東鄉(xiāng)野生稻耐冷漸滲系DNA甲基化水平和模式變化研究

溫秀芳,戴亮芳,趙 俊,羅向東,鄧曉娟,張帆濤,謝建坤

(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,南昌 330022)

東鄉(xiāng)野生稻耐冷漸滲系DNA甲基化水平和模式變化研究

溫秀芳,戴亮芳,趙 俊,羅向東*,鄧曉娟,張帆濤,謝建坤

(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,南昌 330022)

根據(jù)水稻全基因組和特定位點(diǎn)的CpG島序列設(shè)計(jì)引物,采用McrBC酶酶切DNA,以東鄉(xiāng)野生稻耐冷漸滲系(IL5335和IL5423)及其雙親為試材,研究其基因組和特定位點(diǎn)的DNA甲基化水平和模式變化特征,探討甲基化變異對(duì)野生優(yōu)異基因漸滲的影響。結(jié)果顯示:(1)在覆蓋全基因組的83個(gè)CpG島中,IL5335和IL5423的基因組甲基化頻率分別為46.6%和53.8%,低于受體親本協(xié)青早B的62.6%;大部分(75.9%～80.7%)受體親本的甲基化模式在兩耐冷漸滲中能穩(wěn)定遺傳,另外一些位點(diǎn)發(fā)生了甲基化模式的改變,主要表現(xiàn)為脫甲基化(13.3%～18.1%)和過(guò)甲基化(4.4%～6.0%)。(2)在耐冷QTLs區(qū)間,兩耐冷漸滲系的甲基化水平為13.3%～26.7%,遠(yuǎn)低于受體親本的61.4%;它們?cè)谠搮^(qū)域的甲基化模式變異主要為脫甲基化(33.3%～40.0%),高于全基因組的平均變異率。(3)分析逆轉(zhuǎn)座子Houba和Osr14區(qū)域的51個(gè)CpG島發(fā)現(xiàn),耐冷漸滲系在該區(qū)域具有較高頻率的甲基化修飾和較低的甲基化模式變異。研究表明,種間雜交漸滲誘發(fā)了受體親本廣泛的甲基化水平和模式變異,為野生優(yōu)異基因的有效利用提供了新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

東鄉(xiāng)野生稻;耐冷漸滲系;DNA甲基化;McrBC酶

DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物DNA中一種可逆且能遺傳的表觀遺傳修飾,廣泛存在于細(xì)菌和動(dòng)植物基因組中[1]。DNA甲基化通常被認(rèn)為是基因組DNA的一種防御型機(jī)制[2]。但事實(shí)上,在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化修飾起著非常重要的作用,它能關(guān)閉或啟動(dòng)某些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)程序,參與基因的表達(dá)調(diào)控、組蛋白修飾、染色體印記、著絲粒和端粒結(jié)構(gòu)的維持等生命活動(dòng)[3]。因此,DNA甲基化的遺傳與可塑性對(duì)生物體維持正常的生命活動(dòng)至關(guān)重要。

研究表明,外界因素可誘發(fā)植物基因組甲基化變異,如遠(yuǎn)緣雜交、轉(zhuǎn)基因、離體培養(yǎng)、環(huán)境脅迫等[4-5]。前人對(duì)擬南芥、棉花、大米草、玉米等種間雜交后代的研究發(fā)現(xiàn),外源物種DNA的導(dǎo)入可誘發(fā)受體物種基因組廣泛的DNA甲基化水平和模式的變化,引發(fā)相關(guān)基因的表達(dá)或沉默,進(jìn)而引起種間雜交后代的基因表達(dá)的表型與其雙親具有顯著差異[6-7]。因此,DNA甲基化水平和模式的改變一方面為種間雜交創(chuàng)造新的遺傳變異提供了新的育種途徑和思路,但同時(shí)對(duì)野生優(yōu)異基因的有效利用提出了新的挑戰(zhàn)。為此,闡明種間雜交后代中甲基化模式的變異的遺傳與分子機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義。

東鄉(xiāng)野生稻是一種全球分布最北的普通野生稻(OryzarufipogonGriff.),蘊(yùn)藏大量栽培稻品種改良所沒(méi)有的優(yōu)異基因,如高產(chǎn)、強(qiáng)耐冷、抗旱等[8]。利用東鄉(xiāng)野生稻創(chuàng)制水稻(O.sativaL.)新種質(zhì)已成為改良栽培稻重要農(nóng)藝性狀和拓寬水稻遺傳基礎(chǔ)的重要課題。此前本課題組通過(guò)種間雜交和多次回交、自交獲得了一些攜帶野生稻優(yōu)異基因的抗旱、耐冷、耐低磷漸滲系[8-9]。隨后的研究發(fā)現(xiàn),這些高世代漸滲系中伴隨一些非孟德?tīng)柺降谋碛^遺傳變異,如高世代(BC1F9)強(qiáng)耐冷漸滲系IL5243和IL5335在株型、株高以及谷粒顏色等形態(tài)學(xué)性狀還存在一定變異或分離,其逆轉(zhuǎn)錄酶的序列結(jié)構(gòu)和熒光定量的相對(duì)表達(dá)量與供體親本有很大的差異[10],減數(shù)分裂也存在落后染色體及雙核仁等不穩(wěn)定現(xiàn)象[8]。為了更全面地了解野生稻優(yōu)異基因在向栽培稻漸滲過(guò)程中發(fā)生的遺傳與表觀遺傳變異特征,本研究基于水稻全基因組序列信息,對(duì)水稻全基因組的CpG島進(jìn)行分析,利用CpG兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)甲基化特異性PCR擴(kuò)增引物,分析東鄉(xiāng)野生稻耐冷漸滲系的在種間雜交漸滲過(guò)程中所發(fā)生甲基化水平和模式變化特征。在此基礎(chǔ)上,基于我們此前鑒定的東鄉(xiāng)野生稻耐冷基因粗定位QTLs結(jié)果[11]和耐冷漸滲系中已發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄酶活性變化的轉(zhuǎn)座子結(jié)果[10],對(duì)漸滲系基因組的特定區(qū)域的CpG島甲基化水平和模式變化特征作進(jìn)一步分析,探討DNA甲基化水平和模式變化對(duì)外源優(yōu)異基因漸滲的影響,為東鄉(xiāng)野生稻耐冷基因在實(shí)際育種中的充分利用提供有益信息。

1 材料和方法

1.1 材 料

本課題組此前以東鄉(xiāng)野生稻(O.rufipogonGriff.)為供體親本,以栽培稻‘協(xié)青早B’(O.sativaL.cv.XieqingzaoB)為受體親本雜交獲得種間雜種F1。種間雜種F1隨后與受體親本進(jìn)行回交得BC1F1,經(jīng)單粒傳連續(xù)自交得BC1F9代群體,該漸滲群體經(jīng)耐冷鑒定篩選,獲得強(qiáng)耐冷漸滲系IL5335和IL5243[8]。本文以東鄉(xiāng)野生稻耐冷漸滲系(IL5335和IL5423)及其雙親為試材,研究其基因組和特定位點(diǎn)DNA甲基化水平和模式變化特征。

1.2 CpG島甲基化特異擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

利用Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中水稻基因組信息,均勻地選擇分布在12條染色體上不同BAC中的DNA序列,結(jié)合我們對(duì)耐冷基因粗定位結(jié)果[11],利用程序Methyl Primer Express v1.0在這些序列中尋找CpG島,針對(duì)這些富含CG序列的DNA利用Primers 3 Input(version 4.0)設(shè)計(jì)了98對(duì)甲基化特異性PCR擴(kuò)增引物,其中15對(duì)為耐冷基因QTL定位區(qū)間的引物,其余83條為覆蓋全基因組的甲基化特異性擴(kuò)增引物。耐冷粗定位區(qū)間為第1號(hào)染色體上的RM246-RM1095,4號(hào)染色體上的S47M-S410M,12號(hào)染色體上的RM519-RM270[11]。另外,我們此前發(fā)現(xiàn)耐冷漸滲系中逆轉(zhuǎn)座子Houba和Osr15已發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄酶活性變化[10],為此根據(jù)各染色體上Houba和Osr15轉(zhuǎn)座區(qū)域的DNA序列,設(shè)計(jì)特異引物51對(duì)。引物序列交于上海英俊公司合成。

1.3 甲基化引物擴(kuò)增分析

采用CTAB法提取水稻基因組DNA。DNA檢測(cè)合格后用McrBC酶于37 ℃酶切(約16 h以上),隨后65 ℃溫育1 h使酶滅活終止酶切,McrBC酶酶切體系50 μL,包含10×NBE buffer 5 μL,100×BSA 0.5 μL,GTP(100 mmol/L)0.5 μL,McrBC酶(10 U/μL)1 μL,DNA 1 μL,滅菌ddH2O 42 μL。酶切產(chǎn)物用ddH2O稀釋10倍備用,并用陽(yáng)性和陰性引物檢測(cè)酶切是否完全。陽(yáng)性引物是針對(duì)Tos17基因設(shè)計(jì)的(正向引物:GCTACCCGTTCTTGGACTAT;反向引物:CTGAAATCGGAGCACTGACA);陰性引物是針對(duì)不易發(fā)生甲基化的激酶位點(diǎn)設(shè)計(jì)的(正向引物:CGACTAAACCACTCCAA-TCATC;反向引物:CCAATCAAAACTTCTCCTGTAA)。酶切時(shí)設(shè)空白對(duì)照,即酶切體系中McrBC酶用ddH2O代替,其他體系相同[12]。

McrBC酶切完全DNA樣品用于甲基化引物擴(kuò)增,擴(kuò)增反應(yīng)總體積為15 μL,包含10×buffer 1.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)0.9 μL,dNTP(2.5 mmol/L)1.2 μL,甲基化引物(5 μmol/L)2.0 μL,Taqpolymerase(5 U/μL)0.2 μL,McrBC酶切后的模板DNA(25 ng/μL)2 μL,滅菌水7.2 μL。PCR擴(kuò)增條件為96 ℃預(yù)變性5 min,96 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán)后,72 ℃延伸10 min,最后4 ℃保存5 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè),并利用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照,每對(duì)引物對(duì)所有材料的擴(kuò)增重復(fù)3次。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)中未擴(kuò)增出來(lái)的材料同樣也進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

沒(méi)有擴(kuò)增條帶的記為“0”,表示該DNA片段具有甲基化位點(diǎn);擴(kuò)增出目的條帶的記為“1”,表示該DNA片段無(wú)甲基化位點(diǎn)。CpG甲基化模式變化分為A、B、C三類,其中A類表示受體親本‘協(xié)青早B’的甲基化模式在漸滲后代中被穩(wěn)定遺傳,包括A1、A2兩個(gè)亞類;受體親本‘協(xié)青早B’中無(wú)甲基化的位點(diǎn)在漸滲后代變?yōu)榧谆稽c(diǎn)的情況定為B類,即發(fā)生了過(guò)甲基化變異;C類表示‘協(xié)青早B’為甲基化位點(diǎn),而漸滲后代中變無(wú)甲基化位點(diǎn),即發(fā)生了脫甲基化變異。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA酶切效果檢測(cè)

為了確定McrBC酶對(duì)參試材料的基因組DNA酶切是否完全,本研究分別采用陽(yáng)性和陰性引物對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。陽(yáng)性引物可擴(kuò)增基因組最易發(fā)生甲基化且被切開(kāi)的Tos17基因,如果酶切不完全,材料可擴(kuò)增出1條700 bp左右的條帶;陰性引物是針對(duì)不易發(fā)生甲基化的激酶位點(diǎn)設(shè)計(jì)的,可擴(kuò)增出約200 bp左右的片段。本研究的McrBC酶切產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果表明(圖1,A),漸滲系及其雙親的酶切產(chǎn)物的陽(yáng)性引物擴(kuò)增均無(wú)700 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物,用陰性引物擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)1條200 bp的條帶,表明漸滲系及其雙親的McrBC酶切產(chǎn)物可用于進(jìn)一步甲基化檢測(cè)。

2.2 耐冷漸滲系基因組甲基化水平和模式變化特點(diǎn)

本研究利用覆蓋全基因組12條染色體上的83對(duì)特異性甲基化引物,對(duì)McrBC酶酶切后的雙親和東鄉(xiāng)野生稻耐冷漸滲系(IL5335和IL5423)進(jìn)行特異擴(kuò)增,分析其甲基化水平和模式變化特點(diǎn)。結(jié)果表明,受體親本‘協(xié)青早B’、供體親本東鄉(xiāng)野生稻和兩耐冷漸滲系都具有較高頻率的DNA甲基化(45.4%～62.6%)。其中,受體親本‘協(xié)青早B’的甲基化修飾程度要遠(yuǎn)高出供體親本東鄉(xiāng)野生稻,分別為62.6%和45.4%(表1和圖1,B);耐冷漸滲系(IL5335和IL5243)的甲基化水平介于雙親之間,且與受體親本存在明顯差異,分別為46.6%和53.8%。IL5335的甲基化水平與東鄉(xiāng)野生稻比較接近,兩者無(wú)顯著性差異。表明種間雜交漸滲誘發(fā)了受體親本的甲基化水平發(fā)生了顯著變化,而且在不同的漸滲系中甲基化水平變異也存在明顯差異。

進(jìn)一步分析這83個(gè)CpG島甲基化模式的遺傳和變異特征發(fā)現(xiàn),漸滲系的CpG島甲基化模式變異主要分為A、B、C三類(表2),其中A類表示受體親本‘協(xié)青早B’的甲基化模式在漸滲中能穩(wěn)定遺傳,分為A1、A2兩個(gè)亞類。A1和A2分別表示未甲基化位點(diǎn)的遺傳和甲基化位點(diǎn)的遺傳模式。B類和C類分別表示耐冷漸滲系中發(fā)生了過(guò)甲基化變異和脫甲基化變異。統(tǒng)計(jì)分析表明,大部分受體親本‘協(xié)青早B’甲基化模式在兩耐冷漸滲系IL5335和IL5243中能穩(wěn)定遺傳,遺傳率分別為75.9%和80.7%。兩耐冷漸滲系與受體親本相比,分別有20和16個(gè)CpG島位點(diǎn)發(fā)生了甲基化模式變異,并主要表現(xiàn)為脫甲基化變異(C類)和過(guò)甲基化變異(B類)。其中IL5335和IL5243脫甲基化頻率分別為18.1%和13.3%;過(guò)甲基化變化(B類)分別為4.4%和6%。表明種間雜交漸滲誘發(fā)了受體親本的甲基化模式發(fā)生了顯著變異。

圖1 參試材料McrBC酶切效果檢測(cè)(A)與DNA甲基化分析部分電泳圖(B)M.Marker;P、N對(duì)應(yīng)的泳道分別表示陽(yáng)性和陰性引物對(duì)參試材料的擴(kuò)增;a～d對(duì)應(yīng)泳道的材料分別為栽培稻‘協(xié)青早B’、東鄉(xiāng)野生稻、IL5335和IL5243;0對(duì)應(yīng)的泳道表示無(wú)擴(kuò)增條帶,表示該位點(diǎn)DNA含有甲基化,1對(duì)應(yīng)的泳道表示擴(kuò)增出目的條帶,表示該位點(diǎn)無(wú)DNA甲基化

表1 耐冷漸滲系及其雙親基因組DNA甲基化水平特征

注:XB.協(xié)青早B;DWR.東鄉(xiāng)野生稻;Mean為平均值;同列不同字母表示0.05水平顯著性差異;下同。

Note:XB.OryzasativaL.cv.Xieqingzao B;DWR.Dongxiang wild rice.Mean:average values of the different material.The different normal letter within the same column represents significant difference at 0.05 level.The same as below.

表2 耐冷漸滲系基因組DNA甲基化模式的遺傳與變異特點(diǎn)

注:XB(-)和ILs(-)分別表示在XB和ILs中未擴(kuò)增出目的條帶,表示在相應(yīng)的位點(diǎn)中發(fā)生了DNA甲基化;XB(+)和ILs(+)分別表示在XB和ILs中能擴(kuò)增出目的條帶,表示在相應(yīng)的位點(diǎn)未發(fā)生DNA甲基化;每列括號(hào)前的數(shù)據(jù)表示位點(diǎn)數(shù),括號(hào)內(nèi)表示其頻率;下同。

Note:XB(-) and ILs(-) represent no band had been amplified in XB and ILs,respectively,which means that it’s DNA methylation site;XB(+) and ILs(+) represent bands could be amplified in XB and ILs,respectively,which means that it’s non-methylation site.The data before brackets was the number of locus,and in the brackets was its frequency;The same as below.

2.3 耐冷粗定位區(qū)間DNA甲基化變化特點(diǎn)

基于我們前期東鄉(xiāng)野生稻耐冷QTLs的粗定位結(jié)果,對(duì)漸滲系的耐冷粗定位區(qū)間的CpG進(jìn)行甲基化水平和模式特征分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),受體親本‘協(xié)青早B’在耐冷粗定位區(qū)間的甲基化水平達(dá)53.3%,與全基因組CpG島甲基化水平(61.4%)無(wú)顯著性差異。東鄉(xiāng)野生稻和兩耐冷漸滲系(IL5335和IL5243)在該區(qū)間的甲基化水平分別為20.0%、13.3%和26.7%,低于其全基因組CpG島甲基化的平均水平(表1和表3)。受體親本‘協(xié)青早B’的甲基化模式(A1和A2)大部分在兩耐冷漸滲系中能得到較穩(wěn)定的遺傳,分別為70.0%和60.0%。與受體親本相比,IL5335和IL5243耐冷漸滲系中也發(fā)現(xiàn)一定比例的甲基化遺傳模式變異,并主要表現(xiàn)為脫甲基化(C類),分別為40%和33.3%,高于全基因甲基化模式的變異的平均水平(表1和表3)。

2.4 逆轉(zhuǎn)座子區(qū)域DNA甲基化變化特點(diǎn)

基于我們此前的研究結(jié)果,針對(duì)耐冷漸滲系(IL5335和IL5243)中已發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄酶活性變化的逆轉(zhuǎn)座子Houba和Osr15區(qū)域設(shè)計(jì)了51對(duì)甲基化引物,進(jìn)一步研究雙親及耐冷漸滲系在特定相關(guān)區(qū)域的甲基化水平和模式變化特征。研究發(fā)現(xiàn),在Houba和Osr15逆轉(zhuǎn)座子區(qū)域,‘協(xié)青早B’、東鄉(xiāng)野生稻、IL5335和IL5243的甲基化水平分別為62.7%、56.9%、66.7%和49.0%,均高于全基因組DNA甲基化的平均水平(表1和表4)。在Houba和Osr15區(qū)域,‘協(xié)青早B’、IL5335和IL5243之間的甲基化水平無(wú)顯著差異,但均與東鄉(xiāng)野生稻之間存在顯著差異。IL5335和IL5243甲基化模式大部分繼承(86.6%)大部分與受體親本’協(xié)青早B’一致,并主要表現(xiàn)為A1類型的遺傳模式。在轉(zhuǎn)座子區(qū)域,IL5335和IL5243的甲基化模式總變異率(包括過(guò)甲基化和脫甲基化)分別為15.7%和9.8%,均低于其他區(qū)域甲基化模式的變異率。表明耐冷漸滲系在Houba和Osr14轉(zhuǎn)座子區(qū)域具有較高頻率的甲基化修飾和較低的甲基化模式變異率,這利于轉(zhuǎn)座子和基因組結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,為漸滲系優(yōu)異性狀的轉(zhuǎn)移和性狀穩(wěn)定奠定基礎(chǔ)。

表3 耐冷漸滲系在耐冷區(qū)間DNA甲基化水平和模式的遺傳與變異特點(diǎn)

表4 耐冷漸滲系在逆轉(zhuǎn)座子區(qū)域DNA甲基化水平和模式的遺傳與變異特點(diǎn)

3 討 論

外源DNA漸滲會(huì)給受體基因組帶來(lái)一種強(qiáng)烈的“沖擊”(Genome shock),這種沖擊不僅表現(xiàn)在漸滲系后代中會(huì)產(chǎn)生各種基于基因組序列變化的遺傳學(xué)變異,同時(shí)還可能發(fā)生許多表觀遺傳學(xué)變異[13]。遠(yuǎn)緣雜交育種實(shí)踐告訴我們,表觀遺傳學(xué)變異在許多作物新品種改良創(chuàng)造了很多新的抗性和新表型,為作物遺傳育種提供了新途徑,因而對(duì)這些變異發(fā)生的分子機(jī)制深入研究將有助于作物品種改良[6,14]。作為表觀遺傳修飾的重要內(nèi)容,DNA甲基化可在阻斷遺傳信息傳遞而不改變DNA序列的情況下引起生物體形態(tài)性狀的變化。闡明遠(yuǎn)緣雜交漸滲過(guò)程中基因組的甲基化水平和模式變異特征及分子機(jī)制可為物種的多樣性維持機(jī)制和分子進(jìn)化機(jī)制提供理論基礎(chǔ),同時(shí)也對(duì)新品種的培育提供有益信息,相關(guān)研究已成為表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)[15-16]。

McrBC是一種甲基化內(nèi)切酶,可特異切割含有甲基化胞嘧啶的DNA單鏈或雙鏈,但不作用于非甲基化的DNA。結(jié)合PCR技術(shù),此方法不僅可以檢測(cè)絕大部分甲基化的胞嘧啶(如5-甲基胞嘧啶,5-羥甲基胞嘧啶或N4-甲基胞嘧啶),還可針對(duì)特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,研究特定染色體區(qū)域的甲基化特征,是檢測(cè)胞嘧啶甲基化的有利工具[17]。本研究利用該技術(shù)分析耐冷漸滲系全基因組83個(gè)CpG島和66個(gè)特定區(qū)域CpG島(15耐冷區(qū)間和51轉(zhuǎn)座子區(qū)間)發(fā)現(xiàn),兩耐冷漸滲后代穩(wěn)定遺傳了回交親本的大部分甲基化水平和模式,但也有一部分位點(diǎn)發(fā)生了DNA甲基化模式的變異,包括過(guò)甲基化和脫甲基化,但不同區(qū)域CpG位點(diǎn)甲基化水平和變異模式有明顯差異,這與水稻[14-15]、擬南芥[18]、大米草[19]以及玉米[20]等植物雜交后代的甲基化研究相似。與其他DNA甲基化檢測(cè)方法(如甲基化敏感多態(tài)性,MSAP)相比,McrBC酶切法檢測(cè)得到的DNA甲基化頻率略低一些[4,21],但該技術(shù)技術(shù)穩(wěn)定、重復(fù)性好,能精確研究特定位點(diǎn)、特定基因的甲基化水平和模式變異特征,是研究DNA甲基化水平和模式變化對(duì)外源優(yōu)異基因漸滲影響的有效手段。

通常認(rèn)為基因處于甲基化修飾狀態(tài)時(shí)表達(dá)抑制,而處于非甲基化狀態(tài)時(shí)表達(dá)活躍,但無(wú)論基因處于何種狀態(tài),都可能使?jié)u滲后代產(chǎn)生相關(guān)有利性狀的增強(qiáng)或者產(chǎn)生親本沒(méi)有的有利新表型,這取決于特異位點(diǎn)的甲基化增強(qiáng)或降低對(duì)這些性狀的影響[6-7]。本研究結(jié)果表明,兩耐冷漸滲系與受體親本‘協(xié)青早B’相比,漸滲后代甲基化變異包括脫甲基化和過(guò)甲基化兩種方式,并以脫甲基化為主,東鄉(xiāng)野生稻和兩耐冷漸滲后代IL5335和IL5243在耐冷QTLs粗定位區(qū)間的甲基化水平明顯低于普通區(qū)間的CpG島甲基化水平(分別為20.0%、13.3%和26.7%),并且發(fā)生甲基化模式變化的位點(diǎn)中有53.8%是在該區(qū)域,推測(cè)優(yōu)異漸滲系在其形成過(guò)程中發(fā)生了更為廣泛的DNA甲基化模式變化,但耐冷QTLs區(qū)間的優(yōu)異基因在雜交漸滲過(guò)程中的DNA甲基化變異特征和分子機(jī)制還需進(jìn)一步深入的研究。另外,我們此前發(fā)現(xiàn)漸滲系中Houba和Osr14轉(zhuǎn)座子的活性較高,而本研究的結(jié)果表明,各參試材料在Houba和Osr14轉(zhuǎn)座子區(qū)域的甲基化水平較其他區(qū)域要略高,這是否與DNA甲基化沉默轉(zhuǎn)座子的活性、促進(jìn)漸滲系性狀穩(wěn)定有關(guān)也還有待于進(jìn)一步研究。

[1] DONG Z Y,WANG Y M,ZHANG Z J,etal.Extent and pattern of DNA methylation alteration in rice lines derived from introgressive hybridization of rice andZizanialatifoliaGriseb[J].TheoreticalandAppliedGenetics,2006,113:196-205.

[2] GOLL M G,BESTOR T H.Eukaryotic cytosine methyltransferases[J].AnnualReviewofBiochemistry,2005,74:481-51.

[3] NYBOM H,WEISING K,ROTTER B.DNA fingerprinting in botany:past,present,future[J].InvestigativeGenetics,2014,5:1-35.

[4] CHEN L Z,CHEN J F.Changes of cytosine methylation induced by wide hybridization and allopolyploid in cucumis[J].Genome,2008,51(10):789-799.

[5] LI L Q(李麗琴),FU CH H(付春華),ZHAO CH F(趙春芳),etal.Genetic and epigenetic variations ofTaxusmediaL.cv.hicksii during process of dedifferentiation[J].PlantPhysiologyCommunications(植物生理學(xué)通訊),2009,45(6):544-548(in Chinese).

[6] SANETOMO R,HOSAKA K.Reciprocal differences in DNA sequence and methylation status of the pollen DNA between F1hybrids ofSolanumtuberosum×S.demissum[J].Euphytica,2011,182:219-229.

[7] ABID G,MUHOVISKI Y,JACQUEMIN J M,etal.Changes in DNA-methylation during zygotic embryogenesis in interspecific hybrids of beans(Phaseolusssp.)[J].PlantCellTissOrganCulture,2011,105:383-393.

[8] LUO X D,JIAN S R,CAO J F,etal.Identification and molecular cytology analysis of cold tolerance introgression lines derived fromOryzasativaL.mating withO.rufipogonGriff[J].Euphytica,2012,187:461-469.

[9] JIAN SH R(簡(jiǎn)水溶),WAN Y(萬(wàn) 勇),LUO X D(羅向東),etal.Genetic analysis of cold tolerance at the seedling stage in Dongxiang wild rice(Oryzarufipogon)[J].ChineseBulletinofBotany(植物學(xué)報(bào)),2011,46(1):21-27(in Chinese).

[10] CHEN Y L(陳雅玲),LUO X D(羅向東),ZHANG F T(張帆濤),etal.Cloning and expression analysis of retrotransposon reverse transcriptase in introgression lines from Dongxiang wild rice[J].ChineseBulletinofBotany(植物學(xué)報(bào)),2013,48(2):138-144(in Chinese).

[11] 簡(jiǎn)水溶.東鄉(xiāng)野生稻耐冷性狀的QTL定位[D].南昌:江西師范大學(xué),2011.

[12] SCHUMACHER A,KAPRANOV P,KAMINSKY Z,etal.Microarray-based DNA methylation profiling:technology and applications[J].NucleicAcidsResearch,2006,34:528-542.

[13] DENG X J,LUO X D,CHEN Y L,etal.Genetic diversity and genetic changes in the introgression lines derived fromOryzasativaL.mating withO.rufipogonGriff[J].JournalofIntegrativeAgriculture,2012,11(7):1 059-1 066.

[14] YASUDA K,TSUKIYAMA T,KARKI S,etal.Mobilization of the active transposon mPing in interspecific hybrid rice betweenOryzasativaandO.glaberrima[J].Euphytica,2013,192:17-24.

[15] KANTAMA L,JUNBUATHONG S,SAKULKOO J,etal.Epigenetic changes and transposon reactivation in Thai rice hybrids[J].MolecularBreeding,2013,31:815-827.

[16] WANG W S,PAN Y J,ZHAO X Q,etal.Drought-induced site-specific DNA methylation and its association with drought tolerance in rice(OryzasativaL.)[J].JournalofExperimentalBotany,2011,62:1 951-1 960.

[17] ZILBERMAN D,HENIKOFF S.Genome-wide analysis of DNA methylation patterns[J].Development,2007,134:3 959-3 965.

[18] MADLUNG A,MASUELLI R W,WATSON B,etal.Remodeling of DNA methylation and phenotypic and transcriptional changes in syntheticArabidopsisallotetraploids[J].PlantPhysiology,2002,129:733-746.

[19] SALMON A,AINOUCHE M L,WENDEL J F.Genetic and epigenetic consequences of recent hybridization and polyploidy inSpartina(Poaceae)[J].MolecularEcology,2005,14:1 163-1 175.

[20] SEKHON R S,CHOPRA S.Progressive loss of DNA methylation releases epigenetic gene silencing from a tandemly repeated maizeMybgene[J].Genetics,2009,181:81-91.

[21] DONG Z Y,WANG Y M,ZHANG Z J,etal.Extent and pattern of DNA methylation alteration in rice lines derived from introgressive hybridization of rice andZizanialatifoliaGriseb[J].TheoreticalandAppliedGenetics,2006,113:196-205.

(編輯:宋亞珍)

DNA Methylation Level and Pattern Changes in Cold ToleranceIntrogression Lines Derived fromOryzarufipogonGriff.

WEN Xiufang,DAI Liangfang,ZHAO Jun,LUO Xiangdong*,DENG Xiaojuan,ZHANG Fantao,XIE Jiankun

(College of Life Science,Jiangxi Normal University,Nanchang 330022,China)

In the present study,DNA methylation specific PCR primers were designed according to the sequences of CpG island region throughout 12 chromosomes and the specific genomic position.In order to investigate the changes of DNA methylation level and pattern in the cold tolerance introgression lines (ILs,IL5335 and IL5423) and their parents,we used these special primers to amplify the previously digested genomic DNA by McrBC enzyme.(1)Analysis of 83 pairs of primers distributed across the 12 chromosomes of rice showed that the frequency of DNA methylation in IL5335 and IL5423 was to 46.6% and 53.8%,respectively,which was lower than that of recurrent parent (OryzasativaL.cv.Xieqingzao B).Most of DNA methylation patterns of recurrent parent could be inherited in the ILs.At the same time,some of methylation patterns have changed including demethylation (13.3-18.1%) and hypermethylation (4.4%-6.0%).(2)In the QTLs region related to cold tolerance,the frequency of DNA methylation in IL5335 and IL5423 was 13.3%-26.7%,which was much lower than that of recurrent parent.The frequency of DNA methylation patterns changes of the two ILs in the QTLs region was mainly for demethylation (33.3%-40.0%),which was higher than that of the average variation frequency of whole-genome.(3)Further analysis on 51 pairs of primers based on two retrotransposons (HoubaandOsr14) demonstrated that there was higher level of frequency of DNA methylation and lower frequency of methylation pattern changes.These results suggested that the extensive DNA methylation level and pattern changes have been happened during the interspecific hybridization and alien gene introgression,which would provide useful information for efficiently exploiting and using the interesting wild genes for rice enhancement.

Dongxiang wild rice;cold tolerance introgression lines;DNA methylation;McrBC enzyme

1000-4025(2015)04-0694-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0694

2014-12-27;修改稿收到日期:2015-01-25

國(guó)家自然科學(xué)基金(31260255);江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(GJJ12184);江西省科技支撐計(jì)劃(20122BBF60064);江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)計(jì)劃(20112BCB23007)

溫秀芳(1989-),女,在讀碩士研究生,主要從事植物遺傳與分子生物學(xué)研究。E-mail:1025108610@qq.com

*通信作者:羅向東,博士,教授,主要從事植物遺傳與分子生物學(xué)研究。E-mail:xdluolf@163.com

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