化學合成microRNA-21 inhibitors對大鼠心肌成纖維細胞活化增殖的影響

張 猛，陶 輝，陳澤文，張家貴，宣海洋，占紅英，石開虎

化學合成microRNA-21 inhibitors對大鼠心肌成纖維細胞活化增殖的影響

張 猛1，2，陶 輝1，2，陳澤文1，2，張家貴1，2，宣海洋1，2，占紅英1，2，石開虎1，2

摘要目的 探究microRNA-21 inhibitors對大鼠心肌成纖維細胞活化增殖的影響。方法 應用LipofectamineTM2000 Reagent向大鼠心肌成纖維細胞瞬時轉染microRNA-21 inhibitors 24、48 h后，實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測microRNA-21、I型膠原前膠原A1（Col1A1）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達水平；Western blot法檢測Col1A1 和α-SMA的表達水平；MTT法檢測microRNA-21 inhibitors對心肌成纖維細胞活化增殖的影響。結果 轉染microRNA-21 inhibitors的心肌成纖維細胞中，microRNA-21表達下調，Col1A1和α-SMA的表達下降；轉染microRNA-21 inhibitors的心肌成纖維細胞增殖活性明顯減弱。結論 microRNA-21 inhibitors可明顯抑制心肌成纖維細胞增殖活性，提示microRNA-21是心肌成纖維細胞活化增殖的潛在靶向分子，有利于為干預和預防心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展提供新思路。

關鍵詞microRNA-21；心肌成纖維細胞；Col1A1；α-平滑肌肌動蛋白

2015-02-02接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院心胸外科，合肥 230601

2安徽醫(yī)科大學心血管病研究中心，合肥 230601

心肌纖維化是指心肌細胞外基質中膠原纖維過量積聚、膠原含量顯著升高或膠原成分發(fā)生改變的病理過程，是心肌重構的一個重要特征［1-2］。心肌成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）是心肌間質的主要構成細胞，其增殖、活化及表型轉換為肌成纖維細胞并合成分泌大量膠原纖維蛋白。CFs的活化增殖是心肌纖維化的關鍵環(huán)節(jié)。microRNA是一類內源性、非編碼、單鏈RNA，參與心血管系統(tǒng)的生理及多種病理過程。microRNA-21在心臟中表達豐富，而且其生理功能與心肌纖維化密切相關。microRNA-21在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要的調節(jié)作用［3］。盡管國內外學者對心肌纖維化和microRNA-21進行了大量研究，但CFs中microRNA-21的確切作用機制尚不完全清楚。該實驗以體外培養(yǎng)的CFs為研究對象，通過觀察microRNA-21 inhibitors轉染后CFs的增殖影響、I型膠原前膠原A1（collagen type I alpha 1，Col1A1）及CFs表型轉換為肌成纖維細胞的標志性蛋白α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達變化，為心肌纖維化、心臟重構提供新的參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD乳鼠30只，出生1～3 d，8～9 g，清潔級，購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、MTT相關試劑（Sigma公司，美國）；胎牛血清（Gibco公司，英國）；LipofectamineTM2000 Reagent、TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）；microRNA-21 inhibitors、EzOmics miRNA qPCR Detection Primer試劑盒、EzOmics One-Step qPCR試劑盒（Biomic公司，美國）；ThermoScript RT-PCR試劑盒（Fermentas公司，美國）；Western blot法相關一抗（Bioworld Technology公司，美國）、相關二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，中國）；轉化生長因子-β（TGF-β）（Peprotech，美國）。

1.1.3 主要儀器 NAPCO-6100型細胞培養(yǎng)箱（SHELLAB公司，美國）；SW-CJ-IF型超凈工作臺（蘇州泰安空氣技術有限公司，中國）；Sigma3-16K高速離心機（Sigma公司，美國）；7800型PCR反應擴增儀（ABI公司，美國）；Western blot法相關設備（Biorad公司，美國）；MK3酶標儀（雷勃公司，荷蘭）。

1.2 方法

1.2.1 CFs的提取與培養(yǎng) 將SD乳鼠浸泡于75°酒精消毒并處死，在無菌操作臺上剪取心尖組織，剪碎并用1.25%胰蛋白酶消化分離細胞，所得全部細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60～90 min，差速貼壁法除去心肌細胞，剩下的細胞即為CFs。繼續(xù)培養(yǎng)

細胞至匯合狀態(tài)，采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取2～4代細胞用于實驗，在倒置顯微鏡下觀察到可被免疫組化纖維黏連蛋白染色變?yōu)殛栃哉呒磋b定為CFs。

1.2.2 實驗分組 實驗組：瞬時轉染microRNA-21 inhibitors后的CFs；陰性對照組：瞬時轉染microRNA-21 inhibitors陰性對照后的CFs；空白對照組：以等量的生理鹽水代替microRNA-21 inhibitors，瞬時轉染CFs。

1.2.3 瞬時轉染microRNA-21 inhibitors 取對數(shù)生長期CFs進行轉染。轉染前1 d，將各組CFs細胞計數(shù)后，接種于24孔板，用無血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液稀釋待轉染。成熟引物microRNA-21 inhibitors及其陰性對照由Biomic生物技術公司設計并合成。miRNA-21 inhibitor的引物序列：5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′。將miRNA-21 inhibitors及其陰性對照與脂質體LipofectamineTM2000 Reagent混勻，室溫靜置20 min后，加入相應各孔細胞中，37℃、5%CO2保溫箱孵育4～6 h，更換含血清DMEM并用濃度為10 ng／ml的生長刺激因子TGF-β刺激細胞生長，24、48 h提取轉染后細胞的總RNA。

1.2.4 總RNA提取和一步法qRT-PCR檢測microRNA-21 檢測轉染后各組CFs中的microRNA-21含量，用ABI RT-PCR系統(tǒng)進行qRT-PCR檢測。采用TRIzol并根據(jù)操作手冊一步法抽提細胞總RNA，紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度，通過計算吸光度（absorbance，A）A260／A280的比值了解其純度，選取比值在1.8～2.0的RNA樣品進行試驗。采用EzOmics miRNA qPCR Detection Primer試劑盒與EzOmics One-Step qPCR試劑盒并參照操作手冊檢測microRNA-21。反應條件：42℃30 min、95 ℃10 min，接著95℃20 s、62℃30 s、72℃30 s共40個循環(huán)的擴增階段條件；95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s的溶解曲線階段條件。以U6作為內參，用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達水平。

1.2.5 定量RT-PCR檢測Col1A1和α-SMA mRNA表達 各組總RNA用ThermoScript RT-PCR試劑盒并參照操作手冊逆轉錄合成cDNA，然后進行qRTPCR檢測。從GenBank中查找引物序列并設計合成相應引物。α-SMA引物序列：F：5′-TGGCCACTGCTGCTTCCTCTTCTT-3′，R：5′-GGGGCCAGCTTCGTCATACTCCT-3′；Col1A1引物序列：F：5′-TAACTTCTGGACTATTTGCGGACTTTTTGG-3′，R：5′-GTCCAGCCCTCATCCTGGCC-3′；β-actin引物序列：F：5′-ACGGTCAGGTCATCACTATC-3′，R：5′-ACTGTGTTGGCATAGAGGTC-3′。反應條件：50℃2 min、95℃10 min，接著95℃20 s、60℃30 s、72℃30 s 共40個循環(huán)的擴增階段條件；95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s的溶解曲線階段條件。以β-actin作為內參，用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達水平。

1.2.6 Western blot法檢測Col1A1和α-SMA蛋白表達 將提取的各組細胞蛋白定量，然后通過SDSPAGE電泳分離，轉移至PVDF膜上，轉膜后封閉2 h，加入Col1A1、α-SMA和β-actin一抗孵育過夜，然后加入Col1A1、α-SMA和β-actin二抗孵育1 h，化學發(fā)光法顯示蛋白條帶，膠片顯影、定影。成像結果采用Quantity One V 4.6軟件分析，測定主帶的吸光度值以計算Col1A1、α-SMA蛋白表達水平。

1.2.7 MTT比色法檢測細胞增殖 將處于對數(shù)生長期的各組CFs胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基重懸形成細胞懸液。用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)。調整細胞密度為1 500個／孔，鋪于96孔板中，每組5個復孔，每孔100 μl，共5張96孔板，連續(xù)監(jiān)測5 d，鋪板過程中要確保每孔加入細胞數(shù)一致。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從鋪板后第2天開始，培養(yǎng)終止前4 h每孔加入10 μl 5 g／L的MTT，無需換液，4 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO終止反應，振蕩器震蕩5～10 min使結晶充分溶解，酶標儀490 nm處測定A值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，單變量兩組資料間的比較采用t檢驗。所有實驗數(shù)據(jù)分析至少重復3次。

2　結果

2.1 瞬時轉染microRNA-21 inhibitors對microRNA-21表達的影響 瞬時轉染CFs microRNA-21 inhibitors 48 h后，實驗組microRNA-21表達明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t＝14.384，P＜0.01；t＝15.290，P＜0.01）。見圖1。

2.2 瞬時轉染microRNA-21 inhibitors對Col1A1 和α-SMA mRNA表達的影響 瞬時轉染CFs microRNA-21 inhibitors 48 h后，實驗組Col1A1和α-SMA mRNA表達明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（Col1A1：實驗組vs空白對照組：t＝13.694，P＜0.01；實驗組vs陰性對照組：t＝14.571，P＜0.01；α-SMA：實驗組vs空白對照組：t＝5.869，P＜0.01；實驗組vs陰性對照組：t＝7.286，P

＜0.01）。見圖2。

2.3 瞬時轉染microRNA-21 inhibitors對Col1A1 和α-SMA蛋白表達的影響 瞬時轉染CFs microRNA-21 inhibitors 48 h后，實驗組Col1A1和α-SMA蛋白表達明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（Col1A1：實驗組vs空白對照組：t＝6.274，P＜0.01；實驗組vs陰性對照組：t＝7.893，P ＜0.01；α-SMA：實驗組vs空白對照組：t＝5.869，P ＜0.01；實驗組vs陰性對照組：t＝14.131，P＜0.01）。見圖3。

2.4 MTT法檢測轉染后CFs的細胞活力 MTT法實驗結果顯示，瞬時轉染CFs microRNA-21 inhibitors 24、48 h后，實驗組細胞活力明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（Col1A1：實驗組vs空白對照組：t＝3.764，P＜0.01；實驗組vs陰性對照組：t＝5.645，P＜0.01；α-SMA：實驗組vs空白對照組：t＝3.811，P＜0.01；實驗組vs陰性對照組：t＝4.503，P＜0.01）。見圖4。

3　討論

CFs是心臟組織中數(shù)目最多的細胞，遍布于心肌組織，包繞心肌細胞并連接細胞間質，是心肌纖維化的主要效應細胞，其過度活化增殖，可分泌大量的膠原纖維，在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵性作用［4-5］。CFs是合成和分泌心肌細胞外基質的主要細胞，受刺激后活化，發(fā)生表型和功能的改變，轉換為表達α-SMA的肌成纖維細胞，且過度增殖并積聚大量的細胞外基質，如Col1A1等［6-7］。因此，心肌纖維化主要通過CFs活化增殖并促進

Col1A1和α-SMA等的過度表達，使細胞外間質膠原纖維沉積、膠原含量顯著上升，導致纖維化形成。

文獻［8-9］報道，microRNA在心臟結構重構進程中，尤其是在心肌纖維化的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。有許多microRNA可能發(fā)揮調控心肌纖維化的作用，已經證實的有microRNA-21、microRNA-29、microRNA-133、microRNA-30和microRNA-590等［10］。microRNA-21在心肌纖維化中有關鍵作用，與心肌纖維化聯(lián)系密切。Thum et al［11-12］發(fā)現(xiàn)，microRNA-21在心肌纖維化中表達升高，上調microRNA-21可以刺激EPK-MAP信號傳導通路，誘導成纖維細胞的增殖和心肌纖維化。Roy et al［13］證明，在大鼠心肌缺血再灌注模型中，microRNA-21在心肌纖維化和結構重構中起關鍵作用。microRNA-21之所以能夠引起心肌纖維化是因為它與CFs有相關關系。研究［3］表明microRNA-21可以抑制CFs的凋亡，引起心肌肥大和心肌纖維化的發(fā)生。microRNA-21 inhibitors是microRNA-21的抑制劑，其在CFs活化增殖過程中的具體作用機制尚不完全清楚。本研究用microRNA-21 inhibitors轉染體外培養(yǎng)的新生乳鼠CFs，檢測轉染后CFs的增殖變化以及Col1A1和α-SMA的表達水平。結果表明microRNA-21 inhibitors可明顯抑制CFs的增殖活性，降低Col1A1和α-SMA的表達水平。

綜上所述，microRNA-21 inhibitors轉染CFs后，microRNA-21表達下降，而CFs中microRNA-21的低表達可以抑制其活化增殖，抑制心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，表明microRNA-21是CFs活化增殖的潛在靶向分子，可以為干預和預防心肌纖維化提供新思路。

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The effect of microRNA-21 inhibitors on proliferation and activation of cardiac fibroblasts in rats

Zhang Meng1，2，Tao Hui1，2，Chen Zewen1，2，et al
（1Dept of Cardio-Thoracic Surgery，The Second Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601；2Dept of Cardiovascular Disease Research Center，Anhui Medical University，Hefei 230601）

AbstractObjective To investigate the effect of microRNA-21 inhibitors on proliferation and activation of cardiac fibroblasts in rats.Methods LipofectamineTM2000 Reagent was used to transfected cardiac fibroblasts with microRNA-21 inhibitors.After 24，48 h，qRT-PCR was applied to assess the expressions of microRNA-21 and mRNA

of Col1A1 and α-SMA.The protein expression levels of Col1A1 and α-SMA were detected by Western blot.MTT assay was used to determine the proliferation influence of the transfected cardiac fibroblasts.Results The cardiac fibroblasts transfected microRNA-21 inhibitors exhibited down-regulated microRNA-21 expression and attenuated Col1A1 and α-SMA mRNA expression.The cardiac fibroblasts proliferation activity decreased significantly after transfected microRNA-21 inhibitors.Conclusion MicroRNA-21 inhibitors can suppress the proliferation activity of cardiac fibroblasts significantly，implicating microRNA-21 as a potential target for cardiac fibroblasts activation and proliferation and pointing out that this result can provide a new idea for intervening and preventing the myocardial fibrosis occurrence and development.

Key wordsmicroRNA-21；cardiac fibroblasts；Col1A1；α-SMA；Western blot

作者簡介：張 猛，男，碩士研究生；石開虎，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：shikaihu ＠gmail.com

基金項目：安徽省自然科學基金項目（編號：1308085MH117、1408085MH175）；安徽高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2011A175、KJ2012Z164）

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0577-05

中圖分類號R 542.23