基于微衛(wèi)星多重PCR技術(shù)的黃喉擬水龜親子鑒定

文 萍趙 建李 偉洪孝友朱新平

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510380; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

基于微衛(wèi)星多重PCR技術(shù)的黃喉擬水龜親子鑒定

文 萍1, 2趙 建1李 偉1洪孝友1朱新平1, 2

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510380; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

利用黃喉擬水龜(Mauremys mutica)微衛(wèi)星標(biāo)記, 篩選出16對(duì)微衛(wèi)星引物, 通過優(yōu)化各引物比例、熒光接頭濃度、退火溫度和循環(huán)次數(shù), 建立了基于2組各含8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)多重PCR體系的黃喉擬水龜親子鑒定技術(shù)。應(yīng)用2組微衛(wèi)星多重PCR體系, 通過ABI3130遺傳分析儀以及cervus3.0軟件對(duì)428只黃喉擬水龜進(jìn)行了個(gè)體基因型檢測(cè)和遺傳多樣性分析, 結(jié)果顯示, 群體的平均等位基因數(shù)為14.190, 平均多態(tài)信息含量為0.748, 平均觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別為0.687、0.771。對(duì)89只候選母本及296只子代進(jìn)行親子鑒定分析, 結(jié)果顯示: 在父本信息未知時(shí), 母本鑒定率為 87%; 母本獲得的子代個(gè)數(shù)范圍為 1—12, 個(gè)體間表現(xiàn)出巨大的差異, 這為選擇育種提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。黃喉擬水龜多重 PCR親子鑒定技術(shù)的建立為群體遺傳多樣性分析、家系鑒定管理和選擇育種提供了有效的技術(shù)手段。

黃喉擬水龜; 微衛(wèi)星多重PCR; 親子鑒定

微衛(wèi)星作為一種分子標(biāo)記在生物遺傳學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用, 特別是 Chamberlian等[1]在20世紀(jì)80年代發(fā)展了微衛(wèi)星多重PCR (Multiplex PCR) 反應(yīng)模式后, 更是因其高效已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域, 其中包括一些水生生物, 如鰱(Hypophthalmichthys molitrix)[2]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)[3]的遺傳多樣性分析; 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)[4]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[5]、美洲牡蠣(Crassostrea virginica)[6]、中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)[7]的親子鑒定; 皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)[8]的遺傳分離模式分析等。微衛(wèi)星的開發(fā), 為水生生物群體遺傳多樣性、親子鑒定、家系管理等研究提供了有力的工具。

黃喉擬水龜(Mauremys mutica)隸屬龜鱉目(Testudines)、潮龜科(Geoemydidae)、擬水龜屬(Mauremys), 具有較高的食用、藥用和觀賞價(jià)值, 在我國(guó)主要分布在華東與華南地區(qū), 國(guó)外主要分布在越南和日本[9], 已被列入瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約附錄 II[10], 屬易危物種。為保護(hù)該物種及滿足人們的需求, 我國(guó)在20世紀(jì)90年代開展了黃喉擬水龜人工養(yǎng)殖, 目前已形成了產(chǎn)業(yè)。但黃喉擬水龜性成熟時(shí)間長(zhǎng), 繁殖力低, 導(dǎo)致苗種供應(yīng)不足,嚴(yán)重限制了產(chǎn)業(yè)規(guī)模的發(fā)展[11, 12]。本實(shí)驗(yàn)室近幾年致力于提高黃喉擬水龜繁殖力的研究, 高繁殖力黃喉擬水龜品系選育是其中的一個(gè)研究方向。選育需要一個(gè)較大群體, 選育過程中需要由后代的數(shù)量性狀來確定母本的優(yōu)良性, 而由大群體自由交配產(chǎn)生的后代其系譜難以確定, 導(dǎo)致后續(xù)工作難以開展。因此, 有必要開發(fā)黃喉擬水龜親子鑒定技術(shù), 而基于微衛(wèi)星的親子鑒定技術(shù)則成為首選。

目前關(guān)于黃喉擬水龜微衛(wèi)星標(biāo)記的報(bào)道較少,僅見Zhang等[13]關(guān)于黃喉擬水龜微衛(wèi)星的分離與特性描述。本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一些微衛(wèi)星標(biāo)記, 結(jié)合文獻(xiàn)中的微衛(wèi)星標(biāo)記, 篩選、優(yōu)化構(gòu)建了黃喉擬水龜微衛(wèi)星多重PCR體系, 用于親子鑒定及其相關(guān)研究,擬以此獲得完整、準(zhǔn)確的系譜信息, 為高繁殖力黃喉擬水龜品系選育工作打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)時(shí)間在2013年, 試驗(yàn)用父母本材料為人工養(yǎng)殖的9齡黃喉擬水龜, 雌龜89只, 雄龜43只, 共有132只, 采用在背甲上刻字的方法從1—132依次做好標(biāo)記。養(yǎng)殖場(chǎng)地在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所龜類繁育場(chǎng)。

試驗(yàn)用子代為上述132只父母本2013年在同一個(gè)繁育池中產(chǎn)卵, 人工孵化的子代幼龜, 共296只。同一窩龜卵在采集和孵化過程中作好記錄, 幼龜孵化出來后, 采用刻字法進(jìn)行標(biāo)記。

親代和子代每個(gè)個(gè)體抽取10—20 μL血液, 置于裝有200 μL buffer TL (MicroElute Genomic DNA Kit試劑盒, OMEGA, USA)的離心管中, 標(biāo)上與龜個(gè)體對(duì)應(yīng)的編號(hào), 冰盒保存, 當(dāng)天提取DNA。

1.2 基因組DNA的提取

用MicroElute Genomic DNA Kit試劑盒提取樣本基因組DNA, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性, DNA經(jīng)NanoQTM微型分光光度計(jì)(博奧)檢測(cè)濃度, 并用去離子水稀釋至終濃度 20 ng/μL, 置于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星引物篩選

從本實(shí)驗(yàn)室黃喉擬水龜簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)中的微衛(wèi)星標(biāo)記篩選微衛(wèi)星引物。一共設(shè)計(jì)38對(duì)微衛(wèi)星引物, 引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。合成時(shí), 每對(duì)引物的正向引物 5′端添加相同的接頭序列(PET)。通過PCR擴(kuò)增篩選, 從中選出能穩(wěn)定擴(kuò)增、產(chǎn)物條帶清晰、產(chǎn)物多態(tài)性豐富的16對(duì)引物來構(gòu)建多重PCR體系。16對(duì)微衛(wèi)星引物中, 10對(duì)來自實(shí)驗(yàn)室開發(fā), 6對(duì)來自于發(fā)表文獻(xiàn)[13]。16對(duì)微衛(wèi)星引物序列信息見表1。

1.4 多重PCR體系構(gòu)建

根據(jù)上述16對(duì)引物的退火溫度及其PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍進(jìn)行引物組合, 確定構(gòu)建2個(gè)多重PCR體系, 每個(gè)體系包含8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。16對(duì)引物由英濰捷基公司合成, 根據(jù)添加同種接頭的同一體系中的引物其擴(kuò)增產(chǎn)物不重疊的原則, 合成時(shí)在正向引物5′端添加不同的接頭序列(PET、VIC、NED、FAM),另外單獨(dú)的PET、VIC、NED、FAM分別以紅色、綠色、黃色、藍(lán)色熒光進(jìn)行標(biāo)記, 合成熒光標(biāo)記接頭, 4種接頭序列見表2。PCR擴(kuò)增前將引物稀釋至10 μmol/L, 每對(duì)引物上下游按1∶40混合; 4種熒光接頭均稀釋至 20 μmol/L, 并按 1∶1∶1∶1混合,在渦旋混合器上混勻。通過優(yōu)化體系內(nèi)各引物混合比例、退火溫度、循環(huán)次數(shù)、熒光接頭混合物濃度等條件確定最佳PCR擴(kuò)增條件。

表1 多重PCR 16對(duì)微衛(wèi)星引物序列Tab. 1 The sixteen microsatellite primers for multiplex PCR

表2 四種熒光標(biāo)記接頭Tab. 2 The four fluorescent joints

PCR 反應(yīng)體系 10 μL: 包括 1 μL模板 DNA, 5 μL ABI Multiplex PCR Master Mix, 2 μL 10 μmol/L上下游引物混合物, X μL 20 μmol/L熒光標(biāo)記接頭,添加去離子水至10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 94℃預(yù)變性5min, 94℃變性30s, 退火40s, 72℃延伸40s, 若干循環(huán); 94℃變性30s, 53℃退火40s, 72℃延伸30s, 8個(gè)循環(huán), 72℃再延伸10min, 4℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加樣到 ABI3130遺傳分析儀中進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè), 同時(shí)每個(gè)樣孔中加入分子量?jī)?nèi)標(biāo) GeneScanTM-500LIZTM和去離子甲酰胺, 微衛(wèi)星標(biāo)記基因型采用 Peak Scanner Software V1.0軟件分析。

1.5 遺傳統(tǒng)計(jì)分析及親子鑒定

采用上述建立的微衛(wèi)星多重 PCR體系對(duì)428只黃喉擬水龜進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記基因型檢測(cè), 經(jīng) Peak Scanner Software V1.0軟件分析, 獲取其基因型, 并輔以人工校對(duì), 為了保證等位基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性, 對(duì)于不能確定基因型的樣品, 可利用完全相同的條件重復(fù) 2—3 次擴(kuò)增和分型。建立親本(132個(gè)體)和子代(296個(gè)體)的基因型數(shù)據(jù)庫, 運(yùn)行Cervus 3.0[14]軟件獲得各微衛(wèi)星座位的遺傳多樣性參數(shù), 包括等位基因數(shù)(Number of alleles, Na)、多態(tài)信息含量(polymorphism information content, PIC)、觀測(cè)雜合度(Observed heterozygosity, Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity, He)、哈迪溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)檢測(cè)、無效等位基因頻率[Null allele frequency, F (Null)]等。采用Cervus 3.0軟件進(jìn)行親子鑒定, 分析89個(gè)母本個(gè)體在2013年的繁殖信息。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR體系構(gòu)建

通過對(duì)多重PCR反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化, 建立了2組微衛(wèi)星多重 PCR體系, 每組包含 8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn),每組多重 PCR 的具體參數(shù)見表 3。其中多重 PCR體系2在黃喉擬水龜中的擴(kuò)增效果見圖1。2.2 群體遺傳多樣性分析

表3 二組黃喉擬水龜微衛(wèi)星多重PCR特征Tab. 3 Characteristics of the two multiplex PCRs

圖1 微衛(wèi)星多重PCR體系2在子代9號(hào)中的毛細(xì)管電泳圖Fig. 1 Electrophorograms of the microsatellite multiple PCR (set 2) of offspring 9

用 2組微衛(wèi)星多重 PCR體系對(duì) 132只親龜, 296只仔龜進(jìn)行擴(kuò)增, 將獲得的子代和親本基因型整理保存為txt格式的文件。采用Cervus 3.0軟件分析得到如下結(jié)果: 16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)到227個(gè)等位基因, 單個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)(Na)介于 5—26, 平均等位基因數(shù) 14.190; 多態(tài)信息含量(PIC)介于0.383—0.925, 平均值為0.748, 其中15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)PIC＞0.5表現(xiàn)為高度多態(tài)性, Mmu3位點(diǎn)PIC＞0.25表現(xiàn)為中度多態(tài)性[15]; 觀測(cè)雜合度(Ho)介于0.364—0.921, 平均值為 0.687; 期望雜合度(He)介于 0.429—0.930, 平均值為0.771。上述數(shù)值表明, 黃喉擬水龜群體遺傳多樣性較豐富。HWE檢驗(yàn)顯示: 其中8個(gè)位點(diǎn)符合 HWE, 3個(gè)位點(diǎn)顯著偏離 HWE平衡(P＜0.05), 5個(gè)位點(diǎn)極顯著偏離HWE (P＜0.01)。16個(gè)位點(diǎn)在428個(gè)個(gè)體中的具體遺傳參數(shù)見表4。

2.3 親子鑒定分析

運(yùn)行Cervus3.0中Allele frequency analysis程序,獲得 16個(gè)微衛(wèi)星座位在群體中各等位基因的頻率,以及在下列 3種情況中的非排除概率: 當(dāng)雙親基因型均未知時(shí), 單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的非排除概率(Nonexclusion probability, NE-1P)介于0.250—0.905, 平均值為0.544, 累積非排除概率(Combined non-exclusion probability, CNE-1P)為0.182×10–4; 已知單親基因型時(shí)單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的非排除概率(NE-2P)介于 0.143—0.778, 平均值為 0.389, 累積非排除概率 (CNE-2P) 為0.004×10–5, 具體參數(shù)見表4。

運(yùn)行Simulation程序中的maternity子程序, 輸入等位基因頻率文件, 模擬 10000 次親子鑒定。參數(shù)設(shè)置為: 母本數(shù) 89, 抽樣比例為 1, 置信度為95%, 在父本信息未知的情況下進(jìn)行鑒定, 2個(gè)多重PCR 16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的母本模擬鑒定率為100%。

運(yùn)行Parentage Analysis程序中的maternity子程序, 輸入子代及候選母本的基因型文件、等位基因頻率分析和模擬分析輸出文件, 在父本信息未知的情況下進(jìn)行鑒定, 結(jié)果表明, 在置信水平為 95%時(shí), 258個(gè)子代個(gè)體找到了母本, 鑒定率為 87%。余下38個(gè)子代的母本LOD值小于0, 不宜判定。

將 258個(gè)子代的分配情況與原始記錄相比較,發(fā)現(xiàn)有13個(gè)子代鑒定結(jié)果與原始記錄不一致, 即標(biāo)記來源于同窩的個(gè)體, 其鑒定母本不同。原因可能為: 在產(chǎn)卵期, 不同母龜將卵產(chǎn)在同一地點(diǎn), 實(shí)驗(yàn)人員誤認(rèn)為屬于同一窩而放在一起孵化, 或是在孵化出苗過程不慎搞混所導(dǎo)致。258個(gè)子代在不同母本中的分配情況如表5所示。

2.4 母本繁殖力分析

本實(shí)驗(yàn)89只雌龜成功得到296只子龜, 平均每只母龜有3.3只后代。親子鑒定可明確分配258只子龜, 這 258個(gè)子代只分配到 60個(gè)母本中, 有 29個(gè)母本沒有被分配子代。這結(jié)果表明, 有可能一些母龜沒有獲得后代, 獲得后代的不同母本個(gè)體也表現(xiàn)出不同的繁殖力, 子代個(gè)數(shù)介于 1—12, 這些個(gè)體在繁殖力上的差異為選擇育種提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。其中母本 m114的子代數(shù)多達(dá) 12, 表現(xiàn)出優(yōu)異的繁殖能力, 這些母本及子代都是黃喉擬水龜高繁殖力品系的選育對(duì)象。如果以子代數(shù) 7為選擇指標(biāo), 將有14個(gè)母本個(gè)體被選擇留種, 同時(shí)其子代也一同被選擇留種以接受下一輪的選擇。14個(gè)母本占實(shí)驗(yàn)群體的 15.7%, 這預(yù)示高繁殖力一代的選擇率為15.7%。有不同子代數(shù)量的母本個(gè)數(shù)如圖2所示。

表4 基于2組多重PCR體系分析的黃喉擬水龜群體遺傳多樣性參數(shù)Tab. 4 The genetic diversity of Asian Yellow Pond Turtles, based on the analysis with two sets of multiplex PCR

表5 子代在不同母本中的分配Tab. 5 The allocation of the offspring in different female parents

圖2 有不同子代數(shù)量的母本個(gè)數(shù)Fig. 2 The number of female parents corresponding to different numbers of offspring

3 討論

3.1 微衛(wèi)星多重PCR的建立與優(yōu)化

多重PCR要求多對(duì)引物能同時(shí)在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行特異性擴(kuò)增, 因而技術(shù)難度較大, 理想的多重PCR反應(yīng)體系, 并非單一PCR的簡(jiǎn)單組合, 需要針對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物, 進(jìn)行全面的分析和反復(fù)試驗(yàn)。因此與單個(gè)位點(diǎn)PCR相比, 建立多重PCR的前期準(zhǔn)備工作比較繁瑣, 但技術(shù)一旦開發(fā)成熟, 可大幅度提高效率。

在影響多重PCR反應(yīng)的主要因素中, 張毅等[16]認(rèn)為引物間的兼容性和引物濃度比例是最重要的影響因素; 而黃銀花等[17]認(rèn)為緩沖液的成分對(duì)多重PCR的擴(kuò)增效果產(chǎn)生較大的影響, 而反應(yīng)體積、循環(huán)次數(shù)的影響較小。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)引物組合及其混合比例、退火溫度、循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化, 結(jié)果顯示前兩個(gè)因素影響較大。不同引物組合時(shí), 需注意引物間不能相互作用, 如形成二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等, 另外, 激發(fā)同種顏色熒光的引物其擴(kuò)增片段不能重疊,以免造成基因型統(tǒng)計(jì)困難; 引物混合比例需根據(jù)產(chǎn)物量加以調(diào)整, 直至擴(kuò)增效率相近; 用于構(gòu)建同一多重PCR體系的引物其退火溫度相差不宜超過5℃,在確保每對(duì)引物均能擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物前提下, 需盡量將多重PCR退火溫度調(diào)高, 以免產(chǎn)生雜帶。本實(shí)驗(yàn)多重 PCR產(chǎn)物采用ABI3130遺傳分析儀進(jìn)行檢測(cè)、運(yùn)行Peak Scanner Software V1.0軟件分析片段大小, 因此 PCR產(chǎn)物的量應(yīng)該控制在檢測(cè)范圍內(nèi)(能夠有效檢測(cè)峰值范圍 50—8000), 實(shí)驗(yàn)中通過調(diào)整模板濃度、循環(huán)次數(shù)、熒光接頭濃度可達(dá)到目的。

3.2 試驗(yàn)群體遺傳多樣性

生物群體的遺傳多樣性是生物多樣性的核心和本質(zhì), 也是評(píng)估生物資源狀況的一個(gè)重要指標(biāo)。一個(gè)種群遺傳多樣性越豐富, 其環(huán)境適應(yīng)能力就越強(qiáng),生存和進(jìn)化的潛力也就越大[18]。多態(tài)信息含量是基因豐富度的一個(gè)指標(biāo), 多態(tài)信息含量的高低表明了群體遺傳基礎(chǔ)的豐富多樣性, 等位基因數(shù)越多, 多態(tài)性越豐富。本實(shí)驗(yàn)采用的16個(gè)微衛(wèi)星座位的PIC平均值為 0.748, 表明這些基因座位能夠提供豐富的信息, 可有效用于黃喉擬水龜遺傳多樣性分析。雜合度是衡量群體遺傳多樣性高低的指標(biāo)。在本研究中 16個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的平均觀測(cè)雜合度(Ho)為0.687, 平均期望雜合度(He)為0.771。以上數(shù)據(jù)說明該群體遺傳多樣性水平較高, 與朱新平等[19]運(yùn)用RAPD分析黃喉擬水龜南北兩個(gè)群體遺傳多樣性的結(jié)果相類似。

哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)顯示: 16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中有8個(gè)位點(diǎn)有不同程度的偏離, 其中5個(gè)位點(diǎn)極顯著偏離(P＜0.01)。雜合子缺失一般是造成群體偏離HWE的主要原因, 5個(gè)極顯著偏離HWE的位點(diǎn)期望雜合度都遠(yuǎn)大于它們的觀測(cè)雜合度, 表明純合子的個(gè)體較多, 說明該試驗(yàn)群體存在一定程度的近交或者存在無效等位基因。在本試驗(yàn)中16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)無效等位基因頻率介于–0.85%—22.04%, 5個(gè)極顯著偏離 HWE的位點(diǎn)的無效等位基因頻率均大于10%, 說明無效等位基因是造成其偏離HWE一大原因。從本研究的樣本來源中可以看出, 非隨機(jī)交配群體以及育苗過程中的人工選擇可能是造成8個(gè)位點(diǎn)偏離HWE的另一個(gè)主要原因。

3.3 親子鑒定

本研究使用的親龜是在2013年3月挑選分池養(yǎng)殖, 由于龜類具有上一年交配的精子可以保留在母體體內(nèi)至下一年受精的特點(diǎn)[20], 因此有可能部分父本個(gè)體不出現(xiàn)在試驗(yàn)群體中, 故本試驗(yàn)只進(jìn)行了母本群體和子代群體的親緣關(guān)系鑒定。試驗(yàn)中使用 2組微衛(wèi)星多重PCR體系進(jìn)行子代與候選母本的關(guān)系鑒定, 模擬鑒定率達(dá)到100%, 實(shí)際鑒定率為87%。

實(shí)際鑒定率低于模擬鑒定率, 原因可能是: (1)無效等位基因的存在[21, 22]。本文采用cervus3.0軟件分析微衛(wèi)星位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)后, 發(fā)現(xiàn)16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)無效等位基因頻率介于–0.85%—22.04%, 其中位點(diǎn)sg8、Mmu7、sg10、Mmu4、sg16的無效等位基因頻率大于10%。無效等位基因主要是因?yàn)橐餆o法與微衛(wèi)星側(cè)翼發(fā)生突變的位點(diǎn)相結(jié)合, 導(dǎo)致微衛(wèi)星序列不被擴(kuò)增而產(chǎn)生的, 且微衛(wèi)星序列點(diǎn)突變頻率很高(10–2—10–5)[23]。(2)基因型統(tǒng)計(jì)誤差, 本實(shí)驗(yàn)多重PCR產(chǎn)物采用ABI3130毛細(xì)管電泳檢測(cè), 同一樣品在不同批次的檢測(cè)中, 結(jié)果有一定的差異, 這可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)結(jié)果有一定的誤差。另外, 用軟件cervus3.0分析時(shí), 需將PCR片段大小化為整數(shù), 也可能會(huì)降低鑒定率。另外基因突變, 以及酶在擴(kuò)增以單、二核苷酸為核心序列的微衛(wèi)星座位時(shí)易發(fā)生滑動(dòng)而引起PCR產(chǎn)物出現(xiàn)同源異型的現(xiàn)象均有可能導(dǎo)致實(shí)際鑒定率下降。

親子鑒定結(jié)果顯示, 試驗(yàn)群體中不同母本的子代數(shù)目有所差異, 這對(duì)選擇育種有非常大的參考價(jià)值。在實(shí)際育種過程中, 可以選擇子代數(shù)目較多的母本及其子代進(jìn)行留種, 連續(xù)幾年對(duì)其繁殖情況進(jìn)行觀察, 同時(shí)觀察其子代性成熟之后的繁殖情況,以考察母本高繁殖力能否在子代中遺傳。同時(shí)根據(jù)親子鑒定, 可將母龜分為高繁殖力與低繁殖力兩個(gè)群體, 為將來進(jìn)行分子輔助育種研究提供了重要的研究材料。這些工作將為黃喉擬水龜高繁殖力品系培育打下良好基礎(chǔ)。

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THE PARENTAGE ASSIGNMENT OF MAUREMYS MUTICA USING MULTIPLEX PCR OF MICROSATELLITES

WEN Ping1, 2, ZHAO Jian1, LI Wei1, HONG Xiao-You1and ZHU Xin-Ping1, 2
(1. Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation of Ministry of Agriculture, Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China; 2. College of Life Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

In this study, we established a technique for the parentage assignment in Asian Yellow Pond Turtles (Mauremys mutica) based on two multiplex PCR panels. The primer ratio, the concentration of the fluorescent joint, the annealing temperature and the number of cycles were optimized in this technique. Each multiplex PCR panel had eight loci, 10 of which were developed in our lab and the other 6 were chosen from published literatures. With the multiplex PCR tool we performed the genotyping and the genetic diversity analysis on 428 individuals using ABl3I30 genetic analyzer and Cervus 3.0 software. The results showed that the average number of alleles was 14.190; the average polymorphism information content (PIC) was 0.748; the average observed heterozygosity (Ho) and expected heterozygosity (He) were 0.687 and 0.771 respectively. The parentage assignment was performed on 89 candidate female parents and 296 offspring. Without information on the male parent, the identification rate was 87%. The numbers of offspring of different female parents were remarkably various, ranging from 1 to 12. This provided the material foundation for the selective breeding. This technique could be a highly efficient tool for the genetic diversity analysis, the marker-assisted family identification and management, and the selective breeding of Asian Yellow Pond Turtles.

Mauremys mutica; Microsatellite multiplex PCR; Parentage assignment

Q347

A

1000-3207(2015)06-1134-08

10.7541/2015.149

2014-11-18;

2015-01-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(31302176)資助

文萍(1989—), 女, 湖南株洲人; 碩士; 研究方向?yàn)榉N質(zhì)資源與遺傳育種。E-mail: 461211601@qq.com

朱新平(1964—), 男, 博士, 研究員; E-mail: zhuxinping_1964@163.com