馬鈴薯塊莖可溶性蛋白的SDS-PAGE分析

文 / 肖成斌，李云春，馬建忠，王永剛（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院）

馬鈴薯塊莖可溶性蛋白的SDS-PAGE分析

文 / 肖成斌，李云春，馬建忠，王永剛（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院）

提取馬鈴薯塊莖可溶性蛋白（22.82mg/g鮮重）進(jìn)行SDS-PAGE分析，馬鈴薯塊莖可溶性蛋白中豐度最高的蛋白質(zhì)可能是塊莖儲(chǔ)藏蛋白patatin。BandScan軟件掃描分析蛋白質(zhì)樣品的電泳結(jié)果時(shí)蛋白質(zhì)樣品最好梯度上樣，以此確保獲得相對(duì)豐度一致的條帶豐度掃描結(jié)果。

馬鈴薯塊莖 蛋白提取 SDS-PAGE BandScan

馬鈴薯(Solanum tuberosum L.) 是全球第三大重要的糧食作物，其年產(chǎn)量占全球塊莖作物總量的45%（位居第一）。馬鈴薯鮮塊莖含淀粉15%～25%，含蛋白質(zhì)約2%[1]。對(duì)馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)的研究遠(yuǎn)少于對(duì)馬鈴薯塊莖淀粉的研究，這是由于馬鈴薯塊莖組織細(xì)胞中含有大量的多糖和多酚、醌類等次生代謝物質(zhì)，這些伴隨物質(zhì)不易被一般的蛋白質(zhì)提取方法去除，這在一定程度上限制了對(duì)馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)的研究。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為甘肅省定西市產(chǎn)的馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)，購(gòu)于蘭州理工大學(xué)菜市場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 馬鈴薯塊莖可溶性蛋白提取及其含量測(cè)定

塊莖可溶性蛋白的提取按照Koistinen等(2002)[[2]報(bào)道的兩步沉淀法執(zhí)行。含量測(cè)定按照王永剛等(2013)[3]改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)比色法進(jìn)行。

1.2.2 馬鈴薯塊莖可溶性蛋白 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及其圖譜分析

SDS-PAGE的分離膠濃度為12%，其操作按分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[4]進(jìn)行。蛋白電泳圖譜分析采用BandScan5.0進(jìn)行分析。

2.結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯塊莖總可溶性蛋白提取及含量測(cè)定

取1g鮮重的馬鈴薯塊莖，采用兩步沉淀法提取可溶性蛋白，蛋白沉淀溶于2mL緩沖液液（50mM Tris-HCl、1mM EDTA、1%SDS，pH8.0）后測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果為11.41mg/mL，可溶性蛋白含量為22.82mg/g鮮重。

2.2 馬鈴薯塊莖總可溶性蛋白SDSPAGE及其分析

圖1 馬鈴薯塊莖可溶性蛋白SDSPAGE電泳結(jié)果（M泳道為蛋白質(zhì)低分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-3號(hào)泳道為馬鈴薯塊莖可溶性蛋白，上樣量分別為10μg，15μg，25μg）

取上述馬鈴薯塊莖蛋白提取液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1。豐度最高的蛋白條帶（圖中箭頭所指）分子量約40kDa，BandScan5.0分析其相對(duì)豐度分別為38.8%（1號(hào)泳道）、36.1（2號(hào)泳道）%和36.5%（3號(hào)泳道）。這一結(jié)果與Krischner等[5]報(bào)道的馬鈴薯塊莖主要儲(chǔ)藏蛋白patatin基本一致。1、2、3號(hào)泳道僅僅是蛋白樣品上樣量不同，BandScan5.0掃描出的豐度卻不一致，1號(hào)泳道的豐度明顯高于其他兩個(gè)泳道，2號(hào)泳道和3號(hào)泳道的差別不大。其原因可能是上樣量低時(shí)，一些低豐度蛋白條帶不能被考馬斯亮藍(lán)染色檢出（馬斯亮藍(lán)染色檢出低限在100ng左右），故可被檢出的蛋白條帶的相對(duì)豐度變高。當(dāng)上樣量增加時(shí)，隨著被檢出條帶的增加，蛋白條帶的豐度趨于穩(wěn)定。據(jù)此，以BandScan5.0分析蛋白條帶的相對(duì)豐度時(shí)最好梯度上樣，以獲得一致的蛋白條帶相對(duì)豐度。

3.結(jié)論

馬鈴薯塊莖可溶性蛋白中豐度最高的蛋白質(zhì)可能是塊莖儲(chǔ)藏蛋白patatin；BandScan軟件掃描分析蛋白質(zhì)樣品的電泳結(jié)果時(shí)蛋白質(zhì)樣品最好梯度上樣，以此確保獲得相對(duì)豐度一致的條帶豐度掃描結(jié)果。

[1]Fernie A R, Willmitzer L. Molecular and biochemical triggers of potato tuber development[J]. Plant Physiology, 2001, 127(4): 1459-1465.

[2]Koistinen K M, Hassinen V H, Gynther P A M, et al. Birch PR-10c is induced by factors causing oxidative stress but appears not to confer tolerance to these agents[J]. New Phytologist, 2002, 155(3): 381-391.

[3]王永剛, 馬建忠, 馬雪青等. 響應(yīng)面法優(yōu)化考馬斯亮藍(lán)G-250溶液的配制[J]. 藥物生物技術(shù), 2013, (1).

[4]Sambrook J, 薩姆布魯克, Russell D W, et al. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]. 科學(xué)出版社, 2002.

[5] Krischner B, Hahn H. Patatin, a major soluble protein of the potato (Solanum tuberosum L.) tuber is synthesized as a larger precursor[J]. Planta, 1986, 168(3): 386-389.