氯化鋰調(diào)控人肺腺癌A549細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的體外研究

林高陽(yáng)，徐克

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肺部腫瘤外科，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300052）

論著

氯化鋰調(diào)控人肺腺癌A549細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的體外研究

林高陽(yáng)，徐克

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肺部腫瘤外科，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300052）

目的：探討氯化鋰對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及其調(diào)控機(jī)制。方法：應(yīng)用MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)活力和增殖的生物學(xué)特征變化；劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力；Western-blotting法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞GSK-3β、P-GSK-3β和β-catenin的表達(dá)水平變化。結(jié)果：MTT法顯示細(xì)胞分化增殖能力隨氯化鋰濃度的增加受到明顯抑制，具有濃度依賴性變化。同時(shí)，隨著檢測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)，在低濃度藥物作用下（<10mmol/L）細(xì)胞出現(xiàn)增殖增強(qiáng)現(xiàn)象，可能存在藥物時(shí)間耐受；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞增殖受到不同濃度氯化鋰的抑制，增殖能力的變化亦具有氯化鋰濃度依賴性；劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)：氯化鋰處理細(xì)胞后，細(xì)胞遷移、侵襲能力下降；Western-blotting法顯示：氯化鋰處理肺腺癌A549細(xì)胞后，GSK-3β總蛋白表達(dá)下降、P-GSK-3β表達(dá)增加，β-catenin總蛋白表達(dá)增多。結(jié)論：高濃度的氯化鋰能夠抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖和侵襲遷移，氯化鋰抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖和侵襲遷移可能是通過(guò)GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

肺腺癌；氯化鋰；遷移侵襲；GSK-3β/β-catenin通路

肺癌占全球惡性腫瘤發(fā)病率的12.7%，死亡率的18.2%，均高居首位[1]。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌是最常見(jiàn)類型，目前約占全部肺癌患者的80%，其中肺腺癌占50%，5年生存率約為15%。肺癌轉(zhuǎn)移是肺癌的惡性標(biāo)志和特征，也是肺癌病人治療失敗和死亡的主要原因，約80%～90%的肺癌病人死于轉(zhuǎn)移[2]。目前尚無(wú)有效抑制肺癌轉(zhuǎn)移的藥物。鋰是一種經(jīng)美國(guó)FDA（Food and Drug Administration）批準(zhǔn)首選用于治療雙相情感障礙性疾病的藥物，并已被安全用于臨床數(shù)十年[3]。研究顯示，精神障礙性病人中接受鋰治療的患者比未接受鋰治療者患癌風(fēng)險(xiǎn)明顯降低，患癌風(fēng)險(xiǎn)和鋰劑量間表現(xiàn)出一個(gè)顯著的反比關(guān)系[4]，鋰可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖分化[5]，被認(rèn)為是一種有效的抗癌劑，亦可作為放化療的輔助[6-7]。鋰（Li+）對(duì)人體具有廣泛的生物學(xué)活性，涉及胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和分化等。近來(lái)，其抗癌作用日益受到研究者的關(guān)注。GSK-3β（Glycogen synthase kinase-3β）是鋰作用的最常見(jiàn)的細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)之一[8]，如通過(guò)鋰抑制GSK-3β使前列腺癌和肝癌對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更加敏感[9-10]。最近研究發(fā)現(xiàn)Wnt/βcatenin信號(hào)通路的異常激活與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，然而氯化鋰靶向抑制GSK-3β，調(diào)控肺腺癌A549細(xì)胞增殖及侵襲遷移能力的研究尚罕見(jiàn)報(bào)道。本文就氯化鋰作用肺腺癌A549細(xì)胞進(jìn)行初步的功能研究，以期發(fā)現(xiàn)調(diào)控肺癌增殖及侵襲遷移的信號(hào)通路，為氯化鋰治療肺癌增殖及侵襲遷移奠定初步的研究基礎(chǔ)及探究方向。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection.ATCC，Manassas,VA,USA），A549細(xì)胞從液氮中取出復(fù)蘇后用含有10%胎牛血清（Gibco公司），1%丙酮酸鈉，1%谷氨酰胺，1%非必需氨基酸的RPMI-1640（Gibco公司）培養(yǎng)基在37℃、5%CO2濕度的孵箱中孵育培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞分化增殖能力測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺腺癌A549細(xì)胞株，按1×104個(gè)/孔細(xì)胞，培養(yǎng)液補(bǔ)足至200μL/孔，將細(xì)胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板孵育培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后用含有不同濃度的氯化鋰培養(yǎng)液置換96孔板中的培養(yǎng)液每孔200μL，并保證實(shí)驗(yàn)組終濃度分別達(dá)到0、5、10、25、50、80mmol/L，每個(gè)濃度分別設(shè)空白對(duì)照，每實(shí)驗(yàn)組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)37℃、5%CO2濕度下孵育培養(yǎng)24、48、72、96 h后加入MTT（噻唑藍(lán)）溶液（5mg/mL用PBS配制，PH=7.4）20μL/孔繼續(xù)孵箱內(nèi)孵育培養(yǎng)4 h，吸棄板孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO終止培養(yǎng)，避光平搖震蕩10～15min，使甲瓚結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞分化增殖活性：細(xì)胞分化增殖抑制率=（1-A490值/對(duì)照組A490值）×100%，以氯化鋰設(shè)置濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞分化增殖抑制率為縱坐標(biāo)做折線圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 肺腺癌A549細(xì)胞2 000個(gè)/孔接種于6孔板中，用含有10%胎牛血清、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸的RPMI-1640培養(yǎng)基配制不同終濃度（0、5、10、25、50、80 mmol/L）的含氯化鋰培養(yǎng)液在37℃、5%CO2濕度的孵箱中孵育培養(yǎng)120 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2遍，500μL/孔甲醇固定15min，棄固定液加入500μL結(jié)晶紫染色液室溫染色30min，吸棄染色液PBS沖洗3遍室溫干燥，倒置熒光顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%，以氯化鋰處理濃度為橫坐標(biāo)、克隆形成率為縱坐標(biāo)作柱狀圖。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肺腺癌A549接種于6孔板中，使次日細(xì)胞貼壁后融合密度達(dá)60%左右，用含有10%胎牛血清、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸的RPMI-1640培養(yǎng)基配制不同終濃度（0、5、10、25、50、80mmol/L）的含氯化鋰培養(yǎng)液在37℃、5%CO2濕度的孵箱中孵育培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，用1mL無(wú)菌Tip槍頭在6孔板中劃出一道清晰創(chuàng)痕，棄去培養(yǎng)液PBS輕輕沖洗，換入新培養(yǎng)液于倒置熒光顯微鏡（Nikon, Tokyo,Japan）4倍下選取同一位置分別于劃痕后0、24、48、72、96、120 h拍照，比較創(chuàng)痕變化檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。

1.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肺腺癌A549接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后配制含有不同濃度的氯化鋰培養(yǎng)液處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，無(wú)血清RPMI-1640以5∶1比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠，100μL/孔鋪入小室內(nèi)室底部，37℃孵箱內(nèi)放置30min～2 h，50μL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液水化基質(zhì)膠，吸棄用氯化鋰處理后6孔板中培養(yǎng)液，PBS清洗胰酶消化收集細(xì)胞沉淀,用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸使其成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)以2×104個(gè)/孔，200μL加入小室內(nèi)室，外室內(nèi)加入700μL含10%胎牛血清、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗外室，無(wú)菌棉簽擦拭內(nèi)室基質(zhì)膠和細(xì)胞，甲醇固定小室基底膜15 min，結(jié)晶紫染色30min，PBS清洗室溫干燥，倒置熒光顯微鏡下照相，選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)計(jì)算不同濃度氯化鋰處理后細(xì)胞侵襲的平均數(shù)，以氯化鋰處理濃度為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)作柱狀圖。

1.6 Western-blotting免疫印跡技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)變化 不同濃度氯化鋰處理后的肺腺癌A549細(xì)胞于48 h收集細(xì)胞總蛋白，蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4∶1比例混合，煮沸變性5～10min。電泳時(shí)樣品的加樣量為每孔20μL，彩虹預(yù)染Marker加樣量各為5μL，濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%，在Tris-glycine-SDS電泳緩沖液中以120 V電泳1 h；電泳完畢后用濕轉(zhuǎn)方法將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到NC膜；載有蛋白質(zhì)條帶的膜在含有5%脫脂奶粉的TBST-buffer中室溫封閉1 h，然后加入含有5%BSA-buffer稀釋一抗[抗GSK-3β1∶5 000、抗PGSK-3β（phosphorylation-GSK-3β）1∶1 500、抗βcatenin 1∶400，β-actin作為對(duì)照1∶5 000]，4℃下振蕩孵育過(guò)夜，TBST-buffer洗滌后（15min/次共3次），加入含1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)抗體反應(yīng)液（相應(yīng)蛋白的Ⅱ抗、5%脫脂奶粉稀釋），室溫中振蕩孵育1 h。洗滌后在膜上加ECL化學(xué)發(fā)光顯示液，室溫作用1min后于暗盒中曝光柯達(dá)膠片。圖片掃描結(jié)果應(yīng)用Photoshop作圖軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)氯化鋰處理A549細(xì)胞后細(xì)胞活力的變化 氯化鋰處理A549細(xì)胞24、48、72、96 h后，MTT檢測(cè)細(xì)胞活力顯示，A549細(xì)胞活力受到顯著抑制，且具有氯化鋰濃度依賴性變化和時(shí)間依賴性變化（圖1，表1）。隨著氯化鋰濃度增高，細(xì)胞成活率下降，對(duì)細(xì)胞抑制程度加強(qiáng)，但是在72 h低濃度氯化鋰（<10mmol/L）出現(xiàn)了促進(jìn)增殖的變化。

圖1 MTT檢測(cè)氯化鋰處理A549后不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力變化Fig 1 The cell proliferation ability of A549 determ ined by M TT assay after 24,48,72,96 h lithium chloride treatment

表1 時(shí)間和濃度變量條件下，氯化鋰處理A549細(xì)胞后吸光度值的變化（±s）Tab 1 Theabsorbance valueof A549 cellsafter variab le conditions (tim eand concentration)of lithium chloride treatm ent(±s)

表1 時(shí)間和濃度變量條件下，氯化鋰處理A549細(xì)胞后吸光度值的變化（±s）Tab 1 Theabsorbance valueof A549 cellsafter variab le conditions (tim eand concentration)of lithium chloride treatm ent(±s)

*同一時(shí)間點(diǎn)下與0mmol/L組比較，P<0.05

氯化鋰濃度0mmol/L 5mmol/L 10mmol/L 25mmol/L 50mmol/L 80mmol/L 24 h 1.382±0.222 1.316±0.316* 1.156±0.071* 1.186±0.059* 1.167±0.113* 0.979±0.104* 48 h 1.222±0.059 1.134±0.053* 1.113±0.019* 1.021±0.029* 0.956±0.091* 0.740±0.049* 72 h 1.187±0.130 1.245±0.091 1.228±0.121 0.545±0.434* 0.667±0.234* 0.784±0.139* 96 h 1.296±0.110 1.203±0.127* 1.106±0.089* 1.162±0.469* 0.737±0.208* 0.829±0.058*

2.2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分析氯化鋰處理A549細(xì)胞后增殖能力的變化 氯化鋰處理A549細(xì)胞120 h后，集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力顯示，隨著氯化鋰濃度逐漸增加，肺腺癌A549細(xì)胞增殖形態(tài)學(xué)和數(shù)量受到顯著抑制（圖2、3）。

圖2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氯化鋰處理A549細(xì)胞后120 h克隆形成率的變化Fig 2 Cloning efficiency of A549 determ ined by colony proliferation assay after 120 h lithium chloride treatment

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氯化鋰處理肺腺癌A549后細(xì)胞遷移能力的變化 氯化鋰處理A549細(xì)胞后，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力顯示，隨著氯化鋰濃度增加，處理時(shí)間延長(zhǎng)，肺腺癌A549細(xì)胞遷移能力減弱，創(chuàng)痕寬度與氯化鋰濃度之間存在正相關(guān)性，創(chuàng)痕寬度與氯化鋰處理時(shí)間之間存在負(fù)相關(guān)性（圖4）。

2.4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氯化鋰處理A549細(xì)胞后侵襲能力的變化 運(yùn)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氯化鋰處理肺腺癌A549細(xì)胞后48 h，腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，結(jié)果見(jiàn)圖5、6，氯化鋰處理肺腺癌A549細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移狀態(tài)受到明顯抑制，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)明顯降低，侵襲能力受到明顯抑制。

2.5 Western-blotting免疫印跡技術(shù)檢測(cè)氯化鋰處理細(xì)胞后蛋白水平變化 Western-blotting免疫印跡技術(shù)檢測(cè)顯示：氯化鋰處理肺腺癌A549細(xì)胞后，GSK-3β總蛋白表達(dá)下降、P-GSK-3β表達(dá)增加，βcatenin總蛋白表達(dá)增多（圖7）。

圖3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氯化鋰處理A549后120 h細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化Fig 3 M orphology of A549 determ ined by colony proliferation assay after 120 h lithium chloride treatment

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氯化鋰處理A549后細(xì)胞遷移能力的變化Fig 4 M igration capability of A549 dem onstrated by wound scratch assay after lithium chloride treatm ent

圖5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氯化鋰處理A549后48 h細(xì)胞侵襲和遷移狀態(tài)的變化（×100）Fig 5 Invasion and m igration status of A549 demonstrated by Transwellassay after 48 h lithium chloride treatment（×100）

細(xì)胞數(shù)：在圖5中，相同時(shí)間點(diǎn)不同濃度氯化鋰處理下，100X視野下選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)A549細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的平均數(shù)；*同一時(shí)間點(diǎn)下與0mmol/L組比，P<0.05

圖7 蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)氯化鋰處理細(xì)胞后48 h蛋白水平的變化Fig 7 The expression of GSK-3β/β-catenin pathway relative proteins detected by wastern blotting after 48 h lithium ch loride treatm ent

3 討論

目前肺癌的主要治療方法是外科手術(shù)治療、放療、化療和生物治療等。肺癌的治愈率僅為15%～17%左右。外科手術(shù)治療非小細(xì)胞肺癌的5年生存率為30%～40%，然而絕大多數(shù)患者就診時(shí)都已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。放療為一種局部治療，其療效是有限的，治療肺癌的5年生存率低于5%，同時(shí)亦有劑量限制性、毒性問(wèn)題?；熆捎糜趲缀跞糠伟┗颊?，因此抗腫瘤藥物治療成為中晚期肺癌患者的主要治療手段。肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者臨床治療失敗的重要原因。轉(zhuǎn)移傾向是一系列的生物學(xué)過(guò)程，是指能使腫瘤細(xì)胞從起源部位到達(dá)遠(yuǎn)處局部并形成新的轉(zhuǎn)移灶生長(zhǎng)的運(yùn)動(dòng)。它包括以下幾個(gè)步驟：侵襲周圍組織，侵入淋巴微脈管系統(tǒng)和血液系統(tǒng)，進(jìn)而轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處組織的微管系統(tǒng)繼續(xù)生長(zhǎng)，溢出血管到達(dá)遠(yuǎn)處組織的微環(huán)境內(nèi)生長(zhǎng)，最終適應(yīng)這些組織的促進(jìn)細(xì)胞增殖的異質(zhì)微環(huán)境，進(jìn)而最終形成繼發(fā)腫瘤[11]。然而，目前肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍然知之甚少，肺癌的轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多階段、多因素和多基因調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，因此控制肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是改善肺癌患者預(yù)后，提高患者生存率和生活質(zhì)量的最重要的措施。

WNT信號(hào)通路是胚胎形成和發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵因子，與多種腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系，是腫瘤學(xué)和再生醫(yī)學(xué)中藥物基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，WNT信號(hào)通路與腫瘤的關(guān)系已引起人們的關(guān)注，針對(duì)WNT信號(hào)通路不同基因靶點(diǎn)的高特異性基因藥物已被研發(fā)，腫瘤的分子診斷也相繼出現(xiàn)。目前，以WNT信號(hào)通路為靶點(diǎn)的腫瘤基因治療主要包括細(xì)胞膜水平、胞內(nèi)通路成員蛋白水平、βcatenin水平和核內(nèi)TCF/LEF-β-catenin復(fù)合體水平。糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是普遍存在于真核生物的一種多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括GSK-3α和GSK-3β，但目前對(duì)兩個(gè)亞型之間是否有不同作用研究較少。目前認(rèn)為GSK-3β參與并調(diào)控WNT/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路，是WNT/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵酶，它能夠有效的促進(jìn)APC蛋白、軸蛋白和β-catenin的磷酸化，最終使β-catenin泛素化而降解。Hiroyuki等[12]研究發(fā)現(xiàn)：GSK-3β參與非經(jīng)典的WNT5a信號(hào)通路，WNT5a可以引起多種腫瘤細(xì)胞的遷移，GSK-3β可以通過(guò)調(diào)節(jié)ROR2受體的水平影響WNT5a誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。Zhan等[13]研究表明氯化鋰是GSK-3β的高度選擇性抑制劑。Gould等[14]研究發(fā)現(xiàn)，氯化鋰可以通過(guò)抑制GSK-3β從而緩解腫瘤化療所引起的白細(xì)胞缺乏，同時(shí)又通過(guò)臨床試驗(yàn)證實(shí)氯化鋰不會(huì)促進(jìn)或影響腫瘤發(fā)生發(fā)展，但未對(duì)氯化鋰對(duì)腫瘤的治療作用做進(jìn)一步闡釋。Beurel等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，氯化鋰可以引起GSK-3β的磷酸化失活，進(jìn)而影響細(xì)胞膜上CD95的表達(dá)，并抑制依托泊苷、喜樹(shù)堿等化療藥物所引起的細(xì)胞凋亡。但氯化鋰對(duì)未經(jīng)化療腫瘤細(xì)胞的作用未見(jiàn)研究報(bào)道，尤其是對(duì)肺癌尚未見(jiàn)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)研究中我們進(jìn)一步驗(yàn)證氯化鋰靶向抑制GSK-3β的表達(dá)，使P-GSK-3β水平增加功能降低，可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。

本研究初步探究了氯化鋰在不同濃度下對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖作用的影響，初步得出氯化鋰對(duì)肺癌細(xì)胞增殖有一定的濃度依賴相關(guān)性，在低濃度（＜10mmol/L）時(shí)可見(jiàn)氯化鋰對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖作用的強(qiáng)化，可能是由于低劑量下隨時(shí)間的延長(zhǎng)藥物毒性作用弱化，細(xì)胞出現(xiàn)低劑量藥物耐受所致；較高濃度時(shí)不僅表現(xiàn)出了對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖抑制同時(shí)也表現(xiàn)出了對(duì)肺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)。通過(guò)劃痕和小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了氯化鋰對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的功能學(xué)表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)氯化鋰在一定濃度劑量下促進(jìn)增殖及抑制腫瘤細(xì)胞遷移侵襲的作用。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，氯化鋰作為高度特異的GSK-3β抑制劑及WNT/GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路在腫瘤研究中作用功能，通過(guò)Western-blotting法檢測(cè)了氯化鋰處理肺癌細(xì)胞后相關(guān)蛋白的變化，進(jìn)一步揭示了氯化鋰對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖和侵襲遷移的體外抑制作用的機(jī)制，初步探究了其在濃度依賴性條件變化下，不同時(shí)間點(diǎn)上發(fā)揮抑制增殖、侵襲轉(zhuǎn)移作用的分子生物學(xué)行為，為進(jìn)一步研究氯化鋰究竟能否成為將來(lái)臨床用于治療肺癌的藥物使用奠定了強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步解答其在較高濃度時(shí)發(fā)揮抑制腫瘤增殖、侵襲遷移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡以及對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響指出了一個(gè)方向。肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制究竟有多復(fù)雜？氯化鋰調(diào)控作用所經(jīng)的信號(hào)通路究竟是什么？氯化鋰作用肺癌細(xì)胞后所表現(xiàn)出來(lái)的一系列生物學(xué)行為如何做出生物信息學(xué)解釋還有待更加深入地研究。

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（2014-08-28收稿）

Investigation of the effect of lithium chloride on proliferation and metastasis potential of hum an lung adenocarcinoma A549 cells in vitro

LINGao-yang，XUKe
（Department of Lung Cancer Surgery，General Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin Lung Cancer Institute，Tianjin Key Laboratory of Lung CancerMetastasisand TumorMicroenvironment，Tianjin 300052，China）

Objective:To investigate themechanism of lithium chloride impacton proliferation and invasion abilitiesofhuman lung cancer cell A549.Methods:Cellgrowth and proliferationwere determined by MTTmethod and colony proliferation assay.Migration and invasion abilitiesofhuman lung cancer cellA549were detected bywound scratch assay and Transwellassay.The expression ofGSK-3β(Glycogen synthase kinase-3β),P-GSK-3β (Phosphorylation-GSK-3β)andβ-catenin ofhuman lung cancer cellA549were detected bywesternblotting.Results:The proliferation of A549 was significantly decreased after treated with lithium chloride indicating a lithium chloride concentration-dependentmanner.Meanwhile,with the extension of the detection time,enhanced cell proliferation phenomenon was observed at low concentrations(<10mmol/L)，indicatinga time-toleranceof the drug.The proliferation ofA549 could alsobe inhibited by lithium chloride with a dose-dependentmanner.Themigration and invasion capabilities of A549 decreased after treated with lithium chloride.And Itwas also found that the expression of GSK-3βwas decreased while the expression of P-GSK-3βandβ-catenin were increased after lithium chloride treatment.Conclusion:High concentration of lithium chloride could inhibitthe proliferation and invasion of A549,and thismaybeacheived by GSK-3β/β-catenin signalingpathway.

lungadenocarcinoma;lithium chloride;metastasis/invasion;GSK-3β/β-catenin signaling pathway

R734.2

A

1006-8147（2015）01-0009-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81372519，30873035）；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金，教育部博士點(diǎn)基金（20131202110 005）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（14JCZDJC33800,10JCZDJC20800）；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（ZD200714）

林高陽(yáng)（1988-），男，碩士在讀，研究方向：肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移；通信作者：徐克，E-mail:ke_xu@hotmail.com。