血管性癡呆大鼠海馬p38MAPK蛋白表達(dá)及使用普羅布考的研究

葉海波， 李仁云， 熊章津

(湖北省十堰市太和醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院， 湖北 十堰 442000)

血管性癡呆是由多種血管因素所引發(fā)的一種綜合 性病癥，嚴(yán)重?fù)p害腦組織同時(shí)可伴有認(rèn)知功能障礙，是老年性癡呆中的主要類別之一［1］。有研究發(fā)現(xiàn)在血管性癡呆的發(fā)病進(jìn)程中腦海馬神經(jīng)元凋亡起著直接作用，在腦缺血組織中，p38MAPK可以經(jīng)細(xì)胞凋亡的過(guò)程參與到腦組織的損傷［2］。普羅布考有較好的抗氧化及調(diào)血脂作用，同時(shí)其對(duì)炎性因子基因的表達(dá)有很好的抑制作用，更能夠抑制自由基所介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。本文分析了普羅布考對(duì)血管性癡呆大鼠行為學(xué)的影響，并觀察海馬p38 MAPK表達(dá)變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取63只3月齡雄性大鼠，平均體重(250±10)g，對(duì)63只大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后依照隨機(jī)數(shù)字表格法分成三組，分別為普羅布考組、假手術(shù)組以及模型組，每組21只。

1.2 所選試劑及藥物:普羅布考(齊魯制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H10980054);選擇美國(guó)(Santa Cruz)pp38MAPK兔抗大鼠多克隆抗體以及過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG;上海研晶生物科技有限公司β－Tubulin;武漢博士德公司免疫熒光檢測(cè)試劑盒(SABC－FITC);購(gòu)自美國(guó)Roche公司原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建模及藥物治療:普羅布考組與模型組大鼠應(yīng)用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎方法建立血管性癡呆模型，假手術(shù)組在將雙側(cè)頸總動(dòng)脈分離后不予以結(jié)扎，術(shù)后逐層縫合皮膚，在術(shù)中與術(shù)后注意大鼠保暖，結(jié)束后將大鼠送回動(dòng)物房。在手術(shù)1周后普羅布考組大鼠予以500mg/kg普羅布考液(溶于500mL濃度0.5%羧甲基纖維素鈉中)灌胃，1次/d;假手術(shù)組與模型組則予以2mL生理鹽水灌胃，1次/d。共8周。

1.3.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)法:選擇中科院藥物研究所研發(fā)的Morris水迷宮(DMS－2型)，分別測(cè)驗(yàn)三組大鼠的行為學(xué)變化。每組分別取8只大鼠進(jìn)行水迷宮隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)3d，測(cè)定大鼠的學(xué)習(xí)能力，詳細(xì)記錄大鼠的逃避潛伏期，之后撤除平臺(tái)，觀察三組大鼠在原平臺(tái)象限停留時(shí)間，測(cè)定大鼠的空間探索能力(記憶力)。

1.3.3 測(cè)定海馬區(qū)p38MAPK蛋白表達(dá):三組每組各取6只大鼠，分別在行麻醉處理后斷頭，取出大鼠腦組織并分離海馬組織，勻漿并離心提取其蛋白行蛋白質(zhì)定量分析，取其中50μg作為樣本，將其加注于10%濃度的丙烯酰胺膠約4%的成層膠上，行30mA電泳，時(shí)間為2h，溫度為室溫下，再將膠于4℃下轉(zhuǎn)化為醋酸纖維膜，過(guò)夜處理后將該膜與p－p38MAPK兔抗大鼠多克隆抗體在4℃下孵育約2h后再將其與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG于室溫下進(jìn)行反應(yīng)，最后與ECL反應(yīng)后將膜曝光并顯色處理。

1.3.4 TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡情況:三組各選大鼠6只作為測(cè)定對(duì)象，麻醉處理后快速斷頭取出腦組織并分離海馬組織，將其速凍后行冰凍切片，使用TUNEL法對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:對(duì)所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，行單因素方差分析，多組間行F值檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠行為學(xué)測(cè)定結(jié)果分析:模型組大鼠的平臺(tái)潛伏期顯著高于假手術(shù)組，而普羅布考組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)下的平臺(tái)潛伏期模型組明顯降低(P＜0.01)。普羅布考組在原平臺(tái)象限的停留時(shí)間較模型組有明顯的提高(P＜0.01)，見表 1。

表1 三組大鼠行為學(xué)測(cè)定結(jié)果比較(±s)

表1 三組大鼠行為學(xué)測(cè)定結(jié)果比較(±s)

注:a 與假手術(shù)組比較，P＜0.01;b 與模型組比較，P＜0.01

組別 例數(shù) 平臺(tái)逃避潛伏期第1d 第2d 第3d 原平臺(tái)象限停留時(shí)間假手術(shù)組 8 26.37±4.16 21.38±5.13 17.84±3.52 36.11±3.47模型組 8 83.96±7.88a 79.32±8.67a 77.82±6.27a 18.76±5.97a普羅布考組 8 49.73±7.00ab 42.83±4.17ab 40.48±3.15ab 26.18±4.93ab F 值 －12.305 24.336 17.295 23.210 P 值 0.000 0.001 0.010 0.003

2.2 三組大鼠海馬組織p38MAPK蛋白表達(dá)及神經(jīng)元凋亡情況:三組大鼠海馬組織內(nèi)的p－p38MAPK表達(dá)即活化的p38MAPK水平存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，血普羅布考組較模型組明顯降低(P＜0.01);假手術(shù)組大鼠p－p38MAPK的表達(dá)較少。三組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況:模型組與普羅布考組大鼠的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，而假手術(shù)組大鼠僅有少量或者偶見凋亡細(xì)胞，普羅布考組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于模型組(P＜0.01)，見表 2。

表2 三組大鼠海馬p38MAPK蛋白表達(dá)及神經(jīng)元凋亡情況比較(±s)

表2 三組大鼠海馬p38MAPK蛋白表達(dá)及神經(jīng)元凋亡情況比較(±s)

注:a與假手術(shù)組比較，P＜0.01;b 與模型組比較，P＜0.01

組別 例數(shù) p－p38MAPK/β－action光密度值 凋亡細(xì)胞數(shù)假手術(shù)組 6 0.163±0.024 18.33±1.84模型組 6 0.876±0.103a 218.47±10.14a普羅布考組 6 0.507±0.048ab 161.66±9.73ab F 值 33.942 24.597 P 值 0.001 0.005

3 討論

血管性癡呆是因腦血管病變引發(fā)腦損傷從而進(jìn)一步導(dǎo)致癡呆的病癥，缺血及缺氧性腦損傷或者出血性腦損傷造成的病理組織損傷是血管性癡呆的主要特征，且伴有進(jìn)行性智能減退［3］。血管性癡呆僅次于阿爾茨海默病，是癡呆類型中的較為常見病癥，其發(fā)病率在近年來(lái)有上升趨勢(shì)。

馬大勇等［4］研究發(fā)現(xiàn):動(dòng)物在缺血再灌注時(shí)會(huì)激活p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞外刺激信號(hào)與效應(yīng)基因表達(dá)的重要連接，是中轉(zhuǎn)也是橋梁，在機(jī)體炎癥及細(xì)胞周期的調(diào)控以及應(yīng)激情況方面都有p38MAPK參與，所以p38MAPK與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)聯(lián)成為近年研究熱點(diǎn)。p38MAPK分子為p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑當(dāng)中的主要酶成員，在細(xì)胞沒有受到刺激以前，p38MAPK會(huì)保持非磷酸化形態(tài)，并儲(chǔ)存在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，一旦細(xì)胞被體內(nèi)或者體外各種因素刺激時(shí)，例如炎性因子、缺血缺氧等刺激時(shí)，p38MAPK就會(huì)出現(xiàn)磷酸化形式，表現(xiàn)出活化性反應(yīng)，p38MAPK被磷酸化激活，并從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)。

在研究結(jié)果提示普羅布考對(duì)血管性癡呆大鼠的認(rèn)知能力有明顯調(diào)節(jié)作用，同時(shí)還觀察到應(yīng)用普羅布考后，血管性癡呆大鼠的海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡情況顯著改善，磷酸化的p38MAPK表達(dá)也顯著減少，提示對(duì)p38MAPK通路的抑制可能是普羅布考治療血管性癡呆的機(jī)制。近年發(fā)現(xiàn)，普羅布考對(duì)于抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎以及抗氧化應(yīng)激也有明顯的療效。同時(shí)也具有防治心血管疾病及保護(hù)肝臟等多種作用，此外普羅布考對(duì)于神經(jīng)元的重塑也有重要作用。

［1］ 姚細(xì)蕊.銀杏葉提取物治療血管性癡呆的療效觀察［J］.山西醫(yī)藥雜志，2012，(9):928～929.

［2］ 田新英，陳翔，汪婉，等.普羅布考對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能及海馬組織SOD、MDA水平的影響［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2013，30(10):906～909.

［3］ Pallebage－Gamarallage MM，Galloway S，Takechi R，et al.Probucolsuppresses enterocytic accumulation of amyloid－β induced by saturatedfat and cholesterol feeding［J］.Lipids，2012，47(1):27～34.

［4］ 馬大勇，范吉平，朱陵群.3種擬血管性癡呆大鼠模型的比較［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34(12):832～835.