鴨疫里默氏桿菌的PCR檢測和藥敏試驗(yàn)

秦香香 高夢月 蘇玲玲 成大榮

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009)

鴨疫里默氏桿菌的PCR檢測和藥敏試驗(yàn)

秦香香 高夢月 蘇玲玲 成大榮*

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009)

合成兩條鴨疫里默氏桿菌特異性引物，建立PCR方法。使用模板進(jìn)行基因擴(kuò)增，得到592bp的目的條帶。以該方法對高郵、儀征等地的疑似病例進(jìn)行檢測，得到20株鴨疫里默氏桿菌。挑選鑒定后的純菌落接種含血清TSB液體培養(yǎng)基，增菌后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，所有被檢鴨疫里默氏桿菌菌株對哌拉西林、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西丁的敏感率均達(dá)到了100%；對頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢吡肟的敏感率達(dá)到了95%。

鴨疫里默氏桿菌 PCR 藥敏試驗(yàn)

我國鴨品種資源豐富，同時是世界上最大的鴨生產(chǎn)國。隨著科學(xué)養(yǎng)殖技術(shù)的推廣以及集約化規(guī)模的提高，養(yǎng)鴨業(yè)已經(jīng)是我國的重要產(chǎn)業(yè)，并成為農(nóng)民就業(yè)、脫困、增收的新亮點(diǎn)。

但是，多年來，鴨病一直阻礙著養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，特別是鴨疫里默氏桿菌的感染。鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌感染引起的一種接觸感染性疾病，該病主要侵害1～8周齡（尤其2～3周齡）雛鴨、雛鵝、雛火雞等[1]。在臨床上主要以神經(jīng)癥狀和纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征，是目前造成養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最為嚴(yán)重的傳染病之一，其發(fā)病率可達(dá)90%以上，死亡率高達(dá)75%以上[1-4]。飼養(yǎng)管理水平差，應(yīng)激因素的影響，缺乏維生素和微量元素，均能誘發(fā)本病和加劇死亡。揚(yáng)州高郵、儀征地區(qū)為養(yǎng)鴨密集區(qū)，本研究旨在建立鴨疫里默氏桿菌的快速檢測方法，并對病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，了解當(dāng)前臨床常用藥物對本地鴨疫里默桿菌的敏感度，找出有效的治療藥物，為當(dāng)?shù)伉喴呃锬瑮U菌病的防治工作提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 病料來源

2013年9月至2014年5月，從揚(yáng)州大學(xué)動物醫(yī)院收集來自揚(yáng)州高郵、儀征，臨床表現(xiàn)有心包炎、肝周炎等典型癥狀的病死鴨、鵝，無菌采集其肝臟、心臟、脾臟、腦等組織，-20℃凍存?zhèn)溆?。此外，還有家禽研究所送檢的5株疑似菌株。

1.2 培養(yǎng)基

TSB液體培養(yǎng)基和TSA固體培養(yǎng)基（含5%小牛血清），由本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.3 藥敏紙片

革蘭陰性菌藥敏試劑盒，由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

1.4 主要試劑及儀器

1.4.1 主要試劑

Taq酶、dNTPs、10×Buffer、DNA Marker DL1000、6×Loading Buffer，均由生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)。

1.4.2 主要儀器

燭缸；冷凍離心機(jī)；基因擴(kuò)增儀；電泳儀；凝膠成像儀。

2 方法

2.1 引物的設(shè)計

合成擴(kuò)增RA的引物[5]，兩條引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列及產(chǎn)物

2.2 DNA模板的制備

TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌，取培養(yǎng)物600μl以12 000 r/min離心10 min，去除上清后懸浮于50μl滅菌超純水中；TSA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌，挑取單菌落懸浮于100μl滅菌超純水中。采用熱煮沸法制備細(xì)菌的DNA模板[6]。

2.3 PCR反應(yīng)

采用25μl反應(yīng)體系，其中10 × buffer 2.5μl，dNTP 2μl，Taq酶0.25 μl，RA上、下引物各0.25 μl，細(xì)菌模板1μl，補(bǔ)加滅菌超純水18.75μl至25μl。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，54.3℃ 60 s，72℃ 45 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取8μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測儀下觀察結(jié)果。

2.4 特異性試驗(yàn)

將鴨疫里默氏桿菌菌株，禽致病性大腸桿菌菌株，鴨源性多殺性巴氏桿菌菌株，鴨源性沙門氏菌菌株復(fù)蘇培養(yǎng)后，按2.3的條件進(jìn)行PCR反應(yīng)以檢驗(yàn)所建立方法的特異性。

2.5 PCR方法的應(yīng)用

對揚(yáng)州大學(xué)動物醫(yī)院送檢的病死鴨、鵝（具有心包炎、肝周炎和腦膜炎等病變）進(jìn)行剖檢。

無菌剪取病料置于5 mlTSB液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)8 h。取培養(yǎng)物劃線接種于TSB瓊脂平板，置于含 5%～10% CO2的蠟燭罐中37℃培養(yǎng)24 h[7]。另取部分培養(yǎng)物連同家禽研究所送檢的疑似RA菌株5株，按2.2步驟提取模板，按2.3的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增和鑒定。

2.6 藥敏試驗(yàn)

挑選鑒定后的純菌落接種TSB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取增菌液200μl均勻涂布平板，貼藥敏紙片，置于含 5%～10% CO2的蠟燭罐中37℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌環(huán)直徑并記錄。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 PCR檢測結(jié)果

所有RA菌株均擴(kuò)增出592bp的特異條帶，ddw對照未能擴(kuò)增出條帶。

圖1 PCR檢測結(jié)果

3.2 PCR擴(kuò)增的特異性

RA擴(kuò)增出592 bp的單一片段，禽致病性大腸桿菌、鴨源性多殺性巴氏桿菌、鴨源性沙門氏菌、ddw對照未能擴(kuò)增出條帶（圖1）。

圖2 特異性檢測結(jié)果

表3 鴨疫里默氏桿菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果藥物判定標(biāo)準(zhǔn)/mm結(jié)果/株

3.3 PCR方法的臨床檢測結(jié)果

18份疑似病例和5株疑似菌株分離鑒定結(jié)果和PCR的鑒定結(jié)果一致，證明了該P(yáng)CR檢測方法的可靠性。結(jié)果顯示，18份病例中有15份檢測出RA感染，檢測結(jié)果陽性率為83.3%。疑似菌株的檢測結(jié)果均為陽性。詳見表2。

表2 臨床病例和疑似菌株的細(xì)菌分離和PCR鑒定結(jié)果

3.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)：鴨疫里默氏桿菌對頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢西丁等高度敏感，對妥布霉素、鏈霉素、卡那霉素等高度耐受。藥敏試驗(yàn)結(jié)果詳見表3。

浪費(fèi)。本研究結(jié)果表明：所有被檢鴨疫里默氏桿菌菌株對哌拉西林、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西丁的敏感率均達(dá)到了100%；對頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢吡肟的敏感率達(dá)到了95%；對頭孢噻吩、頭孢曲松敏感率達(dá)到了75%。說明揚(yáng)州高郵、儀征地區(qū)在養(yǎng)殖過程中做到了合理的用藥，沒有產(chǎn)生大規(guī)模耐藥的現(xiàn)象，對頭孢類藥物仍較為敏感。

4 討論

雛鴨常發(fā)生一種呈現(xiàn)高發(fā)病率和死亡率的急性傳染病，剖檢可見心包炎、肝周炎和氣囊炎等典型變化，這種病癥多數(shù)為鴨疫里默氏桿菌感染所致[8]。從腦實(shí)質(zhì)內(nèi)最易分離到病原菌，初次分離需要在血液瓊脂平板和有5%～10%CO2條件下才能成功分離培養(yǎng)，費(fèi)時且條件苛刻[9]。本研究合成了兩條特異性引物，通過PCR均能獲得特異性結(jié)果，節(jié)省了時間，增強(qiáng)了實(shí)際應(yīng)用性。臨床病例的細(xì)菌分離和檢測結(jié)果進(jìn)一步說明了該方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

來源不同的鴨疫里默氏桿菌對藥物敏感性各不一致[10-11]。因此，在治療時要進(jìn)行敏感藥物篩選，以免造成藥物和生產(chǎn)上的

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成大榮（1973-），男，教授，博士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物學(xué)和免疫學(xué)。

江蘇省大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃、江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）