雌孕激素對人上皮性卵巢癌裸鼠模型卵巢組織中Bcl-2 表達的影響

王　藝　帥經(jīng)緯　李隆玉　羅海蓮

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雌孕激素對人上皮性卵巢癌裸鼠模型卵巢組織中Bcl-2 表達的影響

王藝帥經(jīng)緯李隆玉羅海蓮

【摘要】目的探討雌孕激素對人上皮性卵巢癌裸鼠模型卵巢組織中Bcl-2 表達的影響。方法建立人上皮性卵巢癌裸鼠模型,裸鼠隨機分為3組：雌激素組(A 組)10只、雌孕激素聯(lián)合組(B 組)10只、對照組(C組)10只；分別肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.06 ml、苯甲酸雌二醇注射液0.06 ml聯(lián)合黃體酮注射液0.06 ml、滅菌油劑0.06 ml，每3天給藥，3周后處死裸鼠,剝?nèi)∧[瘤。應用免疫組織化學法檢測Bcl-2 在3組中的表達情況。結果Bcl-2 在3組中陽性表達比較無顯著性差異(P>0.05)。結論雌孕激素對人上皮性卵巢癌裸鼠模型卵巢組織中Bcl-2表達無影響。

【關鍵詞】人上皮性卵巢癌；雌激素；孕激素；Bcl-2蛋白

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0010～0012)

上皮性卵巢癌死亡率居婦科腫瘤首位,此類患者日趨年輕且治療后的圍絕經(jīng)期癥狀嚴重影響其生活質(zhì)量。激素替代治療能明顯改善圍絕經(jīng)期綜合征，但存在的問題是使用激素是否會增加卵巢癌復發(fā)、轉移的風險尚不明確。國內(nèi)外大量研究表明，抗凋亡因子 Bcl-2 基因的表達異常與多種惡性腫瘤，特別是雌激素相關惡性腫瘤包括乳腺癌及子宮內(nèi)膜癌預后密切相關，并可作為此類腫瘤患者病情監(jiān)測、決定預后的獨立因素。本文建立人上皮性卵巢癌裸鼠模型,通過對人上皮性卵巢癌裸鼠模型使用激素與未使用激素的比較，明確雌孕激素的干預是否會改變?nèi)松掀ば月殉舶┞闶竽Ｐ吐殉步M織中Bcl-2的表達。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物BALB/Cnu-nu 小鼠,SPF 級,由國家噬齒類種子中心中國藥品生物制品檢驗所實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(京) 2005-004。實驗動物飼養(yǎng)在江西省藥物研究所IVC 籠具內(nèi),使用許可證SYXK(贛) 2008-0005。雌性,鼠齡8～10 周齡,體重18～22 g,SPF 級。飼料由江西省飼料生產(chǎn)基地提供,飼料、飲水、墊料均經(jīng)高壓蒸汽滅菌121 ℃,20 min,取出墊料再放入電熱鼓風干燥箱干燥后使用。水和飼料自由飲食。按江西省實驗動物倫理委員會批準的方案進行實驗。

1.1.2實驗藥物與試劑苯甲酸雌二醇注射液、黃體酮注射液、兔抗鼠 Bcl-2 多克隆抗體購自天津市顴洋生物制品科技有限責任公司(美國 Santa Cruz公司產(chǎn)品)；過氧化物酶標記的免疫組化(streptavidin-veroxidase，Sp)染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物模型的構建將人卵巢癌實體瘤皮下移植裸鼠成功的實體瘤剪碎后，通過裸小鼠背部將瘤塊置于裸小鼠卵巢上。實現(xiàn)實體瘤原位移植裸鼠模型的建立。重復上述手術,進行實體瘤傳代。得到穩(wěn)定的人卵巢癌實體瘤原位移植裸鼠模型。取8～10周齡裸鼠30只，進行接種，速眠新合劑按0.5 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，將已穩(wěn)定傳代的人卵巢癌實體瘤原位移植裸鼠處死、剝離皮下腫瘤，選擇生長良好、無壞死、呈淡黃色、魚肉狀瘤組織，剪成1～2 mm大小的組織塊，消毒已麻醉裸鼠右肩胛部皮膚，剪一長約5 mm小口，由破口處在皮下分離出一小腔隙，用眼科鑷將腫瘤組織塊送入腔隙內(nèi)，縫合，再次消毒，放回IVC 籠具內(nèi)。接種腫瘤后的裸鼠一周后隨機分為3組：雌激素組(A組)10只，雌孕激素聯(lián)合組(B組)10只、對照組(C組)10只；分別肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.06 ml、苯甲酸雌二醇注射液0.06 ml、聯(lián)合黃體酮注射液0.06 ml，滅菌油劑0.06 ml，每3天給藥。

1.2.2Bcl-2 表達檢測方法標本用 10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片，采用免疫組織化學 SP 法，嚴格按試劑盒說明書進行操作。檢測 Bcl-2 在裸鼠模型腫瘤組織中的表達，用已知陽性切片作為陽性對照。用 PBS 代替一抗作為陰性對照，DAB 顯色，蘇木精復染，自來水反復沖洗，梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封片。

1.2.3結果判斷Bcl-2 陽性表達為棕黃色顆粒，主要分布于細胞質(zhì)。根據(jù)每張切片的陽性細胞比例及著色深淺計分，兩者乘積為最后結果。參照免疫組織化學免疫反應評分(immunoreactive scroe，IRS)推薦標準，結合染色強度進行評定：基本不著色為 0 分；淺黃色為 1 分；棕黃色為 2 分；棕褐色為 3 分；著色細胞占計數(shù)細胞百分率≤5%為 0 分，6%～25%為 1 分，26%～50%為 2 分，51%～75%為 3 分，>75%為 4 分。上述兩項乘積為最后得分：0分為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+)，4～6分為陽性(++)，7～9 分為強陽性(+++)。

1.3統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)應用SPSS 13.0軟件處理，Bcl-2表達采用多樣本率的卡方檢驗進行統(tǒng)計學處理。

2結果

隨機選取5 個視野(×200),應用OLympusCX41生物顯微圖像分析系統(tǒng)，對Bcl-2基因表達進行分析,以平均灰度值表示,平均灰度值大(染色強度弱、透光度強)，Bcl-2蛋白表達減弱,反之則表達增強。3組Bcl-2蛋白表達情況比較無顯著性差異,χ2=1.586，P=0.56，見表1。

表1　3組Bcl-2表達情況比較/例

注：A組和B組分別有1只、2只裸鼠腫瘤組織壞死、脫落、中途死亡；χ2=1.586,P=0.56。

3討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中死亡率最高的腫瘤，其中上皮性卵巢癌是最常見的卵巢惡性腫瘤，約占90%，平均5年生存率為30%～40%[1-2]。上皮性卵巢癌患者除了忍受各種治療所帶來的痛苦外，還要經(jīng)歷接受治療后因雌激素降低所引起的圍絕經(jīng)期不適，如潮熱多汗、煩躁失眠等。如何提高此類患者治療后的生存質(zhì)量問題日益受到重視。激素替代治療(HRT) 應運而生，對這些患者實施HRT，可以緩解其生理和心理不適，提高其生活質(zhì)量。但存在的問題是使用激素是否會增加卵巢癌復發(fā)、轉移的風險尚不明確，其安全性問題一直受到關注。且多數(shù)婦科惡性腫瘤，如子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等的發(fā)生發(fā)展與雌激素密切相關，因此，HRT[3-6]是否會增加腫瘤的復發(fā)和患者的病死率，一直是婦科腫瘤醫(yī)生顧慮和擔心的問題。

雌激素致腫瘤作用的確切機制目前尚不清楚，揭示雌激素介導的腫瘤發(fā)生途徑，有助于從根本上解決雌激素的潛在致癌作用。國內(nèi)外大量研究表明[7-9]，抗凋亡因子 Bcl-2 基因的表達異常與多種惡性腫瘤，特別是雌激素相關惡性腫瘤包括乳腺癌及子宮內(nèi)膜癌預后密切相關，并可作為此類腫瘤患者病情監(jiān)測、決定預后的獨立因素。Bcl-2 作為1種重要的凋亡調(diào)控基因，不僅能夠抑制細胞凋亡，延長細胞壽命，而且參與細胞增生的調(diào)控，它可以調(diào)控細胞由G0期向S期轉換的時間。Bcl-2在腫瘤的形成及腫瘤多藥耐藥的形成中也起著重要的作用，因此通過對 Bcl-2 基因不斷深入的研究，可為腫瘤治療提供新的思路和啟示。

本實驗進行了Bcl-2的半定量研究，與對照組比較，苯甲酸雌二醇注射液組和苯甲酸雌二醇注射液聯(lián)合黃體酮注射液組Bcl-2基因在腫瘤組織中的表達無顯著性差異。我們的研究結果表明，雌孕激素對人上皮性卵巢癌裸鼠模型卵巢組織中Bcl-2的表達無影響。

此為動物實驗，人和動物有物種差別，藥物在鼠體內(nèi)的代謝和人可能存在一定差異，但移植瘤是人上皮性卵巢癌，其結果接近人體情況[10]，本研究從基因學水平這個層次，為雌孕激素在卵巢癌患者中應用提供了研究基礎，在基因學上無影響，生物學上有無影響，目前還沒研究，但需進行大樣本前瞻性臨床研究才能最后證實雌孕激素聯(lián)合應用在卵巢癌患者中的安全性。

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(編輯：吳小紅)

The Effects of Estrogen and Progesterone on Expression of Bcl-2 in Ovarian Tissue of Human Epithelial Ovarian Cancer Nude Mouse Model

WANGYi,SHUAIJingwei,LILongyu,etal.DepartmentofOncology，JiangxiMaternityandChildHealthCareHospital,Nanchang,330006

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of estrogen and progesterone on Bcl-2 expression in ovarian tissue of human epithelial ovarian cancer nude mouse model.MethodsHuman epithelial ovarian cancer nude mouse model were set up,and mice were randomly divided into 3 groups:the estrogen group (group A) 10 rats,estrogen and progestin combination group (group B) 10 rats，the control group (group C) 10 rats；they received intramuscular injections of estradiol benzoate 0.06 ml,0.06 ml estradiol benzoate injection combined with progesterone injection 0.06 ml,sterilization oil 0.06 ml,respectively,administered every 3 days,the mice were killed after 3 weeks,and tumors were stripped.Immunohistochemistry was used to detect expression of Bcl-2 in the 3 groups.ResultsBcl-2 expression in the 3 groups has no significant difference (P> 0.05).ConclusionEstrogen and progesterone had no effect on the expression of Bcl-2 in ovarian tissue of human epithelial ovarian cancer nude mouse model.

【Key words】Human epithelial ovarian cancer；Estrogen；Progesterone；Bcl-2 protein

(收稿日期2014-03-14修回日期 2014-06-01)

中圖分類號：R737.31

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2015)01-0010-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.003

通訊作者：李隆玉

基金項目：江西省自然科學基金項目(編號：20114BAB205013)
作者單位:330006 江西省婦幼保健院