TGF-β1和EGFP體外電轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實驗研究

文劍明，王銳英，高 燕，胡譯文，陶 波，周文靜

TGF-β1和EGFP體外電轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實驗研究

文劍明1，王銳英1，高 燕2，胡譯文1，陶 波1，周文靜1

摘要目的 通過電轉(zhuǎn)染介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），觀察Ⅱ型膠原表達(dá)的情況。方法 用全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)兔BMSCs；誘導(dǎo)14 d后，免疫組化和Western blot法檢測Ⅱ型膠原表達(dá)。結(jié)果 BMSCs CD90表達(dá)陽性，CD31表達(dá)陰性；成功轉(zhuǎn)染TGF-β1至BMSCs；通過免疫組化及Western blot法檢測TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原有較強(qiáng)的表達(dá)，與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）組和空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。結(jié)論 電轉(zhuǎn)TGF-β1質(zhì)粒至兔BMSCs，可以促進(jìn)Ⅱ型膠原表達(dá)。

關(guān)鍵詞TGF-β1；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；電轉(zhuǎn)染；Ⅱ型膠原

2015-02-20接收

作者單位：1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨二科，桂林 541000

2桂林醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院外科護(hù)理教研室，桂林 541000

椎間盤退行性變在現(xiàn)實生活中是一種常見而棘手的疾病，給患者帶來巨大的痛苦，同時也讓家庭承受沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，但是目前尚無有效的方法可以根治這一病癥。椎間盤退行性變的始動因素就是髓核細(xì)胞發(fā)生退變，由于髓核細(xì)胞數(shù)量有限，發(fā)生退變后自身修復(fù)和增殖困難。目前干細(xì)胞治療退變椎間盤已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)［1-2］。該實驗在電轉(zhuǎn)染介導(dǎo)下，將轉(zhuǎn)化生長因子β1／增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（tansformating growth factor betal／enhanced green fluorescent protein，TGF-β1／EGFP）導(dǎo)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）中，由于細(xì)胞內(nèi)的TGF-β1基因能高效表達(dá)，并能持續(xù)分泌TGF-β1目的蛋白，誘導(dǎo)BMSCs向類髓核細(xì)胞方向分化，從而為修復(fù)退變的椎間盤提供種子細(xì)胞。

1　材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑儀器 健康雄性新西蘭大白兔1只，2周齡，清潔級，約250 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基和胰蛋白酶（美國HyClone公司）；混合質(zhì)粒TGF-β1／EGFP（美國Sigma公司）；兔抗人Ⅱ型膠原蛋白單克隆抗體（武漢博士德公司）；流式一抗小鼠抗兔CD90（美國Abcam公司）；CD31（美國Antigenix公司）；同型對照小鼠抗兔IgG1 K（美國eBioscien公司）；流式二抗PerCP標(biāo)記（美國jackson公司）；二抗免疫組織化學(xué)染色試劑盒、二抗FITC標(biāo)記IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；FACSAriaTMⅢ流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；倒置相差顯微鏡、正置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；CO2孵箱（美國Thermo公司）。

1.2 BMSCs的取出、培養(yǎng)及鑒定 麻醉后處死兔子，取兔兩邊的股骨、脛骨和肱骨，從兩邊干骺端剪斷，剔除肌肉，移至培養(yǎng)皿中，吸取培養(yǎng)液沖洗股骨干髓腔，取沖洗液置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用BMSCs貼壁的特性，48 h后首次換液，以后每2 d換液1

次。細(xì)胞達(dá)80%及以上融合后，用胰蛋白酶消化傳代，重復(fù)上述培養(yǎng)方法進(jìn)行傳代后的細(xì)胞培養(yǎng)。

收獲第5代BMSCs，胰酶消化，1 500 r／min離心5 min，PBS重懸細(xì)胞；分別加一抗鼠抗兔CD90、CD31，4℃避光保存30 min；PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞，加入相應(yīng)二抗山羊抗小鼠PerCP標(biāo)記單克隆抗體，4℃避光放置30 min；加PBS洗滌3次，PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

1.3 電轉(zhuǎn)染 質(zhì)粒比例配置：TGF-β1和EGFP各取10 μl。ECM830電穿儀電轉(zhuǎn)參數(shù)：電壓540 V，脈寬30 μs，脈沖數(shù)3次，脈沖間隔時間1 000 ms。電穿孔緩沖液：272 mmol／L蔗糖，7 mmol／L K2HPO4，1 mmol／L MgCl2，pH值為7.4的等滲溶液90 μl。收集第5代細(xì)胞與質(zhì)粒TGF-β1／EGFP和電轉(zhuǎn)液加入到電轉(zhuǎn)杯中充分懸浮，于電轉(zhuǎn)槽中完成電轉(zhuǎn)后繼續(xù)培養(yǎng)，于轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染TGF-β1／EGFP的BMSCs綠色熒光蛋白的表達(dá)。

1.4 免疫組化分析 取TGF-β1／EGFP轉(zhuǎn)染14 d后的細(xì)胞消化后爬片、4%多聚甲醛固定，按SP免疫組化試劑盒進(jìn)行操作，DAB顯色、封片、倒置顯微鏡觀察，空質(zhì)粒組及未轉(zhuǎn)染組作對照。

1.5 Western blot法測定Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)收集轉(zhuǎn)染14 d后的細(xì)胞，用裂解液提取蛋白；用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；上樣、煮沸10 min，離心10 s，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（10%SDS-PAGE）分離；常規(guī)轉(zhuǎn)膜，90 A電流轉(zhuǎn)印50 min；4℃孵育過夜；使用一抗稀釋液按比例稀釋一抗（兔抗人Ⅱ型膠原蛋白單克隆抗體），搖床中搖蕩1 h，以封閉液按比例稀釋二抗（辣根酶標(biāo)記抗體），搖床中搖蕩1 h；加TBST后在搖床中搖蕩各洗滌3次，每次10 min；ECL發(fā)光液（A液200 μl：B液200 μl）室溫中孵育1 min，暗室中膠片曝光5 min，取同樣數(shù)量的EGFP組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞蛋白作為對照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，計量資料均以±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗。

2　結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察 原代培養(yǎng)BMSCs 48 h換液后大量細(xì)胞貼壁生長，傳代細(xì)胞呈梭形，漩渦狀排列。見圖1。

2.2 BMSCs的鑒定 本實驗培養(yǎng)的兔第5代BMSCs的CD90陽性率為99.2%，CD31陽性率為0.5%，說明大多數(shù)細(xì)胞表面表達(dá)CD90分子；而CD31表達(dá)陰性，符合實驗要求。見圖2。

2.3 熒光顯微鏡觀察BMSCs轉(zhuǎn)染效果 在顯微鏡下觀察質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，可見大量轉(zhuǎn)染TGF-β1／EGFP的BMSCs綠色熒光蛋白的表達(dá)，計算細(xì)胞轉(zhuǎn)染率約為70%～80%，見圖3。

2.4 Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色及光密度值 免疫組化結(jié)果顯示TGF-β1組細(xì)胞呈多邊形，胞核清晰，胞質(zhì)呈棕褐色。EGFP組及空白對照組未見明顯棕褐色。見圖4。用IPP圖像分析軟件半定量測定各組Ⅱ型膠原蛋白含量［以染色平均吸光度（optical density，OD）值表示］。結(jié)果顯示TGF-β1組免疫組化平均光密度值（0.487 0±0.018 1）與EGFP組（0.085 8±0.009 7）及空白對照組（0.080 5± 0.009 8）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝1 916.510，P ＜0.05）；EGFP組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 Western blot法檢測Ⅱ型膠原表達(dá) 分別提取轉(zhuǎn)染14 d后及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞蛋白，Western blot法檢測到在相對分子質(zhì)量約140 ku處有一陽性條帶，見圖5。SensiAnsys凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，TGF-β1組Ⅱ型膠原表達(dá)（0.450 0±0.106 7）與EGFP組（0.201 2±0.007 4）及空白對照組（0.196 4±0.004 1）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝33.089，P ＜0.05）；EGFP組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3　討論

椎間盤退變的修復(fù)是臨床常見的難題之一，近年來隨著軟骨組織工程的發(fā)展為修復(fù)退變的椎間盤帶來了希望，在軟骨組織工程中利用外源基因轉(zhuǎn)染種子細(xì)胞并使其高效表達(dá)，誘導(dǎo)靶細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。目前，主要的轉(zhuǎn)染方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒轉(zhuǎn)染和物理轉(zhuǎn)染方法等。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率低，病毒轉(zhuǎn)染效率高，對細(xì)胞毒性也高。物理轉(zhuǎn)染方法在組織工程的TGF-β1基因轉(zhuǎn)染應(yīng)用中少見相關(guān)報道［3］。理想的種子細(xì)胞應(yīng)具有取材方便，對機(jī)體損傷小，在體外容易培養(yǎng)擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)。組織工程中常用的有BMSCs、脂肪間干細(xì)胞、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞等，其中BMSCs應(yīng)用最廣泛。

BMSCs是一類存在于髓腔內(nèi)、具有自我更新、增殖和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，是目前應(yīng)用較廣泛的骨組織工程的重要種子細(xì)胞之一［4］。原代培養(yǎng)的BMSCs雜質(zhì)較多，形態(tài)不一，接種2 d后可見較多的梭形細(xì)胞排列生長，隨后細(xì)胞長滿時，呈漩渦狀生長。細(xì)胞表面標(biāo)記CD90表達(dá)陽性，CD31表達(dá)陰性可初步判斷為兔BMSCs［5-6］。

Ⅱ型膠原是軟骨組織中重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，在軟骨中占大部分比例，是髓核細(xì)胞的特異性標(biāo)志物之一［7］。本實驗BMSCs經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Ⅱ型膠原蛋白含量較未誘導(dǎo)組明顯提高。結(jié)果證明經(jīng)誘導(dǎo)后BMSCs成功向類髓核細(xì)胞分化。

適當(dāng)濃度的TGF-β1能刺激軟骨細(xì)胞增殖、分裂和分化，故目前是軟骨組織工程研究中首選生長因子［8］，大量研究［9］結(jié)果表明，在低氧環(huán)境及TGF-β1存在的條件下，具有能誘導(dǎo)BMSCs向類髓核細(xì)胞方向分化的作用，具有取材方便、便于保存、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)。TGF-β家族的傳導(dǎo)通路主要是Smad蛋白［10］，可增強(qiáng)膠原、細(xì)胞黏附蛋白的表達(dá)。Smad-3為Smad基因家族成員，其基因產(chǎn)物是TGF-β信號通道中的細(xì)胞質(zhì)成分，具有MH1、MH2和L區(qū)3個功能域［11］，TGF-β1激活的Smad-3能抑制基質(zhì)降解酶，誘導(dǎo)膠原蛋白表達(dá)，促進(jìn)軟骨基質(zhì)的合成［12］。

單純應(yīng)用生長因子誘導(dǎo)細(xì)胞，需要不斷添加生長因子，存在持續(xù)時間短、效率低、成本高的缺點(diǎn)；轉(zhuǎn)基因技術(shù)可將多種軟骨生長因子導(dǎo)入細(xì)胞，具有廣闊應(yīng)用前景［13］。電轉(zhuǎn)染的原理是通過高強(qiáng)度電場的作用，瞬時增加細(xì)胞膜的通透性，從而使細(xì)胞周圍外源分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；具有較高的轉(zhuǎn)染效率，適用范圍廣，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞可繼續(xù)培養(yǎng)不影響細(xì)胞增殖速度；此外，不需要構(gòu)建基因載體，對細(xì)胞無毒性。有研究［14］表明電轉(zhuǎn)染不影響細(xì)胞的生物學(xué)特性。

本實驗利用電轉(zhuǎn)染介導(dǎo)TGF-β1和EGFP體外轉(zhuǎn)染BMSCs，其中EGFP作為報告基因，因此只要出現(xiàn)熒光就說明TGF-β1在細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)TGF-β1轉(zhuǎn)染后，免疫組化示BMSCs胞質(zhì)呈陽性表達(dá)，Western blot檢測結(jié)果示Ⅱ型膠原能高效表達(dá)。因此根據(jù)實驗結(jié)果可認(rèn)為，電轉(zhuǎn)染介導(dǎo)TGF-β1和EGFP基因轉(zhuǎn)染BMSCs可使TGF-β1目的基因在細(xì)胞內(nèi)能持續(xù)高

效表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)BMSCs向類髓核細(xì)胞方向分化。

通過本次實驗結(jié)果可知，利用電轉(zhuǎn)染可將TGF-β1和EGFP基因高效導(dǎo)入BMSCs中，成功誘導(dǎo)為類髓核細(xì)胞，表達(dá)Ⅱ型膠原，有望成為軟骨組織工程中理想的種子細(xì)胞，從而為椎間盤退行性變化的治療奠定基礎(chǔ)。至于TGF-β1轉(zhuǎn)染BMSCs植入體內(nèi)后，目的基因是否還能持續(xù)高效的表達(dá)，并誘導(dǎo)成類髓核細(xì)胞、修復(fù)退變的椎間盤等問題尚需進(jìn)一步研究。

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TGF-β1 and EGFP electropration on rabbit bone marrow derived mesenchymal stem cells in vitro

Wen Jianming1，Wang Ruiying1，Gao Yan2，et al
（1Dept of Orthopedics，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541000；2Dept of Surgical Nursing，Nursed Faculty of Guilin Medical University，Guilin 541000）

AbstractObjective To observe cases of typeⅡcollagen expression after transforming growth factor-β1（TGF-β1）infected in rabbit bone mesenchymal stem cells（BMSCs）by electropration.Methods BMSCs from rabbit were isolated and cultured.14 days after induction，immunohistochemistry and Western blot methods typeⅡcollagen were used to detect the expression of typeⅡcollagen.Results CD90 was positive and CD31 was negative by flow cytometry；successfully transfected with TGF-β1 to the BMSCs，the strong expression of typeⅡcollagen in TGF-β1 group cells was shown by Western blot and immunocy-tochemical stain，which was compared with empty plasmid group and the control group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion TGF-β1 plasmid by electroporation to rabbit BMSCs can facilitate expression of collagenⅡ.

Key wordstransforming growth factor beta 1；mesenchymal stem cells；electropration；collagenⅡ

作者簡介：文劍明，男，碩士研究生；王銳英，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：rywang＠glmc.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31260233）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0581-04

中圖分類號R 682.3