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    DNA載體——聚DEAE葡聚糖和κ-卡拉膠微囊制備的可行性分析

    2015-03-02 01:19:50于滿昌,劉麗,金璐娟
    現代畜牧科技 2015年4期
    關鍵詞:卡拉膠微囊

    DNA載體——聚DEAE葡聚糖和κ-卡拉膠微囊制備的可行性分析

    于滿昌,劉麗,金璐娟,王東,孫英杰,黃小丹

    (黑龍江職業(yè)學院150111)

    摘要:DNA疫苗是一種或多種抗原編碼基因克隆到真核表達載體上,將構建的重組質粒直接注入到體內而激活機體免疫系統(tǒng),被稱為DNA免疫。研制高效的 DNA 疫苗載體,提高 DNA 疫苗轉染效率,降低給藥劑量是DNA 疫苗研究中亟需攻克的難題。本文對國內外相關研究分析得出聚DEAE-葡聚糖和κ-卡拉膠微囊作為DNA疫苗載體是可行的。

    關鍵詞:DNA載體;聚DEAE葡聚糖;κ-卡拉膠;微囊

    DNA疫苗的研究只是近十幾年發(fā)展起來的一項新的生物技術,已成為疫苗研究領域中的熱點之一,自上世紀90年代以來,DNA 疫苗因其良好的安全性及可誘導廣泛的體液免疫和細胞免疫,越來越受到人們的關注。美國FAD已批準乙肝疫苗等10余種DNA疫苗進入臨床試驗,這預示DNA疫苗在21世紀將成為人類和動物與各種疾病抗爭的有利武器,也顯示出DNA疫苗的巨大潛力和應用前景?,F已有馬西尼羅河病毒、鮭魚傳染性出血性壞死病毒、犬黑色素瘤等三種 DNA 疫苗獲準上市,DNA疫苗在傳染病及腫瘤性疾病防治等領域發(fā)揮重要作用。DNA 疫苗進入機體后,利用宿主細胞表達系統(tǒng)合成相應抗原蛋白,并誘導機體產生免疫應答。因此,無論是制備DNA疫苗,還是進行基因治療,都要求將DNA轉染到細胞中。但多數DNA疫苗是水溶液注射劑,通過肌肉注射方式給藥。一般情況下,裸DNA僅有0.1%~0.2% 被動物細胞吸收,絕大部分被核酸酶降解,并且裸DNA被肌細胞,特別是抗原提呈細胞攝取的效率極低,免疫效果很不理想。目前,研制高效的 DNA 疫苗載體,提高 DNA 疫苗轉染效率,降低給藥劑量是DNA 疫苗研究中亟需攻克的難題。

    DNA疫苗是一種或多種抗原編碼基因克隆到真核表達載體上,將構建的重組質粒直接注入到體內而激活機體免疫系統(tǒng),被稱為DNA免疫。DNA疫苗由抗原編碼基因及載體兩部分組成。DNA疫苗載體分為病毒和非病毒載體兩大類。病毒載體如痘病毒、棒狀病毒、α病毒、復制缺陷型腺病毒、皰疹病毒等,其優(yōu)點是轉染效率較高,但存在攜載外源DNA容量有限、制備過程復雜等缺點,特別是在安全性方面具有潛在危險限制了其應用。而非病毒載體主要包括脂質體、人工合成聚合物和天然高分子等,具有安全性高、容量大和易制備等優(yōu)點,但也存在生物相容性差、轉染效率低、細胞毒性等問題。用生物可降解控釋微囊作為基因疫苗載體,理論上可長時間保持表達基因的活性,從而減少基因疫苗的劑量。

    DNA以物理形式包埋在微球中,一方面聚合物與細胞作用可促進DNA轉染,另一方面,微囊能夠非特異性激活巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原提呈細胞,增加這些細胞對微囊的攝取量,提高轉運的靶向性和轉運效率,從而提高抗原表達水平,提高免疫效果[1]。DNA疫苗微囊的粒徑、疏水性、電荷性、降解特性等理化性質直接影響轉運效率和免疫效果。目前DNA疫苗微囊制備,主要采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、殼聚糖、海藻酸鈉等生物降解材料。PLGA生物相容性好,在體內最終降解為H2O和CO2。PLGA微球親水性和混懸性好,釋藥較快。但PLGA不溶于水,與水溶性的DNA疫苗大分子親和性差,因而微球制備中要用有機溶劑和高速剪切分散藥物,對藥物的穩(wěn)定性不利。海藻酸鈉為天然多糖類陰離子高分子材料,制備條件溫和,不需要有機溶劑,對DNA疫苗的穩(wěn)定性十分有利;海藻酸鈉微球的缺點是穩(wěn)定性不夠好,放置在磷酸鹽緩沖液中,可因鈉離子與鈣離子的交換致使微球破裂。殼聚糖為天然來源多糖類陽離子高分子材料,其優(yōu)點與海藻酸鈉相似;殼聚糖一般需要溶解于醋酸等弱酸溶液中,由于pH值較低,DNA疫苗容易在制備過程中降解。因而開發(fā)和采用水溶性好、轉染效率高、制備工藝穩(wěn)定、可與細胞相互作用的可降解聚合物作為微囊材料是十分必要的。

    噴霧干燥法、復乳-溶劑揮發(fā)法為制備DNA微球的常用方法,在制備過程中都需要超聲、高速攪拌等措施將DNA分散到有機溶液中,會造成一定程度DNA的降解。Briones等用嗅化十六烷基三甲銨等陽離子乳化劑溶液為分散介質,采用復乳-溶劑揮發(fā)法制備空白陽性微球,然后吸附DNA疫苗,制成載藥的陽性微球。這樣可以避免DNA疫苗在制備過程中的降解。表面吸附DNA疫苗的陽性微球仍具有一定的保護作用,并能延長基因表達、提高免疫效果,但是存在于微球表面DNA會在體內降解。因此,簡化制備DNA微囊工藝,且增加微囊內的DNA容量,也是DNA疫苗微囊制備的關鍵技術。CaCO3對DNA具有很好的吸附性,廣泛用于DNA的回收;而CaCO3微粒具有多孔、表面積大的特點,進一步提高對DNA的吸附性能,形成的均一的CaCO3-DNA微粒利于包被成微囊。

    在基因傳遞的各類聚合物中,多聚糖是被公認的最具潛力的DNA載體,具有天然、無毒、良好的生物降解性及生物相容性等特點。其中DEAE-葡聚糖促使哺乳動物細胞捕獲外源DNA已經被證實,其機理還不明確,有人認為DEAE-葡聚糖同DNA結合成復合物,可以保護DNA免受核酸酶的降解作用;還有人認為DEAE-葡聚糖可以同細胞膜發(fā)生作用,從而使DNA容易穿過細胞表面而進入細胞內。因而以DEAE-葡聚糖包被DNA,提高轉染效率是可行的。但是DEAE-葡聚糖如何在CaCO3-DNA微粒表面形成穩(wěn)定囊膜,目前還未見報道。

    有研究表明,在卡拉膠與葡聚糖具有表現出極好的相容性。在卡拉膠-葡聚糖混合體系中,葡聚糖的存在不妨礙卡拉膠有序結構的形成,反而增強了體系網絡結構的穩(wěn)定性[2]。葡聚糖由于其極細的粒度,高度的持水性與分散性,均勻填充至卡拉膠所成的有序網絡結構中,以弱作用力與構成網絡的卡拉膠分子鏈結合,維系了網絡結構。卡拉膠是一種硫酸半乳聚糖,體外實驗證明其對正常細胞無不良影響,具有廣譜抗被膜病毒(單純皰疹病毒、流感病毒、非洲豬瘟病毒、艾滋病病毒等)活性。有專家將硫酸化多糖-卡拉膠與人乳頭瘤病毒16(HPV-16)E7肽疫苗聯合,能產生抗原特異性反應和抗腫瘤效果,借助TLR4活化途徑,可見卡拉膠還具有一定的免疫刺激功能。

    終上所述,DEAE-葡聚糖和κ-卡拉膠作為DNA疫苗載體是可行的。

    參考文獻:

    [1] 宋健,陳磊,李效軍,等.微膠囊化技術及應用[M].北京:化學工業(yè)出版社,2004.

    [2] Van de velde F.,De Ruiter G A.,Polysaccharide II Polysaccharides from Eukaryotes[M]. Weinheim:Wiley-VCH. 2002.

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