轉(zhuǎn)換，各4例。編碼區(qū)的突變類型有6種，14例，主要以G→T、G→A、C→A轉(zhuǎn)換為主，共計(jì)10例，占編碼區(qū)的突變類型71.4%。

3討論

食管癌發(fā)病率在不同地理區(qū)域內(nèi)有巨大的差異，說(shuō)明特定的環(huán)境因素對(duì)其發(fā)生起著重要作用。p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，在環(huán)境致癌物質(zhì)誘發(fā)腫瘤的過(guò)程中，p53是最常受累的靶基因之一[2-4]，它的突變與人類50%的腫瘤發(fā)生有關(guān)[5]。

研究表明，p53基因突變?cè)谀戏礁叩桶l(fā)區(qū)居民食管癌發(fā)生發(fā)展中是一個(gè)發(fā)生頻率很高的事件，高發(fā)區(qū)組和低發(fā)區(qū)組患者都有p53的突變，p53突變?cè)趦山M患者中的頻率沒(méi)有明顯差別。楊勝利等用同樣的方法發(fā)現(xiàn)林州居民食管癌中p53突變率為68.3%[6]，與本實(shí)驗(yàn)相似，這些提示了高低發(fā)區(qū)間可能有共同的致p53突變因素在起作用，高、低發(fā)區(qū)間食管癌的發(fā)生可能具有共同的發(fā)病機(jī)制。食管癌臨床病理分期Ⅰ+Ⅱ和Ⅲ+Ⅳ在高發(fā)區(qū)和低發(fā)區(qū)中p53陽(yáng)性率相似，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p53基因突變有可能成為預(yù)測(cè)食管癌變危險(xiǎn)性的生物標(biāo)志，而且在食管癌的發(fā)展過(guò)程中并未見(jiàn)到p53突變率的顯著增高，這說(shuō)明在食管癌的進(jìn)程中可能還有其他基因的參與，這與Christian BJ等的結(jié)果是一致的[7-8]。

p53是致癌劑作用的靶基因之一，細(xì)胞暴露于不同的致癌劑時(shí)，常表現(xiàn)為不同的突變譜，SHIGEKO S等對(duì)中國(guó)河北省的高低發(fā)區(qū)p53不同突變類型進(jìn)行了比較，無(wú)論是高發(fā)區(qū)還是低發(fā)區(qū)，點(diǎn)突變都是最常見(jiàn)的，分別占86.8%和66.7%[9]。甲基芐基亞硝胺(NMBzA)誘發(fā)的人胎兒食管癌，NMBzA處理人胎兒食管上皮和NMBzA灌胃猴的食管上皮中發(fā)現(xiàn)有Rb、p53、APC和MCC的缺失和突變[10-11]。NMBzA處理的人胎兒食管上皮與猴食管上皮組織中，p53基因突變的指紋均能在人原發(fā)性食管癌中找到，在人原發(fā)性食管癌40.9%(9/22)的p53突變與NMBzA誘發(fā)的p53突變有相同指紋譜，大部分是G→T、G→A轉(zhuǎn)換[12]。用N-戊基-N-甲基亞硝基胺(AMN) 處理后的人食管正常組織標(biāo)本中，42.19 %(6/14) 檢測(cè)出p53 基因突變，其中主要的突變亦為G→A轉(zhuǎn)換[13]。本研究發(fā)現(xiàn)在高低發(fā)區(qū)居民的p53 外顯子突變以點(diǎn)突變?yōu)橹?。提示了南方高、低發(fā)區(qū)和上述其他地區(qū)的食管癌可能具有相同的環(huán)境致癌因素及發(fā)病機(jī)制，其癌變可能都經(jīng)歷了p53基因突變的過(guò)程。機(jī)體的遺傳物質(zhì)在環(huán)境致癌物N-亞硝基化合物的作用下發(fā)生遺傳學(xué)變異，這在高、低發(fā)區(qū)食管癌的發(fā)生過(guò)程中可能起著重要的作用。

引起我們注意的是，為什么發(fā)病率差異明顯的高、低發(fā)區(qū)食管癌標(biāo)本的p53基因突變率會(huì)無(wú)差異呢？既然高、低發(fā)區(qū)間食管癌的環(huán)境致癌物及發(fā)病機(jī)制相同，又是什么因素導(dǎo)致兩地間的食管癌發(fā)病率相差數(shù)十倍呢？“氮循環(huán)”病因假說(shuō)[1]提出了有效污染濃度與有效污染比率的概念，解釋了上述現(xiàn)象：當(dāng)人體接觸的環(huán)境致癌物N-亞硝基化合物及其兩類前體物達(dá)到有效致癌劑量時(shí)便可得癌，而有效污染比例的大小則決定了癌變?nèi)巳旱亩嗌俣纬筛?、低發(fā)區(qū)。

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(編輯：吳小紅)

Comparative Study on the Mutation Spectrum of p53 Coding Exons in Esophageal

Carcinomas in Southern and Northern China by DHPLC

HONGQiang，TANJiaju，YAOWeishen，etal.NanhaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity，F(xiàn)oshan，528200

【Abstract】ObjectiveTo compare the mutation spectrum of p53 coding exons in esophageal carcinomas in southern and northern China by denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC).Methods42 and 52 cases of esophageal carcinomas were respectively collected from the high and low risk areas in southern China.The 2-11 coding exons of p53 (including all coding area and part of non-coding area) were amplifyied by PCR after DNA routine extraction.DHPLC was processesd for mutation screening of the products after PCR.Then those with mutations were purified and sequenced of their DNAs.The results were compared with the sequence of wild p53 on NCBI website.The locations of the mutations were confirmed.Information was obtained of the p53 mutations spectrum in the patients from the high and low risk areas.ResultsIn the high risk area group，28 specimens were found with at least 1 coding exon mutations，the p53 mutation rate was 63.8%(28/42)；In the low risk area group，32 pecimens were found with at least 1 coding exon mutations，the p53 mutation rate was 61.5%(32/52)，the difference had no statistic significance between the 2 groups(P=0.881>0.05).ConclusionLow and high risk areas may have a similar range of environmental carcinogens，through the same mechanism of p53 gene mutation leads to the occurrence of esophageal cancer.

【Key words】Esophageal Carcinoma；Denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC)；Gene mutation

(收稿日期2014-04-29修回日期 2014-09-30)

中圖分類號(hào)：R735.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2015)01-0039-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.011