腺苷受體及其介導的cAMP-PKA信號通路在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中的作用

趙 晗，丁利平，呂雄文，王 和，王 琪，楊 鳳，楊 巖，張媛媛

腺苷受體及其介導的cAMP-PKA信號通路在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中的作用

趙 晗，丁利平，呂雄文，王 和，王 琪，楊 鳳，楊 巖，張媛媛

摘要目的 探討腺苷受體及其介導的環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A（cAMP-PKA）信號通路在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中的作用。方法 將20只雄性昆明種小鼠隨機分為空白對照組和模型組。模型組給予對乙酰氨基酚500 mg／kg，空白對照組給予等量的生理鹽水，兩組均為單次灌胃給藥。24 h后處死小鼠，檢測谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽汁酸（TBA），HE染色觀察肝臟病理變化；原位肝灌注法分離小鼠肝細胞；Real-Time qPCR法、Western blot法分別檢測肝細胞腺苷A1受體（A1R）、A2A受體（A2AR）、A2B受體（A2BR）和A3受體（A3R）水平；ELISA法檢測各組細胞cAMP含量；Western blot法檢測各組細胞PKA、磷酸化-環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白（p-CREB）的表達水平。結果 與空白對照組比較，模型組AST、ALT、ALP、TBA表達明顯增加（P＜0.01）且肝組織損傷明顯；與空白對照組比較，模型組腺苷A1R、A2AR的表達明顯升高（P＜0.01），cAMP含量、PKA、p-CREB蛋白的表達水平也相應增加（P＜0.05）。結論 對乙酰氨基酚致藥物性肝臟損傷可能與cAMP-PKA信號通路有關。

關鍵詞對乙酰氨基酚；肝損傷；腺苷受體

2015-02-02接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學藥學院，合肥 230032

對乙酰氨基酚，又名撲熱息痛，是目前使用最廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥，但該藥的過量使用會引起肝細胞毒性，導致肝臟損傷［1］。對乙酰氨基酚已在臨床廣泛使用，但如何合理抑制其肝毒性尚無良策。腺苷及腺苷受體（adenosine receptors，ARs）由于復雜的生物學作用和在多種疾病中的重要調(diào)節(jié)功能受到了越來越多的關注［2］。腺苷作為一種內(nèi)源性嘌呤核苷，主要通過結合并激活與G蛋白耦聯(lián)的ARs，對機體的許多系統(tǒng)及組織發(fā)揮著重要作用。ARs廣泛存在于肝細胞［3］，在肝病的發(fā)病機制中發(fā)揮不可忽視的作用［4-5］，但其在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷機制中的作用尚未見報道。研究［5］表明，當肝細胞受到甲氨蝶呤等藥物刺激時，腺苷釋放量會增加，ARs通過介導環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A（cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A，cAMPPKA）信號通路參與肝臟炎癥的發(fā)生。另有研究［6］表明，腺苷增加導致肝細胞低氧、炎癥、急性損傷，而過量的對乙酰氨基酚也造成肝細胞損傷［7-8］。由此推測，對乙酰氨基酚通過激活ARs而引起肝細胞損傷，cAMP-PKA信號通路也參與其中。該研究擬通過對乙酰氨基酚灌胃制作藥物性肝損傷模型，探討ARs及其介導的cAMP-PKA信號通路在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中的作用。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明種小鼠，雄性，普通級，40～60 g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。普通飼料喂養(yǎng)，自由進食及飲水，自然光照環(huán)境中飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.1.2 主要試劑 對乙酰氨基酚（上海阿拉丁試劑公司）；乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸［ethylene glycol（2-aminoethyl ether）tetraacetic acid，EGTA］（美國Sigma公司）；Ⅰ型膠原酶、DMEM、胎牛血清（美國Gibco公司）；胰酶（美國Hyclone公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（美國Amresco公司）；小鼠腺苷A1R、A2AR抗體（北京博奧森公司）；環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白（cAMP response element bonding protein，CREB）、p-CREB抗體（北京安博公司）；β-actin、小鼠腺苷A2BR、A3R抗體（美國Santa Cruz公司）；TRIzol Reagent（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒（美國Fermentas公司）；ECL化學發(fā)光試劑盒（美國Thermo公司）；cAMP ELISA檢測試劑盒（美國R＆D公司）。

1.2 方法

1.2.1 對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型的建立

參考文獻將20只雄性昆明種小鼠隨機分為空白對照組、模型組，［9］方法，分別給予0.9%的氯化鈉注射液500 mg／kg、對乙酰氨基酚500 mg／kg（生理鹽

水配制），兩組均為單次灌胃給藥。24 h后眼眶取血并剖腹取肝，留取標本觀察肝臟生化指標和組織病理學改變。

1.2.2 肝臟生化指標的檢測 取血后，3 000 r／min離心10 min得血清，用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）水平。

1.2.3 肝臟組織病理學檢查 收集各組的肝臟組織，分別取肝左葉組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，HE染色后，光鏡下觀察肝臟病變情況。肝細胞炎癥活動度計分參考Knodell et al［10］計分標準，將小葉內(nèi)變性、壞死和匯管區(qū)炎癥分別計為0～4分，兩者之和為每張切片的炎癥活動度計分。

1.2.4 肝細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 將小鼠用10%水合氯醛（3 ml／kg）麻醉，用70%的酒精消毒小鼠腹部皮膚后打開小鼠腹腔，將內(nèi)臟撥到右邊，使門靜脈暴露。在門靜脈處放置外科縫合線并用靜脈注射器插入門靜脈。用縫合線將靜脈注射器插管處固定并剪斷下腔靜脈。用在37℃水浴中預熱過的0.5 mmol／L EGTA溶液灌注肝臟5 min，流速為5 ml／min，接著用預熱過的0.075%Ⅰ型膠原酶液灌注5 min。分離肝臟并將其放置在60 mm×15 mm的無菌培養(yǎng)皿中用解剖剪刀切割肝臟，并加DHanks液到組織培養(yǎng)皿中。用移液器吸取肝組織液到50 ml無菌的錐形管中并確保溶液到35 ml標記處，并加入5 ml 0.075%Ⅰ型膠原酶液。將管子放到振蕩器中室溫下?lián)u動15 min。通過70 μm的細胞過濾器過濾細胞并轉移至干凈的50 ml錐形管中，室溫下532 r／min離心5 min，棄上清液，將細胞沉淀重新懸浮于50 ml D-Hanks液中并在室溫下再次離心，532 r／min離心5 min。棄上清液，在含20%胎牛血清的DMEM中混勻并接種。5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)48 h，換液除去未貼壁細胞，由此純化肝細胞，以后每隔24 h換液一次。肝細胞貼壁生長后，可觀察到細胞呈島狀連接，細胞核較大且有雙核或多核細胞出現(xiàn)。

1.2.5 肝細胞中ARs的表達

1.2.5.1 Real-Time qPCR法檢測各組細胞中腺苷A1R、A2AR、A2BR、A3R表達水平 用TRIzol Regent試劑，按說明書方法提取各組細胞總RNA，具體操作參照試劑盒說明。以β-actin作為內(nèi)參，上游引物：5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，下游引物：5′-CCACAGGATTCCATACCCAA-3′；A1R上游引物：5′-TGGTGATTTGGGCTGTGAAGGT-3′，下游引物：5′-CAGGTGTGGAAGTAGGTCTGTGG-3′；A2AR上游引物：5′-CTGGGTGCTTGTGTGCTG-3′，下游引物：5′-GATGGTGATGGCGAATGGGAT-3′；A2BR上游引物：5′-GCGTCCCGCTCAGGTATAAAG-3′；下游引物：5′-CACCCCAGGAACGGAGTCAAT-3′；A3R上游引物：5′-GTTTCTGGTTCTCTTCTTGTTTGCG-3′，下游引物：5′-GGTTCATCATGGAGTTCGCGT-3′。

1.2.5.2 Western blot法檢測肝細胞中的A1R、A2AR、A2BR、A3R、PKA、p-CREB蛋白的表達水平

各組細胞加入藥物培養(yǎng)后，棄去培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液，用4℃的PBS潤洗3次；每瓶細胞加400 μl含PMSF的裂解液，冰上裂解30 min；4℃、12 000 r／min離心30 min，取上清液與蛋白上樣緩沖液混合，100℃加熱10 min。每孔上樣20 μl總蛋白，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V）。電泳結束后用濕轉儀將蛋白轉移到PVDF膜上。膜在室溫下用含50 g／L脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉3 h，用TBST清洗3次（每次15 min）后加入相應的一抗中，4℃過夜。再分別加入與一抗相匹配的二抗室溫放置1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參，分別以相應蛋白與β-actin光密度比值表示該蛋白相對表達水平。

1.2.6 ELISA法檢測肝細胞cAMP含量 收集細胞上清液，3 000 r／min離心10 min。按試劑盒說明書進行操作，繪制標準曲線，依次得出各組cAMP的含量。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行One-Way ANOVA分析，數(shù)據(jù)均為3次獨立實驗結果，以±s表示。組間比較采用S-N-K檢驗，等級資料采用秩和檢驗。

2　結果

2.1 各組小鼠肝功能相關檢測結果 與空白對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST、ALP、TBA升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。

2.2 各組小鼠肝臟組織病理學檢查結果 空白對照組肝小葉結構正常，無腫脹、脂肪變性、壞死，肝小葉及匯管區(qū)無炎細胞浸潤。與空白對照組相比，模型組肝小葉結構紊亂，小葉區(qū)、匯管區(qū)均出現(xiàn)炎性細胞浸潤，細胞索排列紊亂，界限模糊不清，表明模型建立成功。見圖1?？瞻讓φ战M10只小鼠中，小葉內(nèi)變性、壞死0分9例，1分1例，匯管區(qū)炎癥0分8例，1分2例；模型組8只（死亡2只未計入）小鼠中，小葉內(nèi)變性、壞死0分1例，1分1例，3分3例，4分3例，匯管區(qū)炎癥0分1例，1分4例，3分3例。與空白對照組相比，模型組小鼠肝臟炎癥活動度計分增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表1　對乙酰氨基酚對小鼠血清中ALT、AST、ALP、TBA的影響（n＝10，±s）

與空白對照組比較：**P＜0.01

組別　　劑量（mg／kg）　ALT（U／L）　AST（U／L）　ALP（U／L）　TBA（μmol／L）空白對照　-34.7±6.2　50.2±3.1　44.9±12.1　5.2±1.8模型　500　209.6±20.9**　154.6±21.3**　97.1±19.9**　13.2±3.0**

2.3 原代分離小鼠肝細胞的細胞形態(tài) 細胞體外培養(yǎng)2 d后開始貼壁，形態(tài)呈圓形或橢圓形，細胞輪廓清晰；體外培養(yǎng)4 d后，細胞呈多邊形，可見單核、雙核細胞，核仁清晰可見。見圖2。

2.4 腺苷A1R、A2AR、A3R、A2BR在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中的表達情況 與空白對照組比較，模型組腺苷A1R、A2AR的表達明顯升高（P ＜0.01），A3R、A2BR表達未見明顯變化。見圖3、4。

2.5 cAMP-PKA信號通路在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷中的作用 與空白對照組比較，模型組cAMP含量及其信號通路中關鍵信號分子PKA、p-CREB蛋白的表達明顯升高（P＜0.05），見圖5、6、7。

3　討論

肝細胞是肝臟的實質(zhì)細胞，占肝臟體積及數(shù)量的80%，是肝臟正常功能活動的物質(zhì)基礎。肝細胞內(nèi)代謝活躍，除合成人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時還代謝外源性和內(nèi)源性物質(zhì)，如藥物、毒物、膽紅素、激素等，并制造和分泌膽汁參與消化過程。肝細胞中存在ARs，腺苷是內(nèi)源性嘌呤核苷，通過與ARs結合，促進cAMP合成，激活PKA，對多種細胞中的酶或蛋白質(zhì)進行磷酸化修飾，從而導致底物蛋白的功能發(fā)生改變［2］。ARs分為4個亞型：A1R、A2AR、A2BR、A3R，其中A1R和A2AR是高表達受體。在正常生理狀態(tài)下，胞內(nèi)外的腺苷濃度很低，而在各種應激情況下，腺苷濃度大幅度提升。本研究結果顯示當肝細胞受到過量對乙酰氨基酚刺激時，腺苷A1R和A2AR的基因和蛋白表達水平明顯增加，證實腺苷A1R和A2AR在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷發(fā)病機制中發(fā)揮作用。

cAMP-PKA通路是細胞內(nèi)信號轉導的主要途徑，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的生物活性反應和平衡。有文獻［11］報道，在肝臟炎性疾病的發(fā)病機制中，激活肝細胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶誘導的cAMP-PKA通路可以抑制肝臟內(nèi)NO合成酶的過度合成。G蛋白耦聯(lián)受體的活化促進cAMP升高，激活PKA，PKA催化亞基轉位入細胞核，使CREB磷酸化，從而導致底物蛋白的功能發(fā)生改變［12］。Gi／o和Gs蛋白屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族，均參與細胞增殖活化并發(fā)揮重要作用［13］。本研究進一步探討對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中cAMP-PKA通路中關鍵信號分子PKA、磷酸化CREB蛋白的表達。結果顯示，與空白對照組相比，模型組PKA、磷酸化CREB蛋白的表達均增加。

在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中，腺苷A1R和A2AR表達水平均較空白對照組明顯增強，表明腺苷A1R和A2AR共同參與肝臟損傷過程。有研究［14］表明，Gs蛋白的激活可增加cAMP的產(chǎn)

生，而Gi／o蛋白的激活則抑制了cAMP的產(chǎn)生；腺苷A1R和A2AR分別通過Gi／o和Gs蛋白對cAMP的含量產(chǎn)生影響。本研究顯示空白對照組腺苷A2AR的含量高于A1R，模型組肝細胞中cAMP的含量高于空白對照組，由此推測腺苷A2AR介導的cAMP信號通路在對乙酰氨基酚致藥物性肝損傷模型中占主導地位。上述有關對乙酰氨基酚誘導的腺苷信號強度加強進而促進藥物性肝損傷的實驗結果，證實了一種潛在的對乙酰氨基酚導致肝損傷的發(fā)生機制。

［1］ Michaut A，Moreau C，Robin M A，et al.Acetam inophen-induced liver injury in obesity and nonalcoholic fatty liver disease［J］.Liver Int，2014，34（7）：171-9.

［2］ Chen J.Adenosine receptor control of cognition in normal and disease［J］.Int Rev Neurobiol，2014，119：257-307.

［3］ Peng Z，Borea P A，Wilder T，et al.Adenosine signaling contributes to ethanol-induced fatty liver in mice［J］.J Clin Invest，2009，119 （3）：582-94.

［4］ Mori K，Hiraoka O，Ikeda M，et al.Adenosine kinase is a key determinant for the anti-HCV activity of ribavirin［J］.Hepatology，2013，58（4）：1236-44.

［5］ Chan E S，Montesinos M C，F(xiàn)ernandez P，et al.Adenosine A2Areceptors play a role in the pathogenesis of hepatic cirrhosis ［J］.Br J Pharmacol，2006，148（8）：1144-55.

［6］ Alchera E，Tacchini L，Imarisio C，et al.Adenosine-dependent activation of hypoxia-inducible factor-1 induces late preconditioning in liver cells［J］.Hepatology，2008，48（1）：230-9.

［7］ McGill M R，Jaeschke H.Metabolism and disposition of acetaminophen：recent advances in relation to hepatotoxicity and diagnosis ［J］.Pharm Res，2013，30（9）：2174-87.

［8］ McGill M R，Sharpe M R，Jaeschke H，et al.The mechanism underlying acetaminophen-induced hepatotoxicity in humans and mice involves mitochondrial damage and nuclear DNA fragmentation［J］.J Clin Invest，2012，122（4）：1574-83.

［9］ Uzi D，Barda L，Scaiewicz V，et al.CHOP is a critical regulator of acetaminophen-induced hepatotoxicity［J］.J Hepatol，2013，59 （3）：495-503.

［10］Knodell R G，Ishak K G，Black W C，et al.Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis［J］.Hepatology，1981，1（5）：431-5.

［11］Zhang B，Nweze I，Lakshmanan J，et al.Activation of acyclic ampguanine exchange factor in hepatocytes decreases nitric oxide synthase expressio［J］.Shock，2013，39（1）：70-6.

［12］Favaro E，Granata R，Miceli I，et al.The ghrelin gene products and exendin-4 promote survival of human pancreatic islet endothelial cells in hyperglycaemic conditions，through phosphoinositide-3-kinase／Akt，extracellular signal-related kinase（ERK）1／2 and cAMP／protein kinase A（PKA）signalling pathways［J］.Diabetologia，2012，55（4）：1058-70.

［13］Sun X，He Y，Ma T T，et al.Participation of miR-200a in TGF-β1-mediated hepatic stellate cell activation［J］.Mol Cell Biochem，2014，388（1-2）：11-23.

［14］Craig J C，Schumacher M A，Mansoor S E，et al.Consensus and variant cAMP-regulated enhancers have distinct CREB-binding properties［J］.J Biol Chem，2001，276（15）：11719-28.

Effect of adenosine receptors and cAMP-PKA signaling pathway mediated by adenosine receptors in the model of paracetamol-induced hepatotoxicity

Zhao Han，Ding Liping，Lv Xiongwen，et al
（College of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

AbstractObjective To explore the effect of adenosine receptors and cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A（cAMP-PKA）signaling pathway mediated by adenosine receptors in the model of paracetamol-induced hepatotoxicity.Methods Thirty male Kunming mice were randomly divided into normal control group and model group.Model group was treated with paracetamol 500 mg／kg and control group was treated with the same of concentration normal saline by intragastric administration，respectively.The mice were killed after 24 hours.Serum AST，ALT，ALP，TBA were measured.The histological analysis was performed by HE staining.Hepatocytes were extracted and purified from mice in the liver，followed by the method of in situ perfusion.The expression levels of adenosine A1 receptor（A1R），adenosine A2A receptor（A2AR），adenosine A2B receptor（A2BR）and adenosine A3 receptor（A3R）were detected using qRT-PCR and Western blot.The expression levels of cAMP，PKA and phosphorylation-cAMP response element bonding protein（p-CREB）were detected using ELISA and Western blot，respectively.Results The expression levels of AST，ALT，ALP，TBA in model group were much higher than the normal control group（P＜0.01）.The mRNA and protein levels of A1R and A2AR expressed in the mod-

el group were obviously higher than the normal control group（P＜0.01），and the cAMP level in the model group was more than in the normal control group（P＜0.01）.The protein levels of PKA and p-CREB expressed in the model group were higher than the normal control group.Conclusion Paracetamol-induced hepatotoxicity may be involved with the cAMP-PKA signaling pathway.

Key wordsparacetamol；hepatotoxicity；adenosine receptors

作者簡介：趙 晗，女，碩士研究生；呂雄文，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：lxw31288＠aliyun.com

基金項目：國家自然科學基金項目（編號：81270498）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（編號：201410366043）

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0616-05

中圖分類號R 961；R 965.2