實驗大鼠顱眶聯(lián)合損傷后依達拉奉對其視神經的保護作用

高 晨，荔志云，賈 平，張景科蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院安寧分院腦外科，蘭州 70070；蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經外科，蘭州7000;蘭州大學醫(yī)學實驗動物中心，蘭州 70000

實驗大鼠顱眶聯(lián)合損傷后依達拉奉對其視神經的保護作用

高 晨1，荔志云2，賈 平1，張景科3
1蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院安寧分院腦外科，蘭州 730070；2蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經外科，蘭州730030;3蘭州大學醫(yī)學實驗動物中心，蘭州 730000

目的：探討實驗性大鼠顱眶聯(lián)合損傷（cranio-orbital injury，COI）后視神經損傷機制及依達拉奉的保護作用。方法：144只清潔級SD大鼠，雌雄各半，隨機分為對照組、損傷組和治療組，每組48只。損傷組和治療組大鼠利用液壓沖擊顱腦損傷儀建立顱眶聯(lián)合傷模型，治療組造模以后腹腔注射依達拉奉30 mg·kg-1，每日2次，共14日。3組分別在造模后3、6、10、14 d取視網膜組織，檢測視網膜神經節(jié)細胞（retinal ganglion cells，RGCs）活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量及不同時間點RGCs凋亡率，光鏡下觀察視網膜HE染色微觀結構，共聚焦顯微鏡下觀察RGCs的TUNEL熒光標記凋亡情況。結果：造模后損傷組RGCs的ROS含量逐漸升高，第10天達到高峰，RGCs凋亡率變化趨勢與此相一致，與對照組及治療組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），治療組與對照組相比較無明顯差異。光鏡下?lián)p傷組視網膜結構紊亂，損傷組RGCs的TUNEL熒光標記陽性率明顯高于其余兩組。結論：COI后RGCs的ROS含量明顯升高，導致細胞出現(xiàn)凋亡失調。依達拉奉通過清除ROS逆轉這一病理過程，具有明確的視神經保護作用，值得臨床推廣。

依達拉奉；顱眶聯(lián)合損傷；視神經；活性氧；凋亡

顱眶聯(lián)合損傷（cranio-orbital injury，COI）發(fā)生率占顱腦損傷的0.3%～5.2%[1]，其顱腦損傷合并視神經損傷的臨床特點決定了救治的關鍵在于傷后視神經功能的保護[2-3]。傷后視功能損害的病理機制之一是活性氧簇 （reactive oxygen species，ROS）爆發(fā)引起的視網膜神經節(jié)細胞（retinal ganglion cells，RGCs）的凋亡失調[2，4]。因此，抑制ROS成為治療視神經損傷的有效途徑。新型自由基清除劑依達拉奉已廣泛應用于臨床氧化應激性損傷的救治。本研究將依達拉奉應用于COI動物模型的治療中，通過RGCs內ROS含量測定，RGCs凋亡率檢測以及視網膜微觀、RGCs超微結構的觀察，探討依達拉奉對顱眶聯(lián)合損傷后RGCs的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 健康成年清潔級Sprague-Dawley大鼠144只，購自蘭州大學醫(yī)學實驗動物中心[SCXK（甘）-0016]；室溫飼養(yǎng)，相對濕度55%～75%，維持12 h光照，自由攝食飲水。

納入標準：體重230～250 g，雌雄兼用；健康無眼疾；雙眼瞳孔直接對光反射和間接對光反射正常。

隨機分為3組：對照組、損傷組和治療組，每組48只。分別于造模后3、6、10、14 d取材。動物實驗經過醫(yī)院倫理委員會書面同意，具備動物實驗資格。1.1.2 主要試劑及儀器 DCFH-DA試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所；AnnexinV異硫氰酸熒光素 （fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）試劑盒購自Pharmingen公司；TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）檢測試劑盒購自美國Promega公司；依達拉奉注射液 （Edaravone，MCI-186）購自南京先聲東元制藥有限公司（批號：80-051007）。

實驗設備均由蘭州大學醫(yī)學實驗中心提供：液壓沖擊顱腦損傷儀 （fluid percussion brain injury device，F(xiàn)PI）（天津市神經病學研究所）；熒光顯微鏡（日本Olympus-AX80）；流式細胞儀 （美國Beck-man-Coulter Epics XL-4型）；激光共聚焦顯微鏡（德國Leica TCS SP2）；透射電鏡（日本電子公司JEM-1230）。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠COI模型[5]利用FPI建立損傷組和治療組大鼠COI模型。平均打擊力量為（6.9±0.6）atm（1 atm=101.322 kPa）。術后2 d傷眼出現(xiàn)Mar-cus-gun瞳孔，眼球無明顯突出，眼瞼閉合完全且直接檢眼鏡觀察眼底無明顯出血者為成功模型。造模后大鼠均存活2周以上。對照組大鼠始終正常飼養(yǎng)。1.2.2 依達拉奉干預治療 根據(jù)藥品說明書，利用滅菌生理鹽水將依達拉奉配制成0.9 g·L-1溶液，治療組大鼠在造模后立即以30 mg·kg-1劑量腹腔注射依達拉奉[6]，12h后重復給藥。此后依照此劑量持續(xù)腹腔給藥，每日2次，連續(xù)14日。給藥后大鼠正常飼養(yǎng)。1.2.3 ROS檢測[7]采用雙乙酸雙氯雙氫熒光素（CM-H2DCF-DA）法檢測RGCs內ROS含量。各組取3只大鼠，制作患側眼球RGCs單細胞懸液，每個樣品收集1.0×103個細胞。檢測2′，7′-二氯熒光素（DCF）熒光強度，間接測定細胞內活性氧水平。

1.2.4 細胞凋亡檢測[8]采用AnnexinV/PI雙染色法，通過流式細胞儀定量檢測RGCs的凋亡率。各組取3只大鼠，制作患側眼球RGCs單細胞懸液，調整待測細胞濃度為1×109/L，上機檢測。

采取末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）介導生物素標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP biotin nick end labelling，TUNEL）標記原位熒光法觀察視網膜切片RGCs凋亡情況。各組取3只大鼠患側眼球，10%中性甲醛固定24 h，棄去眼前節(jié)，取后極部視網膜，常規(guī)脫水，浸蠟，包埋，連續(xù)切片，片厚2.5 μm，常規(guī)脫蠟。用蛋白酶K孵育后滴加TUNEL反應混合液。孵育后在激光共聚焦顯微鏡下觀察視網膜結構，凋亡RGCs細胞核呈強綠色熒光。

1.2.5 視網膜切片HE染色及觀察[5]各組取3只大鼠患側眼球，制作患側眼球石蠟切片，蘇木素-伊紅染色，封片。光鏡下觀察視網膜微觀結構。

1.3 統(tǒng)計學方法

本研究數(shù)據(jù)資料采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示。樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組RGCs細胞內ROS檢測（見表1）

不同時間點損傷組大鼠RGCs的ROS含量均高于對照組及治療組大鼠，差異在傷后6 d后均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），第10天達到高峰108.3±15.6；治療組大鼠RGCs的ROS含量在損傷后呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，損傷后3 d時較對照組仍有輕度升高，但各時間點與對照組相比均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

2.2 各組RGCs細胞凋亡檢測（見表1、圖1）

損傷組大鼠 RGCs凋亡率在損傷后 3 d為（30.51±2.09）%，2周內均維持于30%～40%的高水平狀態(tài)，各時間點均高于對照組及治療組大鼠，差異均具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。治療組大鼠RGCs凋亡率2周內呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，損傷后14 d為（8.67±2.98）%，達到正常水平。各時間點治療組與對照組均無顯著差別。

表1 各組大鼠不同時間點RGCs的ROS含量及凋亡率（±s）

表1 各組大鼠不同時間點RGCs的ROS含量及凋亡率（±s）

觀察項目損傷組治療組對照組F值P值ROS含量（F480/F420）（%）傷后3 d 51.8±8.9 49.2±6.2 40.2±6.5 2.086 0.205傷后6 d 99.9±11.7 44.7±2.4*45.5±9.6*38.374 0.000傷后10 d 108.3±15.6 41.8±7.6*42.6±8.8*34.629 0.001傷后14 d 62.5±2.2 40.1±5.2*41.9±5.2*23.660 0.001 RGCs凋亡率（%）傷后3 d 30.51±2.09 13.19±3.11*7.50±0.33*91.296 0.000傷后6 d 35.55±1.36 10.65±2.44*8.34±0.64*248.318 0.000傷后10 d 38.22±4.01 9.26±6.42*9.51±1.22*106.446 0.000傷后14 d 32.32±1.35 8.67±2.98*8.42±0.83*148.890 0.000注：與損傷組比較*P＜0.05，n=3

激光共聚焦顯微鏡下觀察視網膜TUNEL熒光染色提示：在傷后各時間點，損傷組視網膜神經節(jié)細胞層（retinal ganglion layer，GCL）內強綠色熒光著染的異常凋亡RGCs均明顯多于對照組及治療組，損傷后10 d最為明顯。損傷后治療組GCL層內凋亡細胞呈逐漸減少趨勢，與對照組無明顯差別。對照組僅顯示少量正常凋亡RGCs。

2.3 視網膜微觀結構（見圖2）

光鏡下觀察視網膜HE染色微觀結構提示：對照組大鼠視網膜HE染色顯示正常結構。自外向內由3層細胞組成，分別為RGCs細胞層、雙極細胞層和感光細胞層。其中RGCs呈單層排列，卵圓形。按照細胞核大小分為兩類：一類大核淺染，核內有時可見核仁；另一類為小核深染，核內染色質分布均勻。細胞邊界清晰，呈條帶狀。雙極細胞層和感光細胞層呈多層排列，前者厚度約為后者2倍。在損傷后各時間點，損傷組大鼠視網膜整體結構均遭受破壞，損傷后10 d破壞程度最為明顯，表現(xiàn)為整體視網膜水腫增厚，RGCs數(shù)量明顯減少，且呈空泡變性，細胞核固縮，染色質分布不均勻，邊聚；細胞排列稀松紊亂，失去正常結構。治療組大鼠視網膜破壞程度較損傷組明顯減輕，RGCs數(shù)量略微減少，至損傷后14 d時已基本呈現(xiàn)為正常視網膜結構。

圖1 實驗10天各組大鼠視網膜TUNEL熒光染色情況

圖2 實驗第10天各組大鼠視網膜微觀結構

3 討 論

3.1 COI后視神經損傷特點及RGCs凋亡機制

顱眶聯(lián)合損傷后外力對視神經的沖擊或擠壓是造成視神經損傷的主要原因。Gross等[9]研究表明，施加到額骨的外力經傳導最終集中在視神經管的區(qū)域，加之視神經管的特殊解剖結構構成了顱腦損傷，是易致視神經損傷的病理基礎[1]。視神經損傷后，發(fā)生血管營養(yǎng)障礙，造成局部組織缺血、缺氧、水腫，反過來又加重局部缺血和軸索損傷，能否逆轉這一惡性循環(huán)決定著傷眼的視力預后[10]。

與視神經損傷有關的諸多眼科疾病的共同病理特征是RGCs的凋亡失調，最終導致視力障礙[11]?？偨Y已有研究表明，RGCs發(fā)生凋亡失調的機制包括：①視神經損傷后富含不飽和脂肪酸的RGCs軸索及細胞膜受到異常增多的ROS的攻擊而發(fā)生脂質過氧化反應，同時自由基可介導Ca2+超載及蛋白質損傷等途徑，誘導細胞凋亡；②由于神經損傷后軸漿運輸障礙，導致由上丘或外側膝狀體運輸至視網膜RGCs的神經營養(yǎng)因子等物質缺乏或減少；③損傷后細胞外液谷氨酸、天門冬氨酸等興奮性氨基酸毒性作用促進細胞外Ca2+內流，Ca2+的增加作為第二信使，激活其他誘發(fā)凋亡的物質，導致細胞凋亡[12-15]；④一氧化氮（nitric oxide，NO）作為神經毒素因子，參與神經系統(tǒng)的多種病理損傷過程，可介導神經元及膠質細胞的凋亡；⑤半胱氨酸蛋白酶（Caspase）是RGCs繼發(fā)性死亡的主要介質，Caspase抑制劑可以通過直接抑制凋亡和減少來自免疫系統(tǒng)的繼發(fā)性損害而減輕缺血對神經元的損害[16]。

3.2 RGCs的ROS含量測定以及凋亡檢測

RGCs凋亡失調的重要原因之一是ROS的損傷作用。外傷應激狀態(tài)下，ROS含量異常增多，通過活化死亡受體通路、線粒體凋亡通路、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun-terminal kinase，JNK）介導的凋亡信號通路以及破壞細胞內谷胱甘肽相關的氧化還原平衡等多種機制，引起細胞凋亡失調[7]。本研究采用CM-H2DCF-DA熒光法測定RGCs的ROS含量，可以間接反映損傷后視神經氧化性損傷的嚴重程度。檢測結果顯示：損傷組ROS水平始終高于治療組及對照組，傷后6 d即有統(tǒng)計學差異，10 d達到高峰（P＜0.05）。治療組ROS含量呈逐漸下降趨勢，與對照組無明顯統(tǒng)計學差異。實驗結果表明，依達拉奉通過清除組織內異常增多的ROS，有效抑制脂質過氧化反應，起到視神經保護作用。

本研究采用AnnexinV/PI雙染色法，通過流式細胞儀定量檢測了RGCs的凋亡情況，這是目前量化檢測凋亡細胞的可靠方法。同時通過熒光雙標的細胞滴片，在共聚焦顯微鏡下進行正常細胞、凋亡細胞及壞死細胞的形態(tài)學觀察。檢測結果提示：損傷組RGCs凋亡率在傷后3 d以后即維持于30%～40%的高點，與治療組及對照組均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。依達拉奉干預治療后3 d，RGCs凋亡率仍高于對照組近1倍，10 d后逐漸接近正常水平。細胞形態(tài)學觀察也印證了流式細胞檢測結果。另外，本研究進行了RGCs的電鏡超微結構對比觀察，鏡下?lián)p傷組大量RGCs表現(xiàn)出細胞核固縮，染色質邊集以及核膜內陷的凋亡特征，這是判斷細胞凋亡最經典、最可靠的佐證[17-18]。

凋亡檢測結果與RGCs的ROS含量變化互相印證，表明顱眶聯(lián)合損傷后由ROS爆發(fā)引起RGCs凋亡失調，進而導致視功能障礙。依達拉奉應用3 d后開始表現(xiàn)出視神經保護作用，10 d后保護最為明顯。

3.3 依達拉奉對COI后視神經的保護作用機制

近年來不少學者在神經細胞膜代謝研究中發(fā)現(xiàn)自由基的毒害作用，由此特別強調神經損傷中生物化學影響的重要性。因此，及早應用自由基清除劑對保護神經功能、改善預后業(yè)已成為神經損傷臨床救治的新思路。依達拉奉是一種新型的自由基清除劑，在體內正常解離常數(shù)下游離出一個質子，成為依達拉奉陰離子。現(xiàn)有研究表明，依達拉奉神經保護機制如下：①體內解離出的依達拉奉陰離子迅速與氧自由基的不配對電子配對，使自由基失去作用，從而阻斷自由基的連鎖反應[21]。②依達拉奉可有效清除具有毒性作用的羥基基團，通過抑制黃嘌呤氧化酶和次黃嘌呤氧化酶的活性，刺激前列環(huán)素的生成，減少炎癥介質白三烯產生，降低羥自由基的濃度[19-23]。③機體總抗氧化能力（TAOC）可作為多種神經系統(tǒng)疾病的預后指標[24-25]。依達拉奉激活機體的防御體系，增強TAOC，提高對抗缺血缺氧性改變的能力，減輕缺血再灌注損傷而起到保護作用。④依達拉奉可提高超氧化物歧化酶活性，減少丙二醛產生，抑制脂質過氧化，從而減輕神經細胞的氧化損傷[26]。⑤依達拉奉通過調控凋亡相關基因表達對實驗性視網膜脫離視神經細胞凋亡有明顯的抑制作用[27]。

本研究通過對顱眶聯(lián)合損傷大鼠的依達拉奉干預治療發(fā)現(xiàn)，依達拉奉可以有效清除RGCs內異常增多的ROS，減輕細胞損傷，逆轉凋亡失調，有效保護視神經功能。視神經損傷后RGCs凋亡是多因素作用的結果，依達拉奉作為高效的自由基清除劑，其視神經損傷早期保護作用的循證醫(yī)學依據(jù)有待于進一步深入研究，臨床應用前景值得期待。

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Protective Effects of Edaravone on the Optic Nerve after Experimental Cranio-orbital Injury in Rats

GAO Chen1,LI Zhi-yun2,JIA Pin1,ZHANG Jing-ke3
1Department of Neurosurgery,AnNing Branch Hospital,Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Com-mand,Lanzhou 730070,China;2Department of Neurosurgery,Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command,Lanzhou 730030,China;3Laboratory Animal Center of Lanzhou University,Lanzhou 730000,China

Objective:To investigate the mechanism of optic nerve injury and protective effects of edar-avone on rats with experimental cranio-orbital injury (COI).Methods:A total of 144 rats (clean grade) were randomly divided into control group,injury group and treatment group,with 48 rats in each group. The animal model of COI was established in the left eyes of rats of injury and treatment groups by a fluid percussion brain injury (FPI)device.Edaravone (30 mg·kg-1)diluted with normal saline was injected in-traperitoneally to the rats of treatment group after modeling every 12 hours for 14 days.Rat retina was ob-tained at 3,6,10 and 14 day,respectively,after injury,to check the content of reactive oxygen species (ROS)in retinal ganglion cells (RGCs)and the apoptosis rate of RGCs.The HE stained microstructure of RGCs was observed under an optical microscope.The TUNEL fluorescence labeled apoptosis of RGCs was observed under a laser confocal microscope.Results:The content of ROS as well as the apoptosis rate of RGCs increased gradually and reached maximum in 10 days after modeling in the injury group.There were statistically significant differences between the injury group and the other two groups (P＜0.05).The retina structure of the injury group was disorganized after injury.The positive rate of TUNEL fluorescence labeled RGCs in the injury group was significantly higher than the other two groups.Conclusion:The content of ROS in RGCs increased significantly after COI,resulted in apoptosis imbalance of RGCs.Edaravone pre-vents this pathological process by eliminating ROS and thus has a protective effect on optic nerve,which is worthy of clinical promotion.

Edaravone;Cranio-orbital injury;Retinal ganglion cells;Reactive oxygen species;Apoptosis

R965.1

A

1673-7806（2015）02-107-05

高晨，男，主治醫(yī)師，外科學博士。主要研究方向：顱腦損傷規(guī)范化診療 E-mail:gc2006418@163.com

2014-09-19

2014-11-27