羅格列酮逆轉(zhuǎn)絲裂霉素對人胃癌SGC7901/VCR祼鼠移植瘤耐藥作用的研究

廖文秋　張　琍　李國慶　劉小葉

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羅格列酮逆轉(zhuǎn)絲裂霉素對人胃癌SGC7901/VCR祼鼠移植瘤耐藥作用的研究

廖文秋張琍李國慶劉小葉

【摘要】目的探討PPARγ激動劑羅格列酮(ROS)逆轉(zhuǎn)人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞裸鼠移植瘤對絲裂霉素(MMC)的耐藥作用及其可能機(jī)制。方法建立人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，將48只裸鼠隨機(jī)分為6組：空白對照組(生理鹽水0.2 ml)、MMC組(MMC 2.5 mg/kg)、ROS組(ROS 100 mg/kg)、MMC+ROS中劑量組(MMC 2.5 mg/kg+ROS 50 mg/kg)、MMC+ROS高劑量組(MMC 2.5 mg/kg+ROS 100 mg/kg)、MMC+CSA組(MMC 2.5 mg/ kg+CSA 50 mg/kg)。每組8只裸鼠；用藥40天后，觀察各組裸鼠體重和移植瘤體積變化，計算抑瘤率，繪制移植瘤的生長曲線；Western-blot法檢測P-gp和MGr1-Ag蛋白的表達(dá)。結(jié)果空白對照組、MMC組移植瘤瘤體積和抑瘤率差異無顯著性，ROS組、MMC+ROS中劑量組、MMC+ROS高劑量組組、MMC+CSA組與空白對照組、MMC組比較，移植瘤瘤體積和抑瘤率差異有顯著性?？瞻讓φ战M、MMC組中P-gp、MGr1-Ag蛋白表達(dá)最強(qiáng)，ROS組、MMC+ROS中劑量組、MMC+ROS大劑量組、MMC+CSA組與空白對照組和MMC組P-gp、MGr1-Ag蛋白表達(dá)比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，MMC+ROS大劑量組、MMC+CSA組中其表達(dá)最弱，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論羅格列酮可抑制人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞祼鼠移植瘤瘤體生長，羅格列酮可下調(diào)人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中P-gp和MGr1-Ag蛋白的表達(dá)。羅格列酮可部分逆轉(zhuǎn)人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞祼鼠移植瘤對絲裂霉素的耐藥性。

【關(guān)鍵詞】羅格列酮；多藥耐藥；移植瘤；P-gp蛋白；MGr1-Ag蛋白

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0006～0009)

腫瘤的多藥耐藥性(multidrugresistance，MDR)是腫瘤化療失敗的重要原因。P糖蛋白(P-glycolprotein，P-gp)的過度表達(dá)是MDR產(chǎn)生的主要原因[1]，MGr1-Ag是近發(fā)現(xiàn)一個新的耐藥相關(guān)分子[2]。尋找能有效逆轉(zhuǎn)MDR的逆轉(zhuǎn)劑是當(dāng)前腫瘤化療亟待解決的難題。羅格列酮是過氧化物酶體增殖因子活化受體(peroxisome proliferateration-activated receptor gamma，PPARγ)激動劑，調(diào)控細(xì)胞周期、抑制炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡等作用[3]。近年來發(fā)現(xiàn)羅格列酮還能逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥[4-5]。目前這些研究大部分在體外。本研究旨在模擬人體內(nèi)腫瘤生長環(huán)境，探討羅格列酮逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用及其機(jī)制，為臨床羅格列酮治療多藥耐藥腫瘤患者提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株和動物人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR購自中南大學(xué)腫瘤研究所；6~8周齡雄性BABL/c小鼠，48只、A級，許可證號：SCXK(滬)2012-0005(上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)。

1.1.2主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基購于Gibco BRL公司；長春新堿為深圳萬樂有限公司生產(chǎn)；羅格列酮購于武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司；絲裂霉素購于浙江海正藥業(yè)股份有限公司。P-gp抗體購于美國Santa Cruz公司；Anti—MGr1-Ag/37LRP購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)SGC7901/VCR細(xì)胞置于含1 mg/L長春新堿(VCR)的10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)維持耐藥，置于37℃、95%飽和濕度、含5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每1～2天換一次液，于細(xì)胞80%匯合時，用0.25%的胰酶細(xì)胞消化液消化，1∶2或1∶3傳代一次。實驗前2周撤除VCR。

1.2.2動物實驗將人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞收集后接種于裸鼠背部皮下，觀察移植后裸鼠的成瘤情況，術(shù)后兩周將48只成瘤裸鼠隨機(jī)分為6組：空白對照組(生理鹽水0.2 ml灌胃)、MMC組(MMC 2.5 mg/ kg腹腔注射)、ROS組(ROS 100 mg/ kg灌胃)、MMC+ROS中劑量組(MMC 2.5 mg/ kg腹腔注射+ROS 50 mg/ kg灌胃)、MMC+ROS高劑量組(MMC 2.5 mg/ kg腹腔注射+ROS 100 mg/ kg灌胃)、MMC+CSA組(MMC 2.5 mg/ kg腹腔注射+CSA 50 mg/ kg灌胃)。每組8只裸鼠；待移植瘤體積長至約100 mm3時開始分別給每組裸鼠灌胃給藥(均為1次/2天)，每5天分別測量每只裸鼠移植瘤的體積，40天后處死動物，計算抑瘤率，并據(jù)此繪制移植瘤的生長曲線。腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2；抑瘤率=(對照組腫瘤體積-實驗組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%。

1.2.3Western蛋白印跡檢測裸鼠移植瘤中P-gp和MGr1-Ag蛋白表達(dá)取80 mg移植瘤組織，加入1 ml Trizol和0.5 μl PMSF，用研磨器反復(fù)研磨，離心后上清液即用于測定總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)的濃度，微量加樣器吸取煮好的蛋白(25 μl)上樣，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，TBST洗膜，每次15 min，共3次，加入一抗工作液 (兔抗人P-gp1∶400、兔抗人Anti--MGr1-Ag/37 LRP 1∶400)，4℃孵育過夜。次日TBST洗膜，每次15 min，共3次，加二抗HRP標(biāo)記IgG(山羊抗兔1∶6 000)；室溫孵育60 min，用TBST洗膜，每次15 min，共3次。然后加入化學(xué)發(fā)光劑，再放入暗盒并壓片，顯影、定影。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值，以目的條帶與內(nèi)參照條帶比值代表蛋白表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1各組裸鼠移植瘤體積變化(表1)

與空白對照組比較，MMC組移植瘤體積差異無顯著性(P>0.05)。ROS組、MMC+ROS中劑量組、MMC+ROS高劑量組及MMC+CSA組與空白對照組和MMC組比較，移植瘤體積均明顯縮小(P均<0.05)，其中以MMC+ROS高劑量組、MMC+CSA組的體積縮小最明顯。由表1及圖1可看出，絲裂霉素對移植瘤生長無明顯抑制作用(P>0.05)，羅格列酮或絲裂霉素聯(lián)合羅格列酮或環(huán)孢霉素A對移植瘤生長有抑制作用(P<0.05)，MMC+ROS高劑量組和MMC+CSA組的抑制作用最強(qiáng)，羅格列酮抑制移植瘤的作用呈劑量依賴關(guān)系。

2.2Western蛋白印跡檢測裸鼠移植瘤中P-gp和MGr1-Ag蛋白表達(dá)

各組裸鼠移植瘤P-gp/β-actin值分別為(0.83±0.02)、(0.82±0.02)、(0.78±0.03)、(0.69±0.03)、(0.63±0.05)、(0.60±0.03)。各組裸鼠移植瘤MGr1-Ag/β-actin值分別為(1.04±0.04)、(1.02±0.04)、(0.97±0.04)、(0.92±0.03)、(0.86±0.03)、(0.83±0.03)。P-gp和MGr1-Ag蛋白表達(dá)以空白對照組最高，MMC組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，ROS組、MMC+ROS中劑量組、MMC+ROS高劑量組、MMC+CSA組與空白對照組和MMC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；MMC+ROS高劑量組、MMC+CSA組P-gp和MGr1-Ag蛋白表達(dá)最低，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

表1　各組移植瘤體積及抑瘤率情況±s)

注：a為P>0.05，與空白對照組比較；b為P<0.05，與空白對照組、MMC組比較；c為P<0.05，與ROS組比較；d為P<0.05，與MMC+ROS中劑量組比較；e為P>0.05，與MMC+ROS高劑量組比較。

A組為空白對照組；B組為MMC組；C組為ROS組；D組為MMC+ROS中劑量組；E組為MMC+ROS高劑量組；F組為 MMC+CSA組。

圖1各組移植瘤生長曲線圖

3討論

腫瘤多藥耐藥的機(jī)制是多因素、多途徑綜合作用的結(jié)果，MDR 形成的機(jī)制異常復(fù)雜，研究表明由MDR1編碼的P-gp的過度表達(dá)所介導(dǎo)的耐藥是經(jīng)典的耐藥途徑[4]。近年研究[6]表明，MDR1/P-gp 高表達(dá)和凋亡抑制是化療藥物誘發(fā)腫瘤細(xì)胞MDR的主要機(jī)制。P-gp是1種跨膜糖蛋白，由1 280個氨基酸殘基組成，分子量為170 kD，是一個能量依賴性的藥物排出泵，通過ATP水解供能，逆濃度梯度將藥物泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低而產(chǎn)生耐藥。樊代明等[2，7]在胃癌細(xì)胞多藥耐藥性研究中，發(fā)現(xiàn)一個新的耐藥相關(guān)分子MGr1-Ag。MGr1-Ag是1種表觀分子量約為42 kD，等電點約為4.8，抗原表位由氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，單克隆抗體MGr1-Ag能部分逆轉(zhuǎn)SGC7910/VCR細(xì)胞對ADM、VCR、5-Fu的耐藥性，明顯增加SGC7901/VCR細(xì)胞對ADM的蓄積和潴留。Sun等[8]發(fā)現(xiàn)MGr1-Ag可通過上調(diào)MRP，下調(diào)凋亡相關(guān)基因bcl、bax的表達(dá)，從而減少胞內(nèi)藥物蓄積，抑制藥物誘導(dǎo)的凋亡作用。Liu 等[9]發(fā)現(xiàn)MGr1-Ag 基因所編碼的氨基酸序列與人37 kD 層粘連蛋白受體前體蛋白(37LRP)的氨基酸序列完全相同。缺氧誘導(dǎo)的胃癌耐藥與上調(diào)MGr1-Ag的表達(dá)有關(guān)，抑制HIF-1的表達(dá)能夠明顯抑制缺氧誘導(dǎo)的MGr1-Ag的mRNA和蛋白水平。

1為空白對照組；2為MMC組；3為ROS組；4為MMC+ROS中劑量組；5為MMC+ROS高劑量組；6為MMC+CSA組。

圖2Western blot檢測結(jié)果

已有研究證實環(huán)孢霉素及其衍生物在體內(nèi)體外能逆轉(zhuǎn)MDR作用[10]。目前多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑多存在體內(nèi)活性小，毒副作用大的缺點，理想的MDR 逆轉(zhuǎn)劑應(yīng)具有毒副作用低而本身有抗癌活性特點。羅格列酮是過氧化物酶體增殖因子活化受體(peroxisome proliferateration-activated receptor gamma，PPARγ)激動劑，有文獻(xiàn)[11]報道羅格列酮能抑制癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡的作用。文瀾等[12]研究說明羅格列酮能抑制腫瘤的生長轉(zhuǎn)移和血管發(fā)生，此外，羅格列酮可以通過下調(diào)某些腫瘤細(xì)胞P-gP蛋白的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)由MDR1所介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥[5]。這些研究提示羅格列酮有可能作為某些化療藥物的增敏劑而逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥。本實驗應(yīng)用羅格列酮聯(lián)合MMC對人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤模型進(jìn)行干預(yù)處理：發(fā)現(xiàn)空白對照組、MMC組腫瘤體積增長明顯，ROS組、ROS聯(lián)合MMC組及CSA聯(lián)合MMC組瘤體增長相對緩慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。通過Western blot檢測P-gp和MGr1-Ag蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ROS聯(lián)合MMC組和CSA聯(lián)合MMC組P-gp 和MGr1-Ag蛋白的表達(dá)明顯降低，與空白對照組、MMC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。推測ROS可能通過下調(diào)P-gp和MGr1-Ag蛋白的表達(dá)，減少了細(xì)胞膜上P-gp的數(shù)量，影響了其功能，阻止了藥物的外排，從而使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度得以提高，達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的藥物濃度，逆轉(zhuǎn)了腫瘤耐藥。

本組研究提示人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤對MMC耐藥，ROS和CSA能逆轉(zhuǎn)人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤對MMC耐藥性，可能為臨床逆轉(zhuǎn)胃癌化療耐藥提供新的途徑，我們認(rèn)為不良反應(yīng)較少的ROS對于逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥性具有重要意義，但ROS逆轉(zhuǎn)MDR調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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(編輯：吳小紅)

Research on Rosiglitazone Reversal Mitomycin C on Drug Resistance of Nude Mice

Xenografts of Human Gastric Cancer SGC7901/VCR Cells

LIAOWenqiu，ZHANGLi，LIGuoqing，etal.TheSecondAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina，Hengyang，421001

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of rosiglitazone(ROS)，a selective peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) ligand，reverses Mitomycin C resistance on nude mice xenografts of human gastric cancer SGC7901/VCR cells and its possible mechanism.MethodsThe model of xenografts tumor in nude mice were established by inoculating human gastric cancer SGC7901/VCR cells into the back of nude mice subcutaneously.48 male nude mice were divided into 6 groups：Control group，MMC group，ROS group，MMC combined moderate dose ROS group，MMC combined high dose ROS group，MMC combined cyclosporineA(CSA) group.There were 8 mice in each group.After treated for 40 days，the volumes changes of tumor and tumor inhibition rates were observed，draw the growth curve of xenograft tumor.The expression of P-glycolprotein(P-gp) and MGr1-Ag were observed with Western-blot assay respectively.ResultsAfter medication the effect on the volume of tumor and tumor inhibition rates：there was no significant difference between the control group and MMC group(P>0.05)，the difference of tumors volume and tumor inhibition rates were significant between other groups and the control group and MMC group (P<0.05).The expression of P-gp and MGr1-Ag was highest in the control group and MMC group，the difference of expression of P-gp and MGr1-Ag were significance between other groups and control group and MMC group (P<0.05).MMC combined high dose ROS group and MMC combined cyclosporineA(CSA) group were least，there was no significant difference between them(P>0.05).ConclusionRosiglitazone inhibits the growth of SGC7901/VCR cell and decreases the expression of P-gp and MGr1-Ag，Rosiglitazone reverses drug resistance of nude mice xenografts of human gastric cancer SGC7901/VCR cells partly on MMC.

【Key words】Rosiglitazone；Multidrug resistance；Xenograft；P-gp protein；MGr1-Ag protein

(收稿日期2014-03-25修回日期 2014-04-18)

中圖分類號：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-5930(2015)01-0006-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.002

通訊作者：張琍

基金項目：湖南省科技廳資金資助項目(編號：2009SK3138)；湖南省自然科學(xué)基金資助項目(編號：08JJ5002)；湖南省衛(wèi)生廳資助項目(編號：2007110)
作者單位：421001 南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院