培哚普利對異丙腎上腺素致大鼠心肌肥厚中H2S／CSE合成途徑的影響

魯 艷，王愛玲，陳 森，郭 增，李 麗，王春苗，郭曉琳

培哚普利對異丙腎上腺素致大鼠心肌肥厚中H2S／CSE合成途徑的影響

魯 艷1，王愛玲1，陳 森2，郭 增3，李 麗1，王春苗1，郭曉琳1

摘要目的 研究在異丙腎上腺素（ISO）致大鼠心肌肥厚模型中，培哚普利對大鼠心肌組織硫化氫／胱硫醚-γ-裂解酶（H2S／CSE）合成途徑的影響。方法 40只大鼠隨機均分為模型組、培哚普利＋模型組、培哚普利對照組和空白對照組，采用皮下注射ISO制備心肌肥厚模型。檢測大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)（HMI）和左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI），心肌組織中H2S含量及其生成酶活性，心肌組織中CSE蛋白表達情況。結果與空白對照組比較，模型組大鼠HMI、LVMI升高（P＜0.01），心肌肥厚明顯，H2S含量及其生成酶活性減少（P＜0.01），CSE表達下降（P＜0.05），培哚普利對照組大鼠心肌H2S含量及其生成酶活性升高（P＜0.01），CSE表達增加（P ＜0.05）。與模型組比較，培哚普利＋模型組大鼠HMI、LVMI下降（P＜0.01），心肌中H2S含量及其生成酶活性升高（P＜0.01），CSE表達增加（P＜0.05）。與培哚普利對照組比較，培哚普利＋模型組大鼠HMI、LVMI升高（P＜0.01），心肌中H2S含量及其生成酶活性下降（P＜0.01），CSE表達下降（P＜0.05）。結論 培哚普利能夠提高大鼠心肌中H2S含量及其生成酶活性，可能與其能夠提高CSE表達，影響H2S／CSE合成途徑相關，其中在治療ISO所致大鼠心肌肥厚模型中作用更加明顯。

關鍵詞心肌肥厚；硫化氫；培哚普利；異丙腎上腺素

2015-01-13接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥 230022

2蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院老年病科，蚌埠 233004

3安徽醫(yī)科大學附屬省立第二醫(yī)院重癥監(jiān)護室，合肥230064

心肌肥厚是引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率顯著升高的獨立危險因素，與高血壓性心臟病、心律失常、心源性猝死等關系密切。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）常用于治療心肌肥厚相關疾病，與其具有明確的降血壓、改善心室重構等作用有關［1］。ACEI可影響正常大鼠［2］及自發(fā)性高血壓［3］或腹主動脈縮窄術［4］引起的大鼠心肌肥厚模型心肌組織中硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）的含量。H2S作為內(nèi)源性氣體信號分子，具有舒張血管降低血壓、抑制血管平滑肌細胞增殖，改善心肌重構等生物學效應［5］，在哺乳動物心肌組織中H2S主要通過胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）［6］產(chǎn)生。心肌組織中H2S含量的改變與許多心血管疾病的發(fā)生和治療過程關系密切［5］。該研究采用異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）制備大鼠心肌肥厚模型［7］，通過ACEI之一的培哚普利作用于模型，比較心肌組織中H2S含量及其合成酶活性和主要生成酶CSE表達等指標，探討培哚普利在大鼠心肌肥厚模型中對H2S／CSE合成途徑的影響。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠40只，清潔級，180 ±20 g，購自安徽省實驗動物中心，實驗前常規(guī)適應性飼養(yǎng)1周，觀察無異常者入組，實驗中對動物的處置符合動物倫理學要求。

1.1.2 主要藥物和試劑 ISO購自上海禾豐制藥有限公司，批號：20130725；培哚普利購自天津施維雅制藥有限公司，批號：2004789；NaHS、磷酸吡哆醛、硝酸纖維膜（NC膜）購自美國Sigma公司；N，N-二甲基-對苯二胺鹽酸鹽購自上海生工生物有限公

司；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒購自上海碧云天生物有限公司；GAPDH、二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；ECL購自美國Thermo Fisher Scientific公司；抗CSE抗體購自美國Proteintech公司；倒置顯微鏡型號為奧林巴斯CKX41IX53，由安徽省干細胞庫提供。

1.2 方法

1.2.1 制備大鼠心肌肥厚模型 40只大鼠隨機均分為培哚普利對照組、空白對照組、模型組和培哚普利＋模型組。根據(jù)文獻［7］及預實驗結果，模型組及培哚普利＋模型組予以背部多點皮下注射2.5 mg／（kg·d）ISO，余下兩組予以等量生理鹽水皮下注射。7 d后，培哚普利對照組、培哚普利＋模型組予以4 mg／（kg·d）培哚普利灌胃治療，模型組及空白對照組以同等量生理鹽水灌胃。共飼養(yǎng)4周，末次給藥后，禁食水12 h，再觀察各組指標。

1.2.2 心肌肥厚指數(shù)測定 大鼠稱取體重（body weight，BW），按3 ml／kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉后固定于鼠板上。大鼠胸部備皮，打開胸腔分離心臟，快速剪去周邊組織，預冷的生理鹽水充分將心臟沖洗干凈，濾紙吸干后稱取心臟質(zhì)量（heart mass，HM），除去右心室（保留室間隔），稱取左心室質(zhì)量（left ventricular mass，LVM），計算心臟質(zhì)量指數(shù)（heart mass index，HMI）和左心室質(zhì)量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）。HMI＝HM／BW（mg／g），LVMI＝LVM／BW（mg／g），以LVMI反映心肌肥厚程度。

1.2.3 心肌組織學檢查 將分離出的左心室沿長軸橫切，均分3部分，上、下兩部分立即置于液氮中，統(tǒng)一收集后放入-80℃冰箱保存，待用；取中間部分，快速置于4%多聚甲醛固定，用于常規(guī)包埋石蠟，連續(xù)切片；作HE染色，鏡下觀察心肌組織形態(tài)學改變。

1.2.4 心肌組織H2S含量檢測 用系列濃度的NaHS溶液繪制標準曲線。取部分上述大鼠左心室心肌組織，洗凈、吸干、精密稱量質(zhì)量，用1 mmol／L PBS通過玻璃勻漿器制備10%（W／V）心肌組織勻漿，4℃、4 000 r／min離心10 min，取上清液。BCA蛋白定量后取0.1 ml勻漿轉(zhuǎn)移至試管中，加入0.5 ml 1%醋酸鋅，迅速混勻后，再依次加入20 mmol／L N，N-二甲基-對苯二胺硫酸鹽（含7.2 mol／L鹽酸）0.5 ml、30 mmol／L三氯化鐵（含1.2 mol／L鹽酸）0.4 ml，靜置20 min，充分顯色后加入10%三氯乙酸1 ml，蒸餾水2.5 ml，6 000 r／min離心5 min，取上清液，在670 nm處通過紫外分光光度儀讀取吸光度，根據(jù)已制作NaHS溶液制備的標準曲線計算心肌組織中H2S含量。

1.2.5 心肌組織CSE酶活性檢測 取制備的10%心肌組織勻漿，在250 ml錐形瓶中進行實驗，反應液1 ml，含磷酸鉀緩沖液（pH 7.4，100 mmol／L）、L-半胱氨酸（10 mmol／L）、5-磷酸吡哆醛（2 mmol／L）0.9 ml，10%組織勻漿0.1 ml。中央室中加入1%醋酸鋅0.5 ml。折疊放入2.0 cm×2.5 cm濾紙加大吸收面積，錐形瓶在風口前用氮氣充盈30 s，轉(zhuǎn)移到37℃恒溫搖床中反應90 min后注入50%三氯乙酸0.5 ml，繼續(xù)孵育60 min后終止反應。再在中央室液體加入3.6 ml蒸餾水，20 mmol／L N，N-二甲基-對苯二胺硫酸鹽（含7.2 mol／L鹽酸）0.5 ml、30 mmol／L三氯化鐵（含1.2 mol／L鹽酸）0.4 ml，混勻，室溫靜置20 min。在波長670 nm處使用紫外分光光度儀讀取吸光度，根據(jù)已制作的NaHS標準曲線計算心肌組織中H2S生成率，即得出組織中CSE活性。

1.2.6 Western blot法檢測CSE表達 將上述部分大鼠左心室心肌組織剪碎，每20 mg加入0.3 ml RIPA裂解液（含1 mmol／L PMSF），玻璃勻漿器制備組織勻漿，4℃、12 000 r／min離心15 min，取上清液；BCA蛋白定量后加入上樣緩沖液，100℃水浴變性10 min，12%SDS-PAGE電泳，恒流200 mA，2 h，轉(zhuǎn)至NC膜；室溫封閉2 h，加一抗CSE（1∶500）或GAPDH（1∶800）4℃過夜后，辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶15 000）室溫孵育2 h，ECL涂于NC膜上，曝光并采集圖像。Image J軟件分析蛋白條帶，以GAPDH的表達量作為參照。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2　結果

2.1 各組大鼠HMI、LVMI比較 各組HMI、LVMI差異有統(tǒng)計學意義（F＝16.31、17.82）。與空白對照組比較，模型組和培哚普利＋模型組HMI、LVMI均升高（P＜0.01），培哚普利對照組HMI、LVMI差異無統(tǒng)計學意義；與模型組比較，培哚普利＋模型組HMI、LVMI降低（P＜0.01），見表1。

2.2 鏡下觀察大鼠心肌形態(tài)學病理變化 空白對照組和培哚普利對照組心肌細胞形態(tài)正常，心肌纖維排列整齊；模型組心肌細胞可見肥大，心肌細胞間

質(zhì)增寬，甚至部分心肌纖維出現(xiàn)斷裂變性及少量心肌細胞壞死；與模型組比較，培哚普利＋模型組心肌肥厚明顯改善。見圖1。

表1　各組大鼠HMI、LVMI比較（±s）

表1　各組大鼠HMI、LVMI比較（±s）

與空白對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：＃＃P＜0.01

組別　　存活例數(shù)（n）　HMI（mg／g）　LVMI（mg／g）培哚普利對照10　2.34±0.15　1.95±0.13空白對照　10　2.37±0.12　1.93±0.12模型　7　3.09±0.09**　2.45±0.12**培哚普利＋模型　8　2.78±0.12**＃＃2.19±0.10**＃＃

2.3 培哚普利對大鼠H2S及其生成酶活性的影響

各組H2S、CSE差異有統(tǒng)計學意義（F＝51.42、202.17）：與空白對照組比較，模型組H2S含量及其生成酶活性明顯下降（P＜0.01），培哚普利對照組H2S含量及其生成酶活性明顯上升（P＜0.01）；與培哚普利＋模型組比較，模型組H2S含量及其生成酶活性明顯下降（P＜0.05），培哚普利對照組H2S含量及其生成酶活性明顯上升（P＜0.05），見表2。

表2　各組心肌組織中內(nèi)源性H2S含量及其生成酶活性（±s）

表2　各組心肌組織中內(nèi)源性H2S含量及其生成酶活性（±s）

與空白對照組比較：**P＜0.01；與培哚普利＋模型組比較：＃P ＜0.05

組別　　存活例數(shù)（n）　H2S（μmol／g）　CSE ［nmol／（min·mg ）］空白對照10　21.5±2.04　2.81±0.15培哚普利對照　10　24.5±1.78**＃　3.21±0.13**＃模型　7　14.3±1.57**?！?.56±0.17**＃培哚普利＋模型8　17.8±1.85　1.91±0.18

2.4 培哚普利對CSE表達的影響 Western blot法檢測大鼠心肌CSE表達情況：各組CSE相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（F＝255.67）：與空白對照組比較，模型組CSE表達下降（P＜0.05），培哚普利對照組CSE表達升高（P＜0.05）；與培哚普利＋模型組比較，培哚普利對照組CSE表達升高（P＜0.05），模型組CSE表達下降（P＜0.05），該結果與上述心肌組織中H2S含量及其生成酶活性變化趨于一致。見圖2。比較培哚普利＋模型組與模型組中CSE的表達比值同培哚普利對照組與空白對照組比值表明，培哚普利對心肌肥厚大鼠中CSE表達高于正常大鼠（P＜0.05）。

3　討論

皮下注射β受體激動劑ISO可誘導大鼠心肌肥厚，與其能夠激活腎上腺素受體、增加心肌細胞合成代謝和鈣離子超負荷相關［8］。本研究依此建立模型，并根據(jù)HMI、LVMI和病理學改變等確認大鼠心肌肥厚造模成功。H2S作為一類重要氣體信號分子，在哺乳動物體內(nèi)主要通過胱硫醚-β-合成酶、CSE 和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶合成代謝，其中心血管組織以CSE［9］為主。H2S對心血管系統(tǒng)具有重要保護作用［10-11］，內(nèi)源性H2S能夠通過防止心肌細胞凋亡［12］及相關金屬蛋白酶減少心肌纖維化［5］等途徑改善大鼠心肌肥厚。在自發(fā)性高血壓大鼠［3］、腹主動脈縮窄術［4］等引起的心肌肥厚模型中，心肌組織H2S含量均下降，另有發(fā)現(xiàn)H2S／CSE合成途徑在急性心肌缺血模型中也有重要作用［13］，提示H2S／CSE合成途徑改變與心肌肥厚等心血管疾病發(fā)生關系密切。培哚普利作為ACEI主要通過腎素血管緊張素系統(tǒng)治療心肌肥厚［14］，近來研究［15］顯示ACEI在治療高血壓大鼠存在H2S／CSE合成途徑的改變。因此研究心肌肥厚模型中培哚普利對心肌組織

H2S／CSE合成途徑的影響，在ACEI治療心肌肥厚的機制和心肌肥厚相關疾病的發(fā)生等方面均有重要價值。

本研究顯示在ISO引起大鼠心肌肥厚模型中，心肌組織中H2S含量及其生成酶活性下降，這與上述研究［3-4］結果一致，CSE表達下降，提示在心肌肥厚形成過程中，內(nèi)源性H2S合成減少。在培哚普利＋模型組中，CSE表達升高，表明培哚普利在治療心肌肥厚過程中，通過提高CSE表達影響H2S／CSE合成途徑，進而提高大鼠心肌中H2S含量，使大鼠HMI、LVMI下降，心肌肥厚明顯改善。另有研究［2］顯示雷米普利能夠提高正常大鼠心肌中H2S含量，為比較培哚普利對正常和心肌肥厚模型大鼠心肌組織H2S／CSE合成途徑的影響，本研究設置了培哚普利對照組。通過觀察與正常和心肌肥厚模型大鼠心肌組織H2S含量及其生成酶活性和CSE表達變化，結果顯示培哚普利對照組中H2S含量及其生成酶活性高于空白對照組，與相關研究［2］結果一致，而CSE表達高于空白對照組，提示培哚普利在正常大鼠心肌中也能夠通過提高CSE表達影響H2S／CSE合成途徑。進一步比較CSE在培哚普利組與空白對照同培哚普利＋模型組與模型組中表達，表明培哚普利對H2S／CSE合成途徑的影響在ISO致大鼠心肌肥厚模型中高于正常大鼠。

綜上所述，培哚普利能夠影響大鼠心肌組織H2S／CSE合成途徑，提高內(nèi)源性H2S含量及其生成酶活性，改善大鼠心功能，與其能夠提高CSE表達有關，并且培哚普利對CSE表達的影響，在ISO誘導大鼠心肌肥厚模型中強于正常大鼠。

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◇臨床醫(yī)學研究◇

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Perindopril affects the H2S／CSE pathway in ISO-induced cardiac hypertrophy

Lu Yan1，Wang Ailing1，Chen Sen2，et al
（1Dept of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Geriatrics，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233004）

AbstractObjective To investigate how perindopril affects myocardial hydrogen sulfide／cystathionine-γ-lyase

（H2S／CSE）pathway in the model of isoprenaline（ISO）-induced cardiac hypertrophy rats.Methods 40 rats were randomly divided into a disease control group，a disease treated with perindopril group，a perindopril control group and a normal control group.Cardiac hypertrophy model was established by a subcutaneous injection of ISO.Heart mass index（HMI），left ventricular mass index（LVMI），the contents of H2S，the activity of H2S synthesizing enzymes and the expression of CSE were calculated.Results Compared with the normal control group，HMI and LVMI increased（P＜0.01），myocardial tissue thickened obviously，the contents of H2S and the activity of H2S synthesizing enzymes decreased（P＜0.01）and the expression of CSE also decreased（P＜0.05）in the disease control group.However，the contents of H2S and the activity of H2S synthesizing enzymes increased（P＜0.01）and the expression of CSE increased（P＜0.05）in the disease treated with perindopril group.Compared with the disease control group，HMI and LVMI decreased（P＜0.01），the contents of H2S and the activity of H2S synthesizing enzymes increased（P＜0.01）and the expression of CSE also increased（P＜0.05）in the disease treated with perindopril group.Compared with the perindorpril control group，HMI and LVMI increased（P＜0.01），the contents of H2S and the activity of H2S synthesizing enzymes decreased（P＜0.01）and the expression of CSE also decreased（P＜0.05）in the disease treated with perindopril group.Conclusion Perindopril can improve the contents of H2S and the activity of H2S synthesizing enzymes in myocardial tissue.It may be related to influence H2S ／CSE pathway via enhancing the expression of CSE which affects more in ISO-induced cardiac hypertrophy rats.

Key wordscardiac hypertrophy；H2S；perindopril；isoprenaline

作者簡介：魯 艷，男，碩士研究生；王愛玲，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail：wal＠ah.edu.cn

基金項目：安徽省自然科學基金（編號：11040606M155）；安徽省教育廳高等教育振興計劃項目（編號：2013zdjy066）；安徽省教育廳高等學校教學研究委托重大項目（編號：2012jyzd09w）

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0621-05

中圖分類號R 542.2