棉花HSP70基因的克隆與原核表達

劉 娜,曲延英,陳全家,倪志勇

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,烏魯木齊 830052)

棉花HSP70基因的克隆與原核表達

劉 娜,曲延英,陳全家,倪志勇*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,烏魯木齊 830052)

以抗旱性較強的棉花品種‘KK1543’為材料,采用RT-PCR技術(shù)克隆了1個棉花HSP70基因,命名為GhHSP70。研究結(jié)果表明:GhHSP70基因開放閱讀框長1 997 bp,編碼648個氨基酸,GhHSP70蛋白相對分子量為 70.94 kD,等電點為4.83。氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn),GhHSP70與歐洲大葉楊HSP70的親緣關(guān)系最近,氨基酸序列一致性達到96.4%。為進一步分析基因的功能,構(gòu)建原核表達載體pGEX-4T-1-GhHSP70,并在大腸桿菌中異源表達。SDS-PAGE分析表明所表達蛋白與預(yù)期蛋白大小一致,重組蛋白在37 ℃,0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)2 h時表達量最大。研究為進一步研究棉花HSP70基因功能奠定基礎(chǔ)。

棉花;熱激蛋白70;基因克隆;原核表達

干旱是世界上危害最嚴重的一種自然災(zāi)害,是一個長期存在的世界性難題。目前世界上有三分之一以上的土地處于干旱和半干旱地帶,其他地區(qū)在植物生長季節(jié)也常發(fā)生不同程度的干旱[1],干旱影響植物各個階段的生長發(fā)育和生理代謝過程。棉花是關(guān)系國計民生的重要物資,是僅次于糧食作物的第二大農(nóng)作物,其產(chǎn)值占中國經(jīng)濟作物的50%以上,在國民經(jīng)濟發(fā)展中具有重要地位[2]。干旱嚴重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì),已成為中國棉花生產(chǎn)發(fā)展的重要限制因素。因此提高棉花的抗旱能力已經(jīng)成為現(xiàn)代棉花研究工作中急需解決的關(guān)鍵問題之一。

熱激蛋白(HSPs,heat shock proteins)是細胞受到不利環(huán)境刺激時被激活并表達增強的一類蛋白[3-4]。該類蛋白根據(jù)分子量的大小主要分為4類:Hsp90家族(83～90 kD)、Hsp70家族(66～78 kD)、Hsp60家族及小Hsp家族。其中HSP70是HSP家族中最重要、研究最深入的一種,是重要的分子伴侶[5-8],它能防止蛋白變性,并輔助蛋白質(zhì)重折疊為正常構(gòu)象,或者將受到不可恢復(fù)傷害的蛋白通過蛋白水解途徑排除到細胞外,從而有利于生物體抵抗脅迫壓力[9]。HSP70對植物抵抗干旱、高溫、寒冷、氧化等脅迫乃至對植物的生長發(fā)育均起到十分重要的作用[10-13],是育種工作中不可多得的優(yōu)良基因。本研究前期采用蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)和生物信息學(xué)方法,對抗旱性較強的棉花品種‘KK1543’進行研究,獲得了113個在干旱脅迫下差異表達的蛋白。質(zhì)譜和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)點1312為棉花HSP70蛋白,這說明棉花HSP70蛋白可能在干旱脅迫應(yīng)答中具有功能[14]。

本研究根據(jù)獲得的HSP70蛋白的氨基酸序列設(shè)計引物,以棉花品種‘KK1543’為材料,克隆棉花HSP70基因,對其進行序列分析,同時構(gòu)建了基因的原核表達載體并在大腸桿菌中原核表達,為進一步研究棉花HSP70蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究材料

棉花品種‘KK1543’由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種實驗室提供。在實驗室已有的60份抗旱材料中,進行抗旱性篩選,發(fā)現(xiàn)‘KK1543’抗旱性較強。該品種不但具有抗旱性較好的特點、而且籽大,適用于水培條件下研究棉花的抗旱性。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取及cDNA第一鏈合成 利用Plus植物總RNA提取試劑盒(天根試劑公司)提取棉花葉片總RNA。按照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo試劑公司)說明書操作步驟,以獲得的棉花葉片總RNA為模板,合成cDNA第一條鏈。

1.2.2GhHSP70基因的擴增 根據(jù)前期質(zhì)譜分析獲得的棉花HSP70基因的氨基酸序列設(shè)計特異性引物GhHSP70-F(5′-AGAGTGATGGCCGGAAA-AGGAG-3′)和GhHSP70-R(5′-AGCTGTTAAACATCGGCAAAATACTATCT-3′),以棉花葉片cDNA第一鏈為模板,擴增基因。擴增體系:10×緩沖液(含Mg2+)5 μL,2.5 mmol/L dNTP 4 μL,10 μmol/L引物各2 μL,cDNA 1 μL,Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL,ddH2O 35.5 μL 。反應(yīng)程序:預(yù)變性94 ℃ 4 min,變性94 ℃ 30 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 1 min 30 s,35個循環(huán),再延伸72 ℃ 10 min,結(jié)束反應(yīng)。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物,采用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(天根試劑公司)純化PCR產(chǎn)物,通過T-A克隆法連接到pMD19-T(Takara試劑公司),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(寶信試劑公司),涂布于含有氨芐青霉素(50 mg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃過夜培養(yǎng)后,挑取白色單菌落,經(jīng)含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)12 h后,菌液PCR檢測是否有插入片段,將陽性克隆送往北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 通過檢索GenBank和利用DNAMAN等軟件進行同源性和多重序列比較分析。用 MEG 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,利用DNAStar的protean軟件預(yù)測二級結(jié)構(gòu),利用在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析棉花熱激蛋白70基因編碼的氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)。

1.2.4GhHSP70基因原核表達載體的構(gòu)建 根據(jù)原核表達載體pGEX-4T-1的多克隆位點,設(shè)計帶有酶切位點引物70-28-F(5′-TTAGGATCCATGGCCGGAAAAGGAGAAG-3′)和70-28-R(5′-TAAG-CGGCCGCTTAGTCGACTTCTTCTATCTTAGG-T-3′),并以pMD19-T-GhHSP70質(zhì)粒為模板,按上述體系和程序進行PCR擴增,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。利用NotⅠ和BamHⅠ(Thermo試劑公司)分別雙酶切PCR純化產(chǎn)物與空質(zhì)粒pGEX-4T-1,酶切產(chǎn)物純化后,用T4DNA連接酶22 ℃定向連接20 min,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,通過菌液PCR初步篩選陽性重組子,陽性克隆送上海美季測序公司測序。

1.2.5GhHSP70基因的原核表達 使用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞(北京全式金),涂布于含有氨芐青霉素(50 mg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落,經(jīng)含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)12 h后,通過菌液PCR篩選陽性克隆。

將重組菌株接種于2 mL含50 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。然后按1∶50比例轉(zhuǎn)接到10 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中(含50 mg/L氨芐青霉素),225 r/min培養(yǎng)3 h(OD600≈0.6),加入IPTG至終濃度分別為0、0.2、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L,37 ℃誘導(dǎo)4 h后收集菌液。以0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h的pGEX-4T-1空載體作為對照。8 000 r/min,離心10 min,棄上清,菌體樣品加入30 μL 2×上樣緩沖液和50 μL ddH2O,混勻,在100 ℃的沸水中煮沸10 min,冰上冷卻后,取10 μL進行 SDS-PAGE(5%濃縮膠,12%分離膠)電泳檢測。電泳后經(jīng)考馬斯亮蘭染色、拍照,分析蛋白表達結(jié)果,確定最適IPTG誘導(dǎo)濃度。

按上述方法,以終濃度為1 mmol/L IPTG進行重組菌株表達蛋白的誘導(dǎo)表達,以相同條件的pGEX-4T-1轉(zhuǎn)化菌為對照。37 ℃培養(yǎng)0、2、4和6 h后分別收集菌液,進行SDS-PAGE(5%濃縮膠,12%分離膠)電泳檢測,分析蛋白表達結(jié)果,確定最適培養(yǎng)時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhHSP70基因克隆與序列分析

以棉花葉片cDNA為模板,利用引物GhHSP70-F和GhHSP70-R,通過PCR擴增獲得一條大約2 kb左右的特異條帶(圖1)。通過T-A克隆將擴增產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體上,獲得重組質(zhì)粒pMD19-T-HSP70,測序結(jié)果表明該基因ORF為1 997 bp,5′末端長為170 bp,3′末端長202 bp編碼含648個氨基酸殘基蛋白;利用DNAMAN軟件預(yù)測的蛋白質(zhì)的理論分子量為 70.94 kD,等電點為4.83。

同源性比對分析表明,棉花HSP70具有3個典型的HSP70簽名基序序列(IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSLL、VVLVGGSTRIPKVQQ),其在氨基酸序列中所處的位置基本上相同,C-端特征基序均為EEVD,所得氨基酸序列在NCBI中進行Blast分析表明,第9個氨基酸到第618個氨基酸為該序列的結(jié)構(gòu)域(圖4)。GhHSP70編碼的氨基酸

序列與已報道其他植物的HSP70序列都具有高度的同源性,其中與歐洲大葉楊HSP70的氨基酸水平一致性達到96.4%,表明HSP70進化的保守性。

將棉花HSP70的氨基酸序列與其他已報道植物的HSP70進行多序列比對,利用CLUSTALW和MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖2)。從圖3可以看出,棉花(Gossypiumhirsutum)HSP70與歐洲大葉楊(Populustrichocarpa)HSP70為同一分支,說明棉花與歐洲大葉楊在進化上親緣關(guān)系較近。

利用DNAStar軟件的protean程序?qū)γ藁℉SP70氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖3)。結(jié)果表明,該蛋白的二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、 β-折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成。利用在線軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/對棉花HSP70蛋白的跨膜區(qū)進行預(yù)測,表明棉花HSP70蛋白無跨膜區(qū),預(yù)測結(jié)果如下(圖5)。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖1.RT-PCR產(chǎn)物;M.DL2000

圖2 系統(tǒng)進化樹

圖3 GhHSP70二級結(jié)構(gòu)預(yù)測標尺表示蛋白序列區(qū)段

圖4 棉花與其他植物的HSP70的氨基酸序列比對結(jié)果劃線部分為GhHSP70結(jié)構(gòu)域,陰影部分表示同源氨基酸殘基、簽名序列和胞質(zhì)HSP70 C-末端特征基序標出;CsHSP70.黃瓜(XP_004142749.1);JcHSP70.桐油樹(KDP44981.1);MdHSP70.蘋果(XP_008370710.1);MnHSP70.川桑(EXB58128.1);NtHSP70.煙草(AAR17080.1);ObHSP70.短花稻(XP_006663128.1);OSHSP70.水稻(NP_001068540.1);PtHSP70.歐洲大葉楊(XP_002311161.1);TcHSP70.可可(XP_007009362.1);VvHSP70.葡萄(XP_002284008.1);GhHSP70.棉花(ACJ11742)

2.2 GhHSP70基因原核表達載體構(gòu)建與表達分析

對重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GhHSP70進行菌液PCR檢測,電泳結(jié)果見圖6,在1 997 bp位置處有1條目的條帶與預(yù)期結(jié)果一致,同時,該重組載體插入DNA片段的測序結(jié)果與棉花HSP70基因序列完全相同,表明棉花HSP70基因的原核表達載體構(gòu)建成功。

圖5 TMHMM工具預(yù)測結(jié)果圖

圖6 pGEX-4T-1-GhHSP70菌液PCR

圖7 IPTG終濃度對 HSP70蛋白表達的影響M.蛋白質(zhì)標準分子量;1.pGEX-4T-1空載體未誘導(dǎo);2.pGEX-4T-1空載體經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h;3.pGEX-4T-1-GhHSP70未誘導(dǎo);4～8.pGEX-4T-1-GhHSP70分別經(jīng)終濃度為0.2、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h

圖8 IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)時間對HSP70蛋白表達的影響M.蛋白質(zhì)標準分子量;1.pGEX-4T-1空載體未誘導(dǎo);2.pGEX-4T-1空載體經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h;3.pGEX-4T-1-GhHSP70未誘導(dǎo);4～6.pGEX-4T-1-GhHSP70經(jīng)0.5 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)2、4和6 h

在37 ℃下,在終濃度為 0.2、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的IPTG與不加IPTG下,分別對含重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GhHSP70的大腸桿菌進行表達誘導(dǎo)4 h,對pGEX-4T-1空載體在0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達4 h,其表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果(圖7)顯示,在5個不同濃度的IPTG誘導(dǎo)下,均能誘導(dǎo)出融合蛋白,且所表達蛋白與預(yù)期蛋白大小一致,而pGEX-4T-1空載體則沒有融合蛋白表達,表明0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)就獲得最佳的蛋白誘導(dǎo)效果。

在37 ℃下,用IPTG(0.5 mmol/L)誘導(dǎo)棉花HSP70重組蛋白表達,分別誘導(dǎo)0、2、4和6 h。發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)時間為2、4和6 h,均能誘導(dǎo)出融合蛋白,其中誘導(dǎo)時間為2 h時重組蛋白表達量就已達到最大值。而經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h的pGEX-4T-1空載體則沒有融合蛋白表達(圖8)。

3 討 論

HSP70是研究最多、在生物體內(nèi)分布最廣、進化上最保守的一類熱激蛋白,在植物受到高溫、干旱、低溫、高鹽等非生物脅迫時可迅速并短時表達,以減少植物細胞受到的傷害。長期以來一直受到人們重視。而在各種非生物脅迫中,干旱對棉花產(chǎn)量的影響占首位,可以導(dǎo)致棉花細胞脫水、膜系統(tǒng)和酶系統(tǒng)遭到破壞、細胞功能喪失等[15]。因此,運用基因工程手段發(fā)掘和克隆抗旱基因,分離出與棉花抗旱品質(zhì)緊密相關(guān)的基因顯得至關(guān)重要,對于今后培育抗旱棉花新品系具有重大意義。

本研究則根據(jù)前期采用蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)和生物信息學(xué)方法,對抗旱性較強的棉花品種‘KK1543’進行研究,獲得了113個在干旱脅迫下差異表達的蛋白。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)點1312為棉花HSP70蛋白,推測該蛋白可能在干旱脅迫應(yīng)答中具有功能。因此以獲得的差異蛋白HSP70的氨基酸序列為基礎(chǔ),利用RT-PCR技術(shù)成功克隆出棉花HSP70基因,系統(tǒng)進化樹分析,發(fā)現(xiàn)棉花HSP70與已報道其他植物的HSP70均有較高的同源性,其中與歐洲大葉楊HSP70具有的氨基酸水平一致性最高,蛋白親緣關(guān)系最近。棉花HSP70氨基酸序列存在真核細胞HSP70家族的三個特征標簽以及真核細胞特征基序,含有四肽重復(fù)序列GGMP和ATP結(jié)合位點的特征性基序DLGTT-S-V(13-21)。 具有細胞質(zhì)定位的HSP70 C-末端特征基序EEVD。

外源基因在大腸桿菌中能否高效表達受很多因素的影響,如大腸桿菌菌株、誘導(dǎo)劑濃度、溫度和誘導(dǎo)時間等[16]。有報道指出,0.1～1 mmol/L范圍內(nèi)的IPTG均適于重組蛋白誘導(dǎo)表達[17],而低濃度的IPTG可以減少化學(xué)物質(zhì)對細胞的損傷[18]。在預(yù)實驗基礎(chǔ)上本實驗將IPTG濃度確定為0.2 mmol/L,在37 ℃下誘導(dǎo)2 h時重組蛋白表達量就已達到最大值,實驗結(jié)果證明該濃度誘導(dǎo)棉花HSP70重組蛋白表達是可行的。并為下一步純化GhHSP70蛋白以及研究其功能提供實驗基礎(chǔ)。GhHSP70基因在大腸桿菌中表達的實驗結(jié)果,為以后進一步將HSP基因應(yīng)用到棉花抗旱的實際育種工作中提供了有利的理論基礎(chǔ)。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Prokaryotic Expression of Heat ShockProtein 70 Gene inGossypiumhirsutumL.

LIU Na,QU Yanying,CHEN Quanjia,NI Zhiyong*

(College of Agronomy,Xinjiang Agricultural University,Key Laboratory of Agricultural Biological Technology,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

In this study,the strong drought-resistant cotton variety ‘KK1543’ was used as the material.RT-PCR method was used to clone aHSP70 gene,a gene coding forGhHSP70 was isolated from cotton (GossypiumhirsutumL.).The open reading frame was 1 997 bp,encoding 648 amino acid residues with a predicted molecular mass of 70.94 kDa and a basic isoelectric point of 4.83.Homology analysis and phylogenetic tree analysis founded that GhHSP70 shared 96.4% amino acid identity with the HSP70 fromPopulustrichocarpa,and GhHSP70 protein is close to PtHSP70.An expression vector pGEX-4T-1-GhHSP70 was constructed.Then,the recombinant plasmid was transformed intoEscherichiacoli.The SDS-PAGE results displayed that the expressed protein was consistent with the anticipated size.The expressed protein quantity induced by 0.2 mmol/L IPTG treatment for 2 h at 37 ℃ is the highest.This study provide a fundamental condition supporting research on function ofGhHSP70 gene.

cotton;heat shock protein 70;gene cloning;prokaryotic expression

1000-4025(2015)04-0688-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0688

2014-12-17;修改稿收到日期:2015-01-30

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2014211A025)

劉 娜(1990-),女,在讀博士研究生,主要從事棉花分子育種研究。E-mail:416549170@qq.com

Q785;Q786

A

*通信作者:倪志勇,博士,副教授,主要從事植物逆境分子生物學(xué)研究。E-mai:nizhiyong@126.com