苦豆子不同提取部位抗HepG2活性的研究

文 / 蒲秀瑛，劉 璐，馬小龍，任菁， 李曉玥， 李海兵

(蘭州理工大學 生命科學與工程學院 甘肅省中藏藥篩選評價及深加工重點實驗室，甘肅 蘭州 730050）

苦豆子不同提取部位抗HepG2活性的研究

文 / 蒲秀瑛*，劉 璐2，馬小龍3，任菁4， 李曉玥5， 李海兵6

(蘭州理工大學 生命科學與工程學院 甘肅省中藏藥篩選評價及深加工重點實驗室，甘肅 蘭州 730050）

研究苦豆子不同提取部位對肝癌細胞HepG2的抑制作用。方法：根據(jù)溶劑極性的大小對苦豆子進行提取，以細胞存活率和IC50為指標，采用噻唑藍（MTT）比色法檢測苦豆子不同提取部位體外對肝癌細胞HepG2的抑制作用。結(jié)果：苦豆子的乙醇部位和正丁醇部位在實驗濃度范圍（0.125-1mg/mL）內(nèi)對HepG2細胞的抑制作用較強，其IC50分別是：0.21mg/ mL和0.92mg/mL，石油醚部位在實驗濃度范圍內(nèi)對HepG2細胞未顯示出抑制作用。結(jié)論：苦豆子乙醇部位和正丁醇部位對HepG2細胞有明顯的抑制作用。

苦豆子；不同提取部位；絲裂霉素；HepG2

長久以來癌癥是嚴重危害人類健康的疾病，雖然化療暫時控制腫瘤的生長，但是現(xiàn)有的化學藥物毒副作用較大，給患者造成了極大的痛苦。因此，急需找到抗腫瘤活性強、毒副作用又小的植物來源的藥物。

苦豆子是豆科槐屬植物，主要分布于我國西北省區(qū)及中亞細亞一帶[1，2]。國內(nèi)外對苦豆子的早期研究表明, 可藥用其根、莖、全草及種子, 味苦性寒, 有清熱解毒、祛風燥濕、殺蟲止痛等作用[3，4]。本通過對苦豆子不同提取部位的研究，篩選出對HepG2較為敏感的提取物，為后續(xù)研究苦豆子體內(nèi)外抗腫瘤作用提供科學依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 材料和試劑

苦豆子購于寧夏、人肝癌細胞HepG2（有蘭州理工大學實驗中心、蘆丁標準品購于甘肅省藥檢所。無水乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿、石油醚均為分析純。鹽酸、氫氧化鈉、碘-碘化鉍鉀試劑；1640培養(yǎng)基（GIBCO）；新生小牛血清（FCS，杭州四季清生物工程材料有限公司）、胰蛋白酶（Sigma公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，Merk）；絲裂霉素（浙江海正藥業(yè)）。

1.2 方法

1.2.1 苦豆子不同部位提取物的制備和黃酮類化合物含量的測定

稱取預(yù)處理后的苦豆子，按料液比1:10加入90%乙醇，在水浴中加熱回流2h，回流三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮，干燥，得乙醇提取部位。再將干燥的浸膏稱重平均分成三份，分別用石油醚、氯仿、正丁醇進行萃取，直至萃取層無色為止，合并各自萃取液，減壓濃縮，干燥，稱重。得到石油醚、氯仿、正丁醇三個部位的浸膏。分別計算其得率，并以蘆丁為標準品，采用紫外分光光度法測定其黃酮類化合物的含量[5]。

1.2.2 苦豆子不同提取部位體外抗腫瘤作用的研究

用無血清的1640培養(yǎng)基將以上提取物（總提取物、石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位）配制成2mg/mL溶液，用0.22μm濾膜濾過，除菌，用細胞維持液倍比稀釋成1mg/mL，0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.125mg/mL共4個稀釋度，同時設(shè)陰性對照組（相同密度的細胞培養(yǎng)液），陽性藥物對照組采用絲裂霉素，劑量的設(shè)置相同，每濃度設(shè)3個重復(fù)孔。

取對數(shù)生長期HepG2細胞，用1640培養(yǎng)基配成細胞濃度1×105/mL的懸液，在96孔培養(yǎng)板中加入細胞液100μL/孔（最外一圈加PBS），于孵箱中培養(yǎng)24h，使其貼壁生長。再加入不同劑量的以上各受試物100μL/孔，于孵箱中培養(yǎng)24h-48h后，每孔加入25μL MTT溶液（5mg/mL），再于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)上清培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO后于水平搖床上振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，于酶標儀測每孔吸光度，計算抑制率及IC50[6]。

抑制率=（A陰性對照孔-A加藥孔）/ A陰性對照孔*100%

2、結(jié)果與分析

以上各提取物（總提取物、石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位）中黃酮類化合物的含量分別為：4.81%、0.17%、0.59%和2.17%。從表1可以看出，乙醇和正丁醇部位對HepG2的生長顯示出較強的抑制作用，1mg/mL乙醇和正丁醇部位的抑制率可達50%以上，其IC50分別僅為0.21和0.92 mg/mL，而石油醚部位對HepG2的生長無任何影響。

表1 不同劑量的苦豆子不同提取部位對HepG2細胞的抑制率

3、討論與結(jié)論

本試驗對苦豆子的不同提取部位抗腫瘤作用進行了初步探究，結(jié)果表明：苦豆子抑制肝癌HepG2生長的最佳部位是乙醇和正丁醇部位，也正是黃酮類化合物主要集中的部位，其抑制率達到了56.47%和50.10%。

綜上所述，苦豆子不同提取部位對HepG2細胞有一定抑制作用，雖然抑制作用不如陽性藥物絲裂霉素，但本實驗只是對苦豆子抗腫瘤作用部位的初步篩選，具體的有效成分及藥理活性還有待進一步研究。

[1]楊家新, 喻志芳. 苦豆子的研究進展[J].天津藥學,1998,10(1):46.

[2]仲仁山.苦豆子的研究及其應(yīng)用[M].銀川: 寧夏人民出版社,19831.

[3]周福生, 穆青. 野生植物苦豆子的化學成分和主要藥理作用[J].中國野生植物資源,2006, 25(4):1.

[4]李艷艷, 馮俊濤. 苦豆子化學成分及其生物活性研究進展[J].西北農(nóng)業(yè)學報, 2005,14(2): 133- 136.

[5] 曹亞軍, 陳虹, 馬建慧, 等. 復(fù)方苦豆子顆粒中總黃酮成分的含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥, 2007,18(4):787-788. i

[6] 楊志偉, 曹秀琴等.苦豆子生物堿體外抗柯薩奇B3病毒的作用[J].四川中醫(yī), 2003.21(3) : 14-16..

Study on the antitumor activity of different extracted parts of Sophora Alopecuroides

Pu Xiuying*, Liu Lu2,Ma Xiaolong3, Ren Jing4, Li Xiaoyue5,Li Haibing6
(College of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology The Key Lab of Screening, Evaluation and Advanced Processing of TCM and Tibetan Medicine, Gansu Educational Department, Lanzhou 730050, China)

Objective: To investigate different extracted parts of sophora alopecuroides anti-HepG2 activity in vitro. Methods: The sophora alopecuroides were extracted by different polarity solvents. MTT assay was used to observe the inhibitory effect of different extracted parts of sophora alopecuroides on liver cancer cell HepG2 in vitro. Ethanol extraction and N-butyl alcohol extraction of sophora alopecuroides had the cell inhibition activity against HepG2 (0.125-1 mg/mL) ,the IC50 were 0.21 mg/mL and 0.92 mg/mL, petroleum ether extraction of sophora alopecuroides showed no inhibition on HepG2. Results: the sophora alopecuroides ethanol part and n-butanol part has the obvious inhibitory effect on HepG2 .

sophora alopecuroides; the different extracted parts; mitomycin; HepG2

國家自然科學基金項目（81260070）