穿膜肽介導p53抗原多肽致敏DC的體外抗瘤效應

孫青山 賈原 張俊萍

·基礎研究·

穿膜肽介導p53抗原多肽致敏DC的體外抗瘤效應

孫青山 賈原 張俊萍

目的探討細胞穿膜肽(cpps)介導p53致敏樹突狀細胞(DC)獲得細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，檢測其體外對結(jié)腸癌細胞株的殺傷效果。方法抽取健康志愿者外周血50ml，用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，經(jīng)細胞因子誘導，獲得DC細胞和T淋巴細胞。將Tat49－57－p53264－272致敏DC細胞，待DC細胞成熟后與T淋巴細胞混合誘導產(chǎn)生CTL，并設PBS與P53為對照。流式細胞術(shù)檢測致敏前后DC細胞的表型，并采用乳酸脫氫酶(LDH)法檢測抗原肽疫苗致敏DC后獲得CTL對結(jié)腸癌細胞株DLD1的體外殺傷活性，同時與人白血病細胞株jurkat的殺傷作用進行比較。結(jié)果致敏前DC中CD80、CD86表達率分別為(15．9±2．1)%、(19．1±2．3)%，而致敏后分別為(17．4±1．7)%、(18．7 ±1．1)%，致敏前后比較差異無統(tǒng)計學意義，P＞0．05。實驗組穿膜肽可延長p53抗原多肽在DC細胞內(nèi)半衰期，從而增強與DC細胞質(zhì)內(nèi)的MHC I類分子的結(jié)合率，并提呈到細胞表面。實驗組CTL對結(jié)腸癌DLD1細胞的殺傷能力顯著強于對照組，且隨著效靶比的增加，殺傷活性逐漸增強(P＜0．05)。Tat49－57－p53264－272多肽致敏DC活化CTL對DLD1細胞具有特異性殺傷作用，對DLD1的殺傷作用顯著強于jurkat細胞(P＜0．05)。結(jié)論穿膜肽可以增強p53抗原多肽的免疫原性，Tat49－57－p53264－272多肽致敏DC能有效誘導抗結(jié)腸癌DLD1細胞的特異性免疫應答。

結(jié)腸癌;樹突狀細胞;細胞穿膜肽;p53;腫瘤免疫治療

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:949～953)

p53基因作為抑癌基因，當發(fā)生缺失或突變后可促使細胞無限制生長，對腫瘤發(fā)生、發(fā)展起重要作用。研究顯示p53蛋白在結(jié)腸癌中的突變率達到50%［1］，因此可為結(jié)腸癌的早期診斷和治療提供新的靶點。突變的p53蛋白常常在腫瘤細胞中穩(wěn)定的過度表達，大量臨床研究證實過表達的p53蛋白具有免疫原性可誘導特異性的CTLs［2－3］。因此，p53蛋白理論上可作為腫瘤抗原成為腫瘤特異性免疫治療的靶標。

細胞穿透肽(CPPs)，能夠穿透細胞膜攜帶大分子物質(zhì)進入不同性質(zhì)的活細胞內(nèi)［4］。CPPs作為1種細胞滲透性多肽，可攜帶多種物質(zhì)，如DNA，RNA，多肽，蛋白，小分子化合物等，具有廣泛的組織相容性、穩(wěn)定性、低毒性和低免疫原性、可人工合成相對簡便等［5］優(yōu)點。Wangrongfu等［6］報道顯示，利用CPPs可顯著提升HLA限制性多肽的DC細胞穿膜效率，且半衰期顯著延長。一系列的研究顯示，由此引發(fā)的CTL免疫效應能高表達CD8+T淋巴細胞表達，同時IFN－y，GMCSF的表達水平都顯著提高。說明該CPPs是有效的。

本研究擬采用細胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPPs)攜帶p53抗原多肽致敏DC獲得抗原特異性CTL，檢測其體外對結(jié)腸癌細胞株的殺傷效果，探索1種療效更明顯、更安全、免疫反應更具有特異性的p53疫苗提供新思路。

1 材料與方法

1．1 細胞和多肽

結(jié)腸癌細胞株DLD1和白血病細胞株Jurkat由本實驗室保存。p53抗原多肽p53264－272LLGRNSFEV(L9 V)［7］，Tat49－57－p53264－272多肽(RKKRRQRRR－LLGRNSFEV)購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1．2 試劑和耗材

CD3 McAb(古巴分子免疫中心)，rhGM－CSF(遼寧衛(wèi)星生物制品研究所)，rhIL－4(peprotech公司)，rhIL－2 (北京四環(huán)生物制藥)，RPMI 1640(賽默飛世爾生物有限公司)，DMEM培養(yǎng)基(上海恒遠生物科技有限公司)，10%的胎牛血清(杭州四季青)，F(xiàn)icoll分離液(天津灝洋)，F(xiàn)ITC標記CD80mAb，PE標記CD86 mAb，F(xiàn)ITC標記Tat49－57－p53264－272，F(xiàn)ITC標記p53264－272均自備，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，熒光倒置顯微鏡(奧林巴斯)，離心機(長沙湘智)，流式細胞儀(美國BD公司)。

1．3 樹突狀細胞的培養(yǎng)及流式細胞儀檢測

采集健康志愿者外周血50 ml，肝素鈉(10 ml)抗凝。加入等量淋巴細胞分離液于4℃、2 100 r/min、離心10 min。吸取單個核細胞層，加入0．9%氯化鈉50 ml混勻，離心去除淋巴細胞分離液。經(jīng)淋巴細胞分離液密度梯度離心獲得外周血單個核細胞，懸浮于1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～6 h，貼壁細胞即為DC前體細胞，加入GM－CSF(800 U/ml)和IL－4(1 000 U/ml)繼續(xù)培養(yǎng)，隔天半量換液，第5 d加入TNF－α(20 ng/ml)誘導成熟DC;并收集成熟DC應用流式細胞儀檢測，于第7天收獲細胞備用。

1．4 淋巴細胞的培養(yǎng)

取未貼壁的細胞加入175 cm2細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，加入含10 IU/mL IL－2的AIM－V培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，隔日半量換液，培養(yǎng)第7天收獲淋巴細胞備用。

1．5 熒光倒置顯微鏡觀察

熒光異硫氰酸熒光素(FITC)標記。脫鹽柱純化收集多肽。

將制備的抗原多肽(p53264－272，CPP－p53264－272，濃度為1 mg/ml)，與用0．1 mol·L－1NaHCO3－NaOH pH 9．0配制的100 mmol·L－1Fluorescein－5－isothiocyanate (FITC)溶液混合標記，4℃避光過夜反應。反應混合液再經(jīng)凝膠柱(P10)脫鹽去除多肽樣品中游離的FITC，用Hepes緩沖液(0．02 mol·L－1Hepes，pH7．4，0．1 mol·L－1NaCl，1 mmol·L－1DTT)洗脫，并根據(jù)公式［protein］=［A280－A494×0．3］/ε計算偶聯(lián)FITC的多肽濃度。實驗組樹突狀細胞(dendritic cell，DC)和對照組DC，于培養(yǎng)的第7 d分別加入FITC－Tat49－57－p53264－272抗原多肽和FITC－p53264－272(終濃度為100 ng/ ml)，37℃、5%CO2環(huán)境中孵育2 h。經(jīng)洗滌后熒光鏡下觀察半衰期和熒光強度。

1．6 DC表型的檢測

棄上清培養(yǎng)液，加DC培養(yǎng)液(1640培養(yǎng)基+ 10%血清+1 000 U/ml IL－4，1 000 U/ml GM－CSF)，并加入TNF－a用于刺激DC細胞成熟。取培養(yǎng)樹突狀細胞，調(diào)整細胞密度至106個/mL，加入熒光抗體CD80－FITC和CD86－PE，避光放置30 min，洗滌3次上流式細胞儀(FCM)檢測。

1．7 DC－T細胞共同培養(yǎng)誘導特異性CTL

第9 d，將刺激成熟的DC細胞與T淋巴細胞混合培養(yǎng)。同時計數(shù)。共培養(yǎng)5 d。隔天換液(1640培養(yǎng)基+10%血清+1 000 U/ml，120 IU IL－2)。第15 d時，計數(shù)細胞。同時對培養(yǎng)物進行流失細胞檢測。

1．8 CTL在體外的殺傷實驗及活性的檢測

效應細胞CTL與靶細胞DLD1細胞混合放入U型96孔酶標板中，反應體系為200 μl，設置3個平行復孔，每孔加入1×105個靶細胞，效靶比分別為10∶1、20∶1、50∶1，然后以1 200 r/min離心2 min，37℃5%CO2分別孵育4 h，每孔加入6 μl置于冰浴5 min，洗滌3次，應用流式細胞儀檢測殺傷活性。

1．9 LDH法檢測CTL細胞對結(jié)腸癌細胞株DLD1的殺傷作用

以DC－CTL細胞為效應細胞，腫瘤細胞DLD1為靶細胞，將效應細胞與靶細胞按10∶1、20∶1、50∶1的比例加入96孔U型板中，每孔含靶細胞1×104個，終體積為200 ml，設3個復孔。于37℃、5%CO2孵育箱中混合培養(yǎng)4 h后，用冷1 640培養(yǎng)液50 μl/孔，中止效應細胞與靶細胞反應，1 500 r/min，離心5 min，收集上清，加入LDH反應液，每孔100 μl，室溫避光孵育30 min后，每孔加1 mol/L HCl 50 μl終止酶促反應，去除孔中含有的氣泡，1 h內(nèi)檢測吸收值(490 nm)，取3孔均值。計算CTL殺傷率，細胞殺傷率(%) =［(實驗組釋放－效應細胞自發(fā)釋放－靶細胞自發(fā)釋放)/(靶細胞最大釋放－靶細胞自發(fā)釋放)］×100%。

1．10 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2．1 cpp－p53致敏DC后形態(tài)及熒光強度

從培養(yǎng)第2～3 d后DC細胞形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則改變，體積變大，周邊可見少量細小樹突狀突起。第5 d加入rhTNF－α后細胞體積增大，細胞表面出現(xiàn)大量毛刺狀突觸，部分細胞開始懸浮，聚集成大小不等的細胞團，呈典型的樹突狀細胞形態(tài)，與正常DC相比，無明顯差異，提示Tat49－57－p53264－272致敏并不影響DC的生長。第7 d將FITC－ccp－p53和FITC－p53分別與成熟的DC細胞共同培養(yǎng)2 h，在熒光倒置顯微鏡下觀察，可見cpp－p53穿膜進入DC的效果要明顯強于單純p53。激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)實驗組(FITCCPP－P53)熒光強度顯著強于對照組(圖1A)，結(jié)果顯示，P53致敏的DC，其熒光猝滅速度快于CPP－P53、FITC－p53，其半衰期大約為2．5 h，而FITC－CPP－P53半衰期約為10 h(圖1B)。上述結(jié)果說明，CPP－P53具有較高的穿膜效率，能長時間滯留在DC細胞內(nèi)。

圖1 熒光圖

2．2 Tat49－57－p53264－272致敏DC后的表型

Tat49－57－p53264－272致敏DC后CD80 CD86表達率無顯著性增高［(15．9±2．1)%vs(17．4±1．7)%，(19．1±2．3)%vs(18．7±1．1)%，P＞0．05］，顯示CPP抗原肽的致敏對DC表型無顯著影響，說明CPPP53致敏DC是通過其穿膜效應促進抗原肽進入DC細胞膜，而不影響DC成熟(圖2)。

2．3 DC誘導CTL活化及表型分析

DC培養(yǎng)成熟后與T淋巴細胞共培養(yǎng)，定期觀察，倒置顯微鏡下顯示T淋巴細胞顯著擴增，且隨著細胞數(shù)量的增加出現(xiàn)聚團集落。流式細胞術(shù)檢測抗原肽致敏DC后體外誘導CTL表型，結(jié)果顯示，CPP－P53組較單純P53組及空白組，CD3+CD8+細胞明顯增加［(73．4±9．18)%vs(58．1±8．43)%］(P＜0．05)，

有統(tǒng)計學意義(表1，圖3)。

表1 CTL亞群表型分析/%

圖3 T細胞亞型分析

2．4 LDH測定CTL殺傷活性

效靶比相同時，經(jīng)Tat49－57－p53264－272致敏DC細胞誘導產(chǎn)生的CTL對DLD1細胞的殺傷率高于實驗組和空白對照(P＜0．05)。且隨著效靶比的增加殺傷活性也隨之增強(表2，圖4)。在效靶比一定時，空白對照組對DLD1細胞和jurkat細胞的殺傷活性無明顯差異，而Tat49－57－p53264－272致敏DC和p53264－272致敏DC誘導產(chǎn)生的CTL對DLD1細胞的殺傷活性均強于對jurkat細胞的殺傷活性，且Tat49－57－p53264－272顯著高于p53264－272的殺傷活性，其差異有顯著性，P＜0．05(圖5)。

表2 CTL對DLD1細胞殺傷率比較(±s，%)

表2 CTL對DLD1細胞殺傷率比較(±s，%)

注:CPP－p53與p53組比較，P＜0．05;PBS與CPP－p53比較，P＜0．05。

10∶120∶150∶1 CPP－p53組組別效靶比4．1±1．36．9±2．79．7±3．4 14．4±8．622．2±7．936．9±8．2 p53組12．1±3．315．8±4．723．4±6．9 PBS組

圖4 CPP－p53和p53致敏后DC誘導的CTL及PBS對DLD1細胞的殺傷率

圖5 TCPP－p53和p53致敏后DC誘導的CTL及PBS對DLD1和Jurkat細胞的殺傷率

3 討論

p53蛋白1979年首次發(fā)現(xiàn)，是人類細胞中最重要的抑癌基因之一，野生型p53基因具有抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡的作用。研究資料表明野生型p53基因是一個重要的抑癌基因，在50%～70%的結(jié)腸癌中有突變［7－8］。且這些突變的p53蛋白往往在腫瘤細胞內(nèi)穩(wěn)定過度表達，而在正常細胞內(nèi)p53很少內(nèi)p53很少內(nèi)p53很少或檢測不到［9］。腫瘤細胞內(nèi)堆積的p53蛋白降解產(chǎn)物可以與MHCⅠ類和Ⅱ類分子結(jié)合，在腫瘤細胞表面呈遞，從而被特異性CTL識

別，使針對腫瘤細胞p53的機體免疫成為可能［10］。

DC細胞是已知體內(nèi)功能最強、唯一能活化靜息T細胞的專職抗原提呈細胞，是啟動、調(diào)控和維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)。通過大量體外活化培養(yǎng)負載腫瘤抗原的DC細胞，可誘導機體產(chǎn)生強烈的抗腫瘤免疫反應。人類惡性腫瘤約50%有p53突變，因此其成為腫瘤免疫療法潛在的靶向抗原。在大多數(shù)試驗中，以p53作為腫瘤特異性抗原疫苗誘導的特異性免疫反應能觀察到，但不是很明顯［11］。其中的關(guān)鍵的原因就是與p53抗原肽的免疫原性低有關(guān)，p53蛋白穩(wěn)定性差在體內(nèi)易降解［12］，與DC的結(jié)合率較低。所以解決的關(guān)鍵就在于增強p53蛋白的穩(wěn)定性和提高p53與DC的結(jié)合率。

CPPs是1種由30個或者更少氨基酸組成的能夠穿透細胞膜的多肽，能夠運載包括藥物在內(nèi)的許多物質(zhì)。CPPs是一類以非受體依賴方式，非經(jīng)典內(nèi)吞方式直接穿過細胞膜進入細胞的多肽，能夠運載多種生物學活性物質(zhì)進入細胞內(nèi)，并發(fā)揮相應的生物學活性和治療作用，其轉(zhuǎn)導效率高且不會造成細胞損傷［13］。這一特性保證了CPPs攜帶各種大分子物質(zhì)進入細胞內(nèi)的高效輸送。

本研究中，經(jīng)Cpp－p53致敏DC多肽疫苗活化的誘導產(chǎn)生的CTL對高表達p53的結(jié)腸癌細胞株DLD1的殺傷力顯著高于jurkat。表明所產(chǎn)生的p53特異性的CTL對p53高表達的結(jié)腸癌細胞具有特異性的殺傷作用。在效靶比相同的情況下，Cpp－p53致敏DC多肽疫苗活化的誘導產(chǎn)生的CTL對DLD1細胞的殺傷活性明顯高于對照組，表明CPPs可以有效的攜帶p53抗原肽進入DC細胞，延長p53抗原肽在細胞內(nèi)的降解和延緩其半衰期從而增強其與DC細胞的結(jié)合，通過MHCⅠ類分子途徑有效地提呈腫瘤特異性抗原，并活化T細胞從而產(chǎn)生對相應腫瘤細胞具有特異性的CTL。以上結(jié)果表明Cpp－p53致敏DC細胞能誘導強大的抗結(jié)腸癌癌細胞株DLD1的免疫作用，為Cpp－p53致敏DC疫苗在結(jié)腸癌癌免疫治療的體內(nèi)試驗和臨床應用研究提供了實驗依據(jù)。

激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示實驗組(FITC－CPP－p53)熒光強度顯著高于對照組，且p53致敏的DC熒光猝滅速度遠快于CPP－p53，而FITC－CPP－p53半衰期約為FITC－p53 4倍。上述結(jié)果說明，CPP－p53具有較好的穿膜效率，能長時間滯留在DC細胞內(nèi)，且可以通過細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的MHC－Ⅰ類分子提呈抗原多肽分布于細胞膜表面上，發(fā)揮其穿膜效應，而這與一般APC細胞提呈多肽類疫苗作用機制不同(APC細胞通過膜上MHC－Ⅱ類分子提呈抗原)，因此CPP－p53致敏DC實際上可能存在2種機制(MHC－Ⅰ，MHC－Ⅱ)共同作用的結(jié)果，①通過CPP穿膜提呈MHC－Ⅰ類分子;②P53與DC細胞膜上MHC－Ⅱ類分子直接結(jié)合提呈到TCR。而上述過程可能并不涉及DC細胞的成熟，而是通過2種機制致敏并提呈TCR。

總之，我們采用Tat49－57－p53264－272致敏DC疫苗的策略得到了很好的驗證，說明CPPs可以增強腫瘤抗原肽的免疫原性，在腫瘤疫苗的研究中具有巨大的潛在價值。本實驗將CPPs與腫瘤相關(guān)抗原向結(jié)合，以p53蛋白為例，刺激樹突狀細胞以獲得特異性CTL，進而開發(fā)1種有效的腫瘤疫苗。本實驗目的在于以體外實驗為基礎，最終達到臨床應用。而僅以p53單一對象涉及腫瘤疫苗具有一定的局限性。多抗原協(xié)同作用，多種CTL相互結(jié)合是我們的最終目的。因此在后續(xù)試驗中，將CEA、HER2、MAGE3等抗原與CPP聯(lián)合應用，形成一個更加有效的腫瘤DC疫苗。

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Anti-tumor Effect of Penetrating Peptide-mediated p53 on Antigen Peptide Pulsed DC in vitro

SUN Qingshan，JIA Yuan，ZHANG Junping．Shanxi Academy of Medical Science，Shanxi Dayi Hospital，Taiyuan，030001

ObjectiveTo investigate the cell penetrating peptide to carry p53 antigen pulsed dendritic cells(DC)induced antigen specific cytotoxic T lymphocytes，and in vitro the killing effect on colon cancer cell lines．MethodsMononuclear cells were extracted form 50mL peripheral blood of healthy volunteers using lymphocyte separation liquid，using different cytokines induce cultured DC cells and T lymphocytes．Tat49－57－p53264－272antigen peptide were prepared，and poured into DC cells．DC was mixed with T lymphocyte to induce CTL，Phenotype were respectively detected in penetratin sensitized and unsensitized DC by flow cytometry，Lactate dehydrogenase detected the activity of DLD1 colon cancer cell lines that were killed by Tat49－57－p53264－272induced activation of CTL sensitive DC peptide vaccine，and compared with the killing effect on human leukemia cell line Jurkat．ResultsSensitization of former DC CD80，CD86 expression was respectively(15．9±2．1)%，(19．1±2．3)%，while after sensitization of DC CD80，CD86 expression was(17．4±1．7)%，respectively(18．7±1．1)%，the difference was not statistically significant，P＞0．05．The experimental group of cell penetrating peptide can prolong the half－life of P53 peptide antigen，enhanced binding and DC cell surface MHC class I molecules binding rate，and far higher than that in the control group(P＜0．05)．The experimental group cytotoxic lymphocyte on colon cancer DLD1 cell killing was significantly higher compared with the control group，and with the increase of effect or target ratio，killing activity increased gradually．The killing activity of Tat49－57－p53264－272was significantly higher than p53264－272(P＜0．05)．Cytotoxicity of Tat49－57－p53264－272sensitized DC polypeptide vaccine activated CTL with specific killing to DLD1 cells，the killing effect of DLD1 was significantly stronger than the killing effect on Jurkat cells(P＜0．05)．ConclusionMembrane penetrating peptides can enhance the immunogenicity of P53 peptide antigen，Tat49－57－p53264－272sensitized DC polypeptide vaccine can induce specific immune response against colon cancer DLD1 cells，and provide experimental basis for membrane penetrating peptides in further research and clinical application of tumor vaccine．

Colon cancer;Dendritic cells;Cell penetrating peptides;p53;Tumor immunotherapy

10．3969/j．issn．1001－5930．2015．07．001

R73－36

:A

:1001－5930(2015)07－0949－05

2014－04－08

2015－06－11)

(編輯:吳小紅)

030001山西醫(yī)科大學研究生院(孫青山);030001山西大醫(yī)院腫瘤生物治療科(孫青山，賈原，張俊萍)

張俊萍