銅離子急性脅迫對虎紋蛙肝臟中三羧酸循環(huán)及自由基代謝的影響

李 斌 黃 艷 邵 晨 王 宇

(浙江師范大學(xué)生態(tài)研究所, 金華 321004)

銅離子急性脅迫對虎紋蛙肝臟中三羧酸循環(huán)及自由基代謝的影響

李 斌 黃 艷 邵 晨 王 宇

(浙江師范大學(xué)生態(tài)研究所, 金華 321004)

為探明銅離子(Cu2+)對兩棲動物肝臟線粒體中三羧酸(Tricarboxyl acid, TCA)循環(huán)及自由基代謝的毒理作用, 采用靜水暴露實(shí)驗(yàn), 研究了 Cu2+不同濃度和不同暴露時(shí)間對虎紋蛙(Hoplobatrachus chinensis)肝臟線粒體中異檸檬酸脫氫酶(ICDHm)活性、α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)活性、抗超氧陰離子(anti-·O2–)活性、過氧化氫(H2O2)含量、抑制羥自由基(inhabit-·OH)活性、一氧化氮(NO)含量以及一氧化氮合成酶(NOS)活性的影響。暴露實(shí)驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)Cu2+濃度組(0.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/L), 分5個(gè)暴露時(shí)間(0、24h、48h、72h和96h)取材, 對每個(gè)濃度的不同暴露時(shí)間分別取6個(gè)樣本, 測定TCA循環(huán)及自由基代謝的相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示, 在TCA循環(huán)中隨著Cu2+濃度的增加和暴露時(shí)間的延長, 時(shí)間和濃度因素對ICDHm活性影響無顯著性交互作用(P＞0.05), 暴露時(shí)間的延長對 ICDHm 活性無顯著性影響(P＞0.05), 但隨著 Cu2+濃度的增加ICDHm 活性逐漸減小; 而時(shí)間和濃度因素對 α-KGDH 活性影響有顯著交互作用(P＜0.05), 暴露處理后α-KGDH活性下降, 分別在24h和96h的4.0、6.0 mg/L時(shí)活性最低。在自由基代謝中, 時(shí)間和濃度因素對抗·O2–活性、H2O2含量影響有顯著交互作用(P＜0.05), 而對抑制·OH活性、NO含量、NOS活性的影響無顯著性交互作用(P＞0.05)。不同時(shí)間隨著 Cu2+濃度的增加, 抗·O2–活性均呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢; 實(shí)驗(yàn)處理后H2O2含量升高, 在24h的6.0 mg/L時(shí)含量最大; 隨著暴露時(shí)間的延長和Cu2+濃度的增加抑制·OH活性均逐漸降低; 而NO 含量和NOS 活性的變化趨勢基本相同, 即隨著Cu2+濃度的增加先增加后減少并趨近0濃度組, 且都在6.0 mg/L時(shí)達(dá)到最大。研究結(jié)果表明急性Cu2+暴露對虎紋蛙肝臟線粒體中TCA循環(huán)及自由基代謝有顯著的毒性作用。

虎紋蛙; 銅離子; TCA循環(huán); 自由基代謝; 毒性效應(yīng)

銅是生物體所必須的微量元素之一, 對生物體的生長發(fā)育和繁殖起著重要的作用, 但過量的銅離子(Cu2+)則會對機(jī)體產(chǎn)生毒害作用[1, 2]。Cu2+是水體中常見的重金屬, 主要來源于銅鋅礦開采和冶煉、金屬加工、機(jī)械制造、鋼鐵生產(chǎn)等工業(yè)廢水[3]。含銅廢水的排放不僅污染環(huán)境, 同時(shí)對棲息于其中的動植物產(chǎn)生極大的影響[4, 5]。兩棲動物作為脊椎動物從水生過渡到陸生的重要類群, 其生命活動的各個(gè)環(huán)節(jié)均離不開水環(huán)境。因此, 以銅為代表的重金屬污染被認(rèn)為是導(dǎo)致當(dāng)今全球兩棲動物急劇下降的重要原因之一[6]。

近年來, 虎紋蛙(Hoplobatrachus chinensis)由于棲息地破壞、環(huán)境污染和人類過度捕獵等因素, 其野生種群瀕臨滅絕, 已被列為國家Ⅱ級重點(diǎn)保護(hù)野生動物, 并被列入中國瀕危動物紅皮書?；⒓y蛙主要生活于稻田、魚塘、水坑和溝渠內(nèi), 對水體污染反應(yīng)敏感。目前關(guān)于虎紋蛙的研究主要集中于形態(tài)學(xué)[7]、細(xì)胞生物學(xué)[8]、分子遺傳學(xué)[9]、生理生態(tài)[10]等方面, 而有關(guān) Cu2+對虎紋蛙的急性毒性效應(yīng), 以及由此引起的三羧酸(Tricarboxyl acid, TCA)循環(huán)和自由基代謝方面的研究尚未見報(bào)道。本研究擬通過實(shí)驗(yàn)室急性脅迫實(shí)驗(yàn), 研究 Cu2+對虎紋蛙肝臟線粒體中TCA循環(huán)及自由基代謝的毒理作用, 以期可為探討重金屬污染導(dǎo)致的兩棲類種群下降機(jī)制的討論和含銅廢水排放標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù), 同時(shí)也可為該物種的野外保護(hù)提供重要的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本研究用虎紋蛙種群來自浙江省金華市的虎紋蛙養(yǎng)殖場。將虎紋蛙置于圓柱形水族箱(半徑0.5 m× 高0.8 m)馴化飼養(yǎng), 提供充足的水陸環(huán)境和遮蔽物,自然光照, 溫度為(25±1) , ℃ 飼養(yǎng)密度為 30只/缸,每日以虎紋蛙養(yǎng)殖專用飼料(漳州市聯(lián)泰飼料有限公司)投食 1次, 并定時(shí)用經(jīng)曝氣脫氯的自來水[pH: 7.5±0.1, 溶氧量: (8.7±0.2) mg/L]換水1次, 清除死亡個(gè)體、記錄死亡率, 馴化時(shí)間為1周。

1.2 半致死濃度實(shí)驗(yàn)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 用分析純五水硫酸銅(CuSO4·5H2O)分別配制銅離子(Cu2+)濃度為8.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0和100.0 mg/L的溶液15 L, 每個(gè)處理組設(shè)置2個(gè)平行, 另設(shè)空白對照組(0 mg/L)。向每個(gè)實(shí)驗(yàn)水族箱中放置15只體表無傷、大小均一[體重: (178.01±1.77) g; 體長: (12.30±0.13) cm]的虎紋蛙成體, 實(shí)驗(yàn)處理過程中不喂食, 每日定時(shí)更換實(shí)驗(yàn)溶液1次, 觀察并分別記錄每個(gè)水族箱中24h、48h、72h 和96h虎紋蛙的累積死亡個(gè)數(shù), 及時(shí)清除死亡個(gè)體。

1.3 暴露實(shí)驗(yàn)

用分析純 CuSO4·5H2O分別配制 Cu2+濃度為2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/L的溶液15 L, 每個(gè)Cu2+濃度設(shè)置 2個(gè)平行組, 另設(shè)空白對照組(0 mg/L)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)水族箱中放置30只體表無傷、大小均一[體重: (178.01±1.77) g; 體長: (12.30± 0.13) cm]的虎紋蛙成體。實(shí)驗(yàn)過程中不喂食, 每日定時(shí)換溶液 1次, 注意觀察并及時(shí)清除死亡個(gè)體。分別于暴露時(shí)間0、24h、48h、72h和96h在每個(gè)濃度組中隨機(jī)取活體虎紋蛙 6只進(jìn)行解剖, 并將所獲取的肝臟組織置于–80℃冰箱中保存待用。

1.4 檢測方法

采用差速離心法分離肝臟細(xì)胞中的線粒體, 操作方法詳見試劑盒說明書(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司), 并將分離獲取的線粒體置于–80℃冰箱中保存。

TCA 循環(huán)中異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase, ICDHm)和 α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketoglutarate dehydrogenase, α-KGDH)的活性采用試劑盒測定(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)。自由基代謝中抗超氧陰離子(anti-·O2–)活性、過氧化氫(H2O2)含量、抑制羥自由基(inhabit-·OH)活性、一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合成酶(NOS)活性及線粒體中蛋白含量均采用試劑盒測定(南京建成生物工程研究所)。上述指標(biāo)在每個(gè)樣本中均重復(fù)測定3次, 并取平均值, 測定程序參照試劑盒說明書。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示檢測結(jié)果。以時(shí)間和濃度為自變量進(jìn)行雙因素方差分析(Two-way ANOVA), 若二因素間出現(xiàn)顯著交互作用, 則固定其中一個(gè)因素, 以另一個(gè)因素做單因素方差分析(One-way ANOVA)或 t檢驗(yàn); 若二因素間無交互作用, 則進(jìn)行兩因素主效應(yīng)分析, 并用 LSD進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 虎紋蛙的半致死濃度

采用直線內(nèi)插法計(jì)算得出(圖1): Cu2+對虎紋蛙的24h半致死濃度(24h LC50)為62.5 mg/L, 48h LC50為 24.7 mg/L, 72h LC50為 9.5 mg/L, 96h LC50為8.2 mg/L。

2.2 Cu2+對TCA循環(huán)中關(guān)鍵酶的影響

圖1 虎紋蛙在不同濃度銅離子下的累積死亡率Fig. 1 The cumulative mortality rate of H. chinensis under various concentrations of Cu2+

Cu2+濃度和暴露時(shí)間雙因素對虎紋蛙肝臟細(xì)胞線粒體中 ICDHm活性的影響無交互作用(P＞0.05)(表1)。兩因素主效應(yīng)分析結(jié)果顯示: 隨著Cu2+濃度的增加, ICDHm活性呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢, 而暴露時(shí)間對ICDHm活性無影響(P＞0.05)(圖2)。

Cu2+濃度和暴露時(shí)間雙因素對虎紋蛙肝臟細(xì)胞線粒體中α-KGDH活性的影響有極顯著的交互作用(P＜0.01)(表1)。在24h、48h和96h三個(gè)處理組中隨著Cu2+濃度的增加α-KGDH活性均出現(xiàn)先減小后增大的趨勢, 但其酶活均小于或等于對照組的酶活力;而在72h處理組中α-KGDH的活性只呈現(xiàn)出下降的趨勢。相同 Cu2+濃度在不同暴露時(shí)間下, 隨著處理時(shí)間的延長, α-KGDH活性均呈現(xiàn)出先減小后增大再減小的趨勢(圖3)。

表1 銅離子濃度和作用時(shí)間對虎紋蛙肝臟細(xì)胞線粒體TCA循環(huán)關(guān)鍵酶和自由基代謝的雙因素方差分析Tab. 1 Two-way ANOVA analysis of the effects of various copper ion concentrations and exposure time on the key enzymes in TCA cycle and free radical metabolism in the mitochondria of the liver of H. chinensis

圖 2 銅離子濃度對虎紋蛙肝臟細(xì)胞線粒體中異檸檬酸脫氫酶活性的影響Fig. 2 The effects of Cu2+concentrations on the activity of ICDHm in the mitochondria of the liver of H. chinensis

2.3 Cu2+對自由基代謝的影響

Cu2+濃度和暴露時(shí)間雙因素對虎紋蛙肝臟細(xì)胞線粒體中的抗超氧陰離子活性及 H2O2含量的影響有極顯著的交互作用(P＜0.01)(表1)。在相同時(shí)間下,隨著Cu2+濃度的增加抗超氧陰離子活性均有逐漸降低的趨勢(圖4)。在24h和48h處理組中, H2O2的含量隨著Cu2+濃度的增加而呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢, 但其含量均高于對照組; 而在72h和96h處理組中, H2O2的含量則是呈逐漸增加的趨勢。在同一Cu2+濃度處理組中, 隨著時(shí)間的延長, H2O2的含量呈逐漸減小的趨勢(圖5)。

暴露濃度和時(shí)間雙因素對虎紋蛙肝臟細(xì)胞線粒體中抑制羥自由基活性、NO含量和NOS活性的影響無交互作用(P＞0.05)(表1)。兩因素主效應(yīng)分析結(jié)果顯示: 暴露時(shí)間顯著影響抑制羥自由基的活性,抑制羥自由基活性隨暴露時(shí)間的延長而呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(圖6), 然而暴露時(shí)間對NO含量和NOS的活性無顯著影響(P＞0.05); 抑制羥自由基的活性隨Cu2+濃度的增加而呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(圖7), NO含量和NOS的活性則呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(圖8)。

圖3 銅離子對虎紋蛙肝臟細(xì)胞線粒體中α-酮戊二酸脫氫酶活性的影響Fig. 3 The effects of Cu2+exposure on the activity of α-KGDH in the mitochondria of the liver of H. chinensis

圖4 銅離子對虎紋蛙肝臟細(xì)胞線粒體中抗超氧陰離子活性的影響Fig. 4 The effects of Cu2+exposure on the anti-·O2–activity in the mitochondria of the liver of H. chinensis

圖5 銅離子對虎紋蛙肝臟細(xì)胞線粒體中過氧化氫含量的影響Fig. 5 The effects of Cu2+exposure on the H2O2content in the mitochondria of the liver of H. chinensis

圖 6 暴露時(shí)間對虎紋蛙肝臟細(xì)胞線粒體中抑制羥自由基活性的影響Fig. 6 The effects of exposure time on the inhibit-·OH activity in the mitochondria of the liver of H. chinensis

圖 7 銅離子濃度對虎紋蛙肝臟細(xì)胞線粒體中抑制羥自由基活性的影響Fig. 7 The effects of Cu2+concentration on the inhibit-·OH activity in the mitochondria of the liver of H. chinensis

3 討論

肝臟是糖類、脂類和蛋白質(zhì)等進(jìn)行代謝的主要場所, 其在維持生物體的代謝平衡方面起著重要的作用。此外, 肝臟也是機(jī)體的解毒器官, 可將來自體內(nèi)外的各種有毒物質(zhì)經(jīng)過生物代謝轉(zhuǎn)化為無毒或低毒的物質(zhì)。肝臟細(xì)胞中含有大量的線粒體, 線粒體不僅是細(xì)胞的“能量工廠”, 而且在維持細(xì)胞功能上也發(fā)揮著重要作用[11]。肝臟細(xì)胞中的線粒體在合成ATP的同時(shí)會生成活性氧自由基(ROS), 二者在正常機(jī)體內(nèi)處于動態(tài)平衡之中, 其含量共同調(diào)節(jié)著機(jī)體的生長發(fā)育、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、基因表達(dá)等生理生化活動[12, 13]。然而, 當(dāng)機(jī)體受到外界不良環(huán)境的脅迫時(shí)(如高鹽、低溫等), 機(jī)體將產(chǎn)生過量的ROS積累, 造成線粒體損傷和細(xì)胞凋亡[14]。

圖 8 銅離子濃度對虎紋蛙肝臟細(xì)胞線粒體中一氧化氮含量和一氧化氮合成酶的影響Fig. 8 The effects of Cu2+concentration on the NO content and NOS activity in the mitochondria of the liver of H. chinensis

3.1 Cu2+對TCA循環(huán)的影響

TCA循環(huán)作為生物體能量代謝的重要途徑, 不僅是糖、脂和蛋白質(zhì)代謝的最終代謝通路, 也是糖、脂和蛋白質(zhì)代謝聯(lián)系的樞紐。ICDHm和 α-KGDH 是TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶, 對調(diào)節(jié)TCA循環(huán)具有重要的作用[15, 16]。

研究顯示, TCA循環(huán)中NADPH的生成主要受到ICDHm活性的影響, 同時(shí)活性氧自由基(ROS)在體內(nèi)的代謝又受到 NADPH所提供質(zhì)子數(shù)量的影響[17],因此ICDHm在TCA循環(huán)中的活性將影響到對ROS的清除能力[18]。本研究結(jié)果顯示隨著Cu2+濃度的增加, ICDHm的活性將逐漸降低, 這與李明達(dá)等[19]對釀酒酵母體內(nèi) ICDHm活性研究結(jié)果一致, 說明Cu2+的脅迫能夠?qū)CDHm活性產(chǎn)生顯著影響。

α-KGDH則是TCA循環(huán)的限速酶, 在TCA循環(huán)中α-KGDH催化α-酮戊二酸生成琥珀酰-CoA和NADH。NADH在機(jī)體的電子呼吸鏈中可與FADH2共同作用促使 ADP和 Pi反應(yīng)合成 ATP[20]和產(chǎn)生ROS[21]。因此, α-KGDH的活性將直接影響線粒體的能量代謝和ROS的生成[22]。在不良環(huán)境中, ROS的積累將會降低α-KGDH的活性[23], 且過量的ROS將引起機(jī)體組織慢性缺氧, 促使機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性調(diào)節(jié),并誘導(dǎo)α-KGDH活性的回升[24]。本研究結(jié)果與此基本一致, 虎紋蛙在經(jīng)Cu2+處理24h和48h后, α-KGDH的活性呈現(xiàn)出先降低后回升的趨勢; 而在處理 72h后由于機(jī)體受損程度已超過機(jī)體的適應(yīng)性調(diào)節(jié)范圍,因而造成自身調(diào)節(jié)失效并引起α-KGDH活性的逐漸下降; 隨著處理時(shí)間繼續(xù)延長, 96h后α-KGDH的活性在銳減后回升, 這可能是因?yàn)橥饨鐐Τ^機(jī)體適應(yīng)性調(diào)節(jié)范圍后觸發(fā)了機(jī)體的某種補(bǔ)償機(jī)制。同樣, 在相同離子濃度不同暴露時(shí)間的分析上也說明可能存在這種補(bǔ)償機(jī)制。在2、4、6和8 mg/L的處理組中, 隨著處理時(shí)間的延長, α-KGDH活性呈現(xiàn)出先下降后回升再下降的趨勢; 而在 10 mg/L的處理組中α-KGDH的活性除了先下降后回升再下降的趨勢外, 其酶活性還有再次回升的趨勢?；⒓y蛙機(jī)體中出現(xiàn)的關(guān)于α-KGDH活性的補(bǔ)償目前尚不清楚其機(jī)制, 還有待后續(xù)研究。然而, 經(jīng) Cu2+處理后無論是機(jī)體自身的適應(yīng)性調(diào)節(jié)還是機(jī)體觸發(fā)的補(bǔ)償機(jī)制所導(dǎo)致α-KGDH活性的回升, 其活性均小于或等于對照組的酶活性。

3.2 Cu2+對自由基代謝的影響

重金屬對生物體的毒性效應(yīng)主要表現(xiàn)在自由基介導(dǎo)的生物氧化損傷[21], 而生物體的氧化脅迫又可誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生過量的 ROS[25]并降低生物體清除ROS的能力[26]。在線粒體中, ROS主要包括·O2–、H2O2、·OH和NO等幾種。其中·O2–是一種在線粒體中具有高度生物活性的自由基[26], 可由呼吸鏈在進(jìn)行電子傳遞時(shí)形成[27], 是形成 H2O2和·OH 的前體?！H 是·O2–經(jīng)過歧化反應(yīng)和 Fenton反應(yīng)及Haber-Weiss反應(yīng)生成, 可與大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)造成氧化損傷或過氧化損傷[28]。H2O2則是·O2–反應(yīng)生成·OH的中間產(chǎn)物, 其在機(jī)體內(nèi)的含量直接影響對ROS的清除能力和抗氧化系統(tǒng)的穩(wěn)定性[21]。

在本研究中, 虎紋蛙在 Cu2+水溶液暴露后, 線粒體抗超氧陰離子和抑制羥自由基的活性均呈逐漸下降的趨勢。抗超氧陰離子和抑制羥自由基是機(jī)體內(nèi)清除·O2–和·OH的主要物質(zhì), 在Cu2+作用下, 二者的含量和活性均受到嚴(yán)重的抑制而降低[4, 29, 30], 并導(dǎo)致機(jī)體對ROS清除能力的下降。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與用鎘對河南華溪蟹(Sinopotamon henanense)肝胰腺線粒體自由基代謝的研究結(jié)果大致相同[21]。而H2O2的含量則在外界 Cu2+的影響下, 出現(xiàn)有規(guī)律的變化。在相同Cu2+濃度或較短時(shí)間(24h和48h)暴露后, H2O2的含量都表現(xiàn)出隨暴露時(shí)間延長或 Cu2+濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這說明機(jī)體在面對 Cu2+的脅迫時(shí), 首先其生成了大量的 ROS, 隨后大量的ROS觸發(fā)機(jī)體的適應(yīng)性調(diào)節(jié), 并產(chǎn)生抗氧化物使得H2O2的濃度隨之降低。然而在較長時(shí)間(72h 和96h)暴露后, H2O2的含量則隨Cu2+濃度的增加只表現(xiàn)出上升的趨勢。這說明在較長時(shí)間的污染下,大量的H2O2引起機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的紊亂, 導(dǎo)致ROS的積累; 同時(shí)機(jī)體自身對不良環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)已失效, 因而其H2O2濃度呈單調(diào)上升的趨勢。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與對中國花鱸(Lateolabrax maculatus)幼魚的毒性研究結(jié)果類似[4]。

NO作為線粒體中具有高度生物活性的另一種自由基, 在調(diào)節(jié)線粒體氧化呼吸和能量代謝方面起到重要的作用[21]。存在于線粒體內(nèi)膜上的鈣依賴性NOS可通過氧化L-精氨酸形成NO, 且其活性受到線粒體內(nèi)膜的影響[31]。本研究結(jié)果顯示, 經(jīng) Cu2+處理后, NO的含量和NOS的活性均隨著Cu2+濃度的增大而出現(xiàn)先上升后下降的變化, 這與用鎘對河南華溪蟹的相關(guān)研究結(jié)果相一致[21]。低濃度的Cu2+在機(jī)體內(nèi)可作為微量元素被吸收[32], 從而誘導(dǎo)NOS活性的增加, 并促使 NO合成量的增大; 隨著 Cu2+濃度的不斷增大, NOS的活性和NO的含量均不斷增加; 大量的NO一方面將與O2競爭性的與呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ結(jié)合, 降低呼吸鏈活性, 減少 O2的消耗, 導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)能受阻[33]; 另一方面, 大量的 NO 還可與·O2–發(fā)生反應(yīng)生成活性更強(qiáng)的過氧化亞硝酸離子(ONOO–)[34], 導(dǎo)致呼吸鏈?zhǔn)軗p和脂質(zhì)過氧化, 使機(jī)體的ATP合成受到阻礙[35]。此后, 隨著Cu2+濃度繼續(xù)增大, 高劑量的 Cu2+不僅導(dǎo)致機(jī)體的呼吸鏈?zhǔn)軗p、產(chǎn)能受阻, 還可直接與NOS作用而改變其分子構(gòu)型[32], 最終導(dǎo)致NOS活性和NO生成的下降。

綜上所述, 急性 Cu2+暴露對虎紋蛙肝臟線粒體中TCA循環(huán)及自由基代謝有顯著的毒性作用, 其不僅可通過影響虎紋蛙肝臟線粒體中 TCA循環(huán)關(guān)鍵酶ICDHm和α-KGDH的活性降低TCA循環(huán)的轉(zhuǎn)化效率, 而且可通過降低虎紋蛙肝臟線粒體中抗自由基的生成能力和增加線粒體中自由基的含量破壞線粒體的自由基代謝平衡。

致謝:

感謝代亞如、程巖巖、朱麗麗和金芬對本實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)的處理和文稿的校對。感謝孫梅好教授對英文摘要進(jìn)行潤色。

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THE EFFECTS OF ACUTE COPPER STRESS ON TCA CYCLE AND FREE RADICAL METABOLISM IN THE LIVER OF HOPLOBATRACHUS CHINENSIS

LI Bin, HUANG Yan, SHAO Chen and WANG Yu
(Institute of Ecology, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China)

In this study, we applied acute toxicity test to investigate the toxic effects of copper ion (Cu2+) on tricarboxylic acid cycle (TCA) and free radical metabolism in the mitochondria of the liver of Hoplobatrachus chinensis. We treated the animals with Cu2+at different concentrations and for different exposure time, and tested the activities of TCA-related enzymes and free radicals. We found that although Cu2+at high concentrations could reduce the activity of ICDHm, prolonged exposure time had no significant effect on ICDHm (P ＞ 0.05). We did not observe cross effects between the concentration of Cu2+and the exposure time on the activity of ICDHm (P ＞ 0.05). However there were significant cross effects between the exposure time and the concentration of Cu2+on the activity of α-KGDH (P ＜ 0.05). The activity of α-KGDH decreased when exposed to Cu2+, and the lowest activities were detected when the exposure times were 24h and 96h and concentrations were 4.0 and 6.0 mg/L. In terms of free radical metabolism, the exposure time and copper concentration had strong cross effects on the activities of anti-·O2–and H2O2(P ＜ 0.05), but not on the activity of inhibit-·OH, the content of NO, and the activity of NOS. The activities of anti-·O2–decreased along with the increase in the concentration of Cu2+. The content of H2O2increased after the treatments and perked at 24h and 6.0 mg/L. There was a negative correlation between the activity of inhibit-·OH and the exposure time and the concentration of Cu2+. Along with the increase in the concentration of Cu2+, the content of NO and the activity of NOS first increased and then decreased to the values of the control group, and the maximum values appeared in the 6.0 mg/L group. Our study demonstrated that the acute exposure of Cu2+could have significant toxic effects on TCA cycle and free radical metabolism in the mitochondria of the liver of H. chinensis.

Hoplobatrachus chinensis; Copper ion; TCA cycle; Free radical metabolism; Toxic effect

Q593+.1

A

1000-3207(2015)06-1160-09

10.7541/2015.152

2014-11-10;

2015-04-17

國家自然科學(xué)基金(31400472); 浙江省自然科學(xué)基金(LQ14C040001); 浙江師范大學(xué)博士科研啟動基金(ZC304013020)資助

李斌(1988—), 男, 湖北孝感人; 碩士; 研究方向?yàn)閯游镔Y源與保護(hù)生物學(xué)。E-mail: libinldgl@126.com

王宇, E-mail: yuwang@zjnu.edu.cn