IL-10R基因多態(tài)性與乙型肝炎病毒感染慢性化的相關(guān)性

鄭 亢，郜玉峰，潘高峰，殷宏娟，鄒桂舟

IL-10R基因多態(tài)性與乙型肝炎病毒感染慢性化的相關(guān)性

鄭 亢，郜玉峰，潘高峰，殷宏娟，鄒桂舟

摘要目的 探討IL-10R基因多態(tài)性與乙型肝炎病毒（HBV）感染后慢性化的相關(guān)性。方法 收集501例慢性HBV感染患者和301例急性自限性HBV感染患者外周血標(biāo)本，兩組患者的年齡、性別和地區(qū)來源均相互匹配。Snapshot方法檢測IL-10R兩個(gè)tag SNP（rs2228055、rs2256111）的基因型；χ2檢驗(yàn)用于比較兩組間基因型及等位基因頻率分布。結(jié)果 IL-10R基因rs2228055、rs2256111多態(tài)等位基因和基因型頻率在兩組中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。IL-10R基因rs2228055位點(diǎn)G／G基因型頻率（7.2%）明顯低于急性自限性HBV感染患者（13.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；GG基因型在HBV感染慢性化的風(fēng)險(xiǎn)是AG＋AA基因型的0.52倍（OR＝0.52，95%CI：0.32～0.84）。結(jié)論IL-10R rs2228055位點(diǎn)GG基因型在HBV感染后的慢性化中發(fā)揮保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞乙型肝炎病毒；單核苷酸多態(tài)性；IL-10R；易感性

2015-02-09接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝病科，合肥 230601

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染慢性化的原因非常復(fù)雜，除與HBV的變異、宿主的年齡、性別和免疫狀態(tài)有密切關(guān)系外，遺傳基因的多態(tài)性可能是導(dǎo)致HBV感染慢性化的另一個(gè)重要原因［1］。HBV感染后，機(jī)體對(duì)病毒的清除能力與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，而病毒的清除與否決定著疾病的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后［2］。白細(xì)胞介素10受體（interleukin-10 receptor，IL-10R）是重要免疫調(diào)節(jié)基因，通過其配體IL-10參與免疫負(fù)性調(diào)節(jié)，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮抗炎癥的作用，從而維持機(jī)體內(nèi)部免疫平衡［3-4］。最新的研究［5］顯示IL-10R多態(tài)性與泰國人群HBV的易感性相關(guān)。由于不同人種存在遺傳異質(zhì)性，且目前尚未見IL-10R基因多態(tài)性與漢族慢性HBV感染相關(guān)性研究報(bào)道。該研究選取IL-10R基因?yàn)楹蜻x基因，探討IL-10R基因rs2228055、rs2256111多態(tài)位點(diǎn)與HBV感染的遺傳關(guān)聯(lián)性。

1　材料與方法

1.1 病例資料 本研究收集了安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝病科門診和住院的患者，無血緣關(guān)系的漢族人。慢性乙型肝炎患者501例，男284例，女217例，年齡19～65（45.8±14.9）歲，自愈性乙肝病毒感染者301例，其中男166例，女135例，年齡19 ～69（44.3±15.8）歲?；颊叩呐R床資料如表1所示。慢性乙型肝炎患者為有乙型肝炎病史或HBsAg陽性超過1年，血清HBsAg、HBeAg和HBV-DNA陽性者，1年內(nèi)連續(xù)隨訪4次以上均顯示谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶均在正常范圍內(nèi)。自愈性乙肝病毒感染者為無乙肝疫苗接種史，HBsAg陰性，血清抗-HBs、血清抗-HBc陽性者，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶均在正常范圍內(nèi)。診斷符合國際慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。該研究得到了安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)步驟 用抗凝的外周血標(biāo)本2 ml提取基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增目的基因，PCR產(chǎn)物分離純化，采用Snapshot延伸反應(yīng)，然后進(jìn)行測序、分析。IL-10R基因SNP位點(diǎn)的選擇：根據(jù)HapMap數(shù)據(jù)中的信息，選擇TagSNP中r2＞0.8，微等位基因MAF＞0.1，可能發(fā)揮功能的SNP作為候選的SNP位點(diǎn)。本研究選擇了rs2228055、rs256111位點(diǎn)。

1.2.2 PCR引物的設(shè)計(jì)、擴(kuò)增及基因分型 PCR擴(kuò)增SNP位點(diǎn)所用是通過primer primer5.0設(shè)計(jì)，于上海生工科技生物公司合成，rs2228055上游引物：5′-TGTCCGTGTGCCATGAAATAAAA-3’，下游引物：5′-CTGAGAGCAGCCCAGCTGAC-3′；rs256111上游引物：5′-CCTCCTCAGCCCTCAAGTCTCA-3’，下游引物：5′-GGGAACCCCATACCGTGAAGTT-3′。PCR產(chǎn)物通過延伸引物進(jìn)行基因分型，rs2228055位點(diǎn)延伸引物為CACTGCCTGGTGAGGGAGA，rs256111位點(diǎn)延伸引物為TTTTGGCCCAAGATGGCCCCCGC。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本研究兩組患者的年齡等計(jì)量資料運(yùn)用t檢驗(yàn)，基因型及等位基因的比較及Hardy-Weinberg平衡檢測均運(yùn)用χ2檢驗(yàn)或是Fisher確切概率法，基因型及等位基因的比較運(yùn)用Bonferroni校正，單倍體由SHEsis統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2　結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢測 IL-10R基因rs2228055、rs256111多態(tài)位點(diǎn)的基因型及等位基因在兩組患者中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。兩組患者的年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 兩組患者IL-10R基因多態(tài)位點(diǎn)基因型及等位基因的比較 IL-10R基因rs2228055、rs256111多態(tài)位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率情況見表1。rs2228055位點(diǎn)GG基因型在慢性HBV感染患者中顯著低于自限性HBV感染患者（OR＝0.52，95% CI：0.32～0.84）。rs2228055位點(diǎn)GA基因型及rs2256111位點(diǎn)GA基因型在慢性HBV感染患者中有升高的趨勢(shì)，但經(jīng)Bonferroni校正后兩組患者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的其他基因型與等位基因在兩組患者中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　兩組患者IL-10R的基因型及等位基因的頻率比較［n（%）］

2.3 兩組患者的單倍體比較 兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)通過SHEsis軟件進(jìn)行單倍體構(gòu)建，兩組患者單倍體類型的比較見表2。結(jié)果顯示，兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)構(gòu)成的單倍體在兩組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　討論

HBV感染人體后，由于機(jī)體對(duì)病毒的清除能力不同，會(huì)導(dǎo)致不同的轉(zhuǎn)歸。若免疫功能低下或是免疫缺陷，不能徹底地清除病毒，病毒潛伏于肝臟，經(jīng)過長期的免疫耐受期的沉寂后開始發(fā)病，即導(dǎo)致慢性乙型肝炎［1］。在我國，慢性乙型肝炎的患者人數(shù)眾多，發(fā)病率較高，且目前尚無特效的治療方式，主要是抗病毒及對(duì)癥治療。慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，免疫和遺傳因素參與其發(fā)病。多種免疫相關(guān)基因多態(tài)與HBV的遺傳易感性相關(guān)，這些基因在HBV感染的預(yù)后過程中發(fā)揮著重要作用。IL-10、GTP結(jié)合核蛋白等多種基因的多態(tài)性與慢性乙型肝炎顯著相關(guān)，而已發(fā)現(xiàn)的基因只能解釋慢性乙型肝炎的易感性［3，6］?；谶z傳、免疫因素的共同作用，因此免疫相關(guān)的基因與慢性HBV感染的遺傳易感性研究是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本研究結(jié)果表明IL-10R基因rs2228055位點(diǎn)GG基因型與慢性乙型肝炎顯著相關(guān)；而rs2228055位點(diǎn)GA，rs2256111位點(diǎn)GA和AA基因型在慢性HBV感染中有升高趨勢(shì)，經(jīng)校正后與疾病無相關(guān)性；單倍體未發(fā)現(xiàn)與該病存在相關(guān)性。研究［6-9］表明，rs2228055位點(diǎn)與慢性丙型肝炎和早期潰瘍性結(jié)腸炎顯著相關(guān)；而rs2256111位點(diǎn)在韓國人群中與高血壓及前列腺肥大相關(guān)。這些不同的結(jié)果可能是由于不同的種族在遺傳上具有異質(zhì)性所致，不同疾病存在不同的遺傳易感性位點(diǎn)。

表2　慢性乙型肝炎患者和自限性肝炎患者的IL-10R單倍體頻率比較（n）

IL-10是重要的抗炎因子，主要由調(diào)節(jié)T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和Th2細(xì)胞分泌的，IL-10發(fā)揮抗炎癥及免疫調(diào)節(jié)作用是通過與其配體IL-10R結(jié)合［2，4］。在HBV感染的患者中，IL-10的表達(dá)水平明顯增加。IL-10及IL-10R的基因多態(tài)性是炎癥性疾病研究的熱點(diǎn)，這些基因某些單核苷酸的多態(tài)性可能影響基因的表達(dá)或是功能，從而調(diào)控免疫反應(yīng)。本研究顯示，IL-10R基因rs2228055多態(tài)位點(diǎn)GG基因型在慢性乙型肝炎患者中顯著降低，在該病中發(fā)揮保護(hù)作用。根據(jù)該多態(tài)位點(diǎn)的位于IL-10R基因的外顯子區(qū)段，IL-10R基因的rs2228055A／G位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致氨基酸合成的改變：異亮氨酸和纈氨酸。當(dāng)此位點(diǎn)等位基因?yàn)锳堿基時(shí)，該位點(diǎn)編碼的氨基酸為異亮氨

酸；而當(dāng)該位點(diǎn)等位基因?yàn)镚堿基時(shí)，編碼的氨基酸為纈氨酸。由此可知，此位點(diǎn)的多態(tài)性導(dǎo)致了氨基酸的改變，進(jìn)而影響IL-10R基因的表達(dá)或功能。在此基礎(chǔ)上，可推測IL-10R基因的rs2228055A／G位點(diǎn)對(duì)疾病的影響：可能因?yàn)樵摱鄳B(tài)位點(diǎn)通過改變編碼的氨基酸影響IL-10R的功能及表達(dá)水平，進(jìn)而引起免疫平衡打破，機(jī)體清除HBV能力的改變，從而影響疾病的發(fā)生。

同其他的病例對(duì)照研究一樣，本文的不足之處主要有以下幾個(gè)方面［10］：首先，在于患者僅來自于漢族人群，需要其他多種族、大樣本的標(biāo)本驗(yàn)證。其次，沒有對(duì)本研究顯示的與HBV感染慢性化相關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)rs2228055進(jìn)行功能研究。

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Association between IL-10R gene polymorphisms and spontaneous clearance of hepatitis B virus infection

Zheng Kang，Gao Yufeng，Pan Gaofeng，et al
（Dept of Infectious Diseases，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230032）

AbstractObjective To examine whether IL-10R polymorphisms were associated with susceptibility to chronic hepatitis B virus（HBV）infection in a Chinese Han population.Methods A total of 501 chronic HBV-infected patients as cases and 301 age-，sex-，and ethnically matched self-limiting HBV-infected individuals as controls were recruited in this study.Two tag SNPs（rs2228055 and rs2256111 of IL-10R）were genotyped in all subjects by using Snapshot method.The frequencies of alleles and genotypes between the two groups were analyzed by χ2analysis.Results All genotype and allele distributions in patients with C-HBV and patients with SL-HBV were in Hardy-Weinberg equilibrium.The frequency of the rs2228055 GG genotype（7.2%）was significantly decreased in patients with C-HBV as compared to SL-HBV patients（13.0%）.In patients with chronic HBV infection，the risk of GG genotype in patients is 0.52 times of that of the AG，AA genotypes patients（OR＝0.52，95%CI：0.32～0.84）.Conclusion In this study，the results suggest that the rs2228055 GG genotype of IL-10R is associated with the susceptibility to chronic HBV infection in the Chinese Han population.

Key wordshepatitis B virus；single polymorphism；interleukin-10 recepter；gene susceptibility

作者簡介：鄭 亢，女，碩士研究生；鄒桂舟，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ayzouguizhou＠sina.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81273142）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）05-0632-03

中圖分類號(hào)R 512.6＋3