辣椒雄性不育系葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因的克隆及表達分析

呂俊恒,文錦芬,莫云容,趙 凱,馬仲飛,鄧明華*

(1 云南農業(yè)大學 園林園藝學院,昆明650201;2昆明理工大學 現(xiàn)代工程學院,昆明 650500;3 昭通市昭陽區(qū)園藝技術推廣所,云南昭通 657000)

辣椒雄性不育系葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因的克隆及表達分析

呂俊恒1,文錦芬2,莫云容1,趙 凱1,馬仲飛3,鄧明華1*

(1 云南農業(yè)大學 園林園藝學院,昆明650201;2昆明理工大學 現(xiàn)代工程學院,昆明 650500;3 昭通市昭陽區(qū)園藝技術推廣所,云南昭通 657000)

為了深入研究辣椒雄性不育與能量代謝之間的關系,該研究以辣椒近緣物種番茄的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因(G6PDH)同源序列為基礎,采用電子克隆的方法克隆出辣椒CaG6PDH基因。利用熒光定量PCR技術,對辣椒雄性不育系9704A與其保持系9704B花蕾發(fā)育的不同階段,以及保持系9704B不同組織(莖、葉、花、果皮、胎座、種子)中CaG6PDH基因進行表達分析。結果表明:兩系中獲得的CaG6PDH基因的編碼序列一致,全長1 533 bp,編碼510個氨基酸殘基;辣椒CaG6PDH基因在保持系不同組織中表達量存在差異,胎座中表達量最高,莖中表達量最低;辣椒CaG6PDH基因的表達量在花蕾發(fā)育的不同階段雄性不育系均高于保持系,此種差異在小孢子發(fā)育的單核期與成熟期尤為明顯,這種差異可能使雄性不育系能量代謝供應出現(xiàn)異常,從而影響小孢子的正常發(fā)育而導致雄性敗育。

辣椒;葡萄糖-6-磷酸脫氫酶;雄性不育;基因克隆;熒光定量PCR

雄性不育是指存在于植物中雌蕊發(fā)育正常但花粉發(fā)育不良或者不能產生可育的花粉等雄性器官發(fā)生退化的現(xiàn)象,目前至少已經(jīng)在43科162屬320個種和297個種間雜交中發(fā)現(xiàn)了雄性不育現(xiàn)象[1-2]。雄性不育的形成原因包括光照、溫度、化學試劑和環(huán)境等一系列因素,在辣椒中主要分為細胞核與細胞質雄性不育。研究表明雄性不育的形成是由于小孢子發(fā)育期間能量代謝發(fā)生了異常,ATP供應異常導致小孢子不能正常發(fā)育,嚴重影響了花粉活力或者花粉管的萌發(fā),最終不能產生可育的花粉,導致植株敗育[3-8]。能量代謝在植物中處于極其重要的地位,能夠保證植物正常的生長發(fā)育,能量代謝又與呼吸代謝息息相關,呼吸代謝中存在幾種極其重要的途徑,包括戊糖磷酸途徑與糖酵解等。

戊糖磷酸途徑(PPP)是植物中重要的代謝途徑,與植物的生長發(fā)育密切相關。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)是PPP途徑中關鍵的限速酶,催化PPP第一步中6-磷酸葡萄糖的脫氫[9]。其產生的磷酸戊糖參與核酸代謝能夠產生NADPH,為脂肪酸、固醇類物質的合成提供還原力,NADPH的一系列反應還能夠與其它一系列物質形成共調控,與能量代謝緊密相關[10-11]。目前在小麥、煙草、馬鈴薯、菠菜、水稻等植物材料中均已分離出此基因[12-16]。

早期研究從辣椒中克隆的SCS、NADP-ICDH、TPI等與能量代謝相關的酶基因,均表明其與不育系的形成有關[17-19]。本研究采用同源克隆的方法,從辣椒不育系與保持系中克隆到CaG6PDH基因cDNA完全編碼序列,并對CaG6PDH在辣椒保持系不同組織以及在不育系與保持系花蕾發(fā)育的4個時期進行表達,可以為進一步研究辣椒雄性不育的形成與能量代謝之間的關系提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

辣椒不育系9704A及其保持系9704B種植于云南農業(yè)大學園林園藝學院實驗基地,取保持系莖、葉、花、果實、胎座、種子6個不同組織作為組織表達材料;取不育系與保持系小孢子形成初期、小孢子細胞分裂期、小孢子單核期、小孢子成熟期4個不同時期花蕾作為研究兩系表達譜差異的材料。所有材料取樣后立即凍于液氮,置于-80 ℃超低溫冰箱長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 本實驗采用TaKaRa公司RNAiso Plus試劑盒,進行各個組織與花蕾不同時期的RNA提取,提取完畢后用紫外分光光度計和1.5%瓊脂糖凝膠電泳雙重檢測RNA濃度及純度,檢測合格后使用TaKaRa公司的反轉錄試劑盒進行cDNA合成。

1.2.2CaG6PDH的克隆 以GenBank中與茄科作物G6PDH基因高度同源的編碼序列為參照,利用Primer Premier 5.0設計引物F1(TTGAAGGGATCATACTTG)和R1(AGAGGGATAATAGGACGT),引物序列由北京梓熙生物科技有限公司合成。以雄性不育系與保持系的cDNA作為模板各自進行RT-PCR擴增,反應體系為:1 μL 25 ng/mL cDNA,10.5 μL ddH2O,12.5 μL 2×EasyTaqPCR SuperMix(購于全式金公司),10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL;反應條件為:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性1 min,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,39個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

1.2.3 生物信息學分析 利用GenScan(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)預測基因的cDNA 序列,利用DNAMAN等軟件對測序結果進行初步編輯、比對、人工校對,并推導出氨基酸序列,氨基酸分子量(Mw)和等電點(pI),利用Compute pI/Mw Tool(http://us.expasy.org /tools /pi_tool.html)來預測,利用SignalP 4.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預測信號肽序列,使用PSort II程序(http://psort.hgc.jp)預測蛋白質的亞細胞定位情況,蛋白質的保守結構域通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)服務器上的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool(CDART)工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進行預測,使用SOPMA程序(http://npsa-pbil.ibcp.fr)預測蛋白質的二級結構,蛋白質的跨膜螺旋結構由TMHMM Server version 2.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預測。利用Clusta lX對氨基酸序列進行同源性比較,并用MEGA4構建多物種系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 實時定量PCR采用TaKaRa公司熒光定量試劑盒,染料為SYBR Green,在Eppendorf熒光定量PCR儀上進行。以辣椒Actin片段為內標,上述材料的cDNA為模板,所用Actin引物為F2(TGCAGGAATCCACGAGACTAC)和R2(TACCACCACTGAGCACAATGTT),根據(jù)CaG6PDH基因的測序結果設計特異性引物F3(CTCTTCCACCATCAGTATATCCC)和R3(ACCTTCAGTTCCAAAGTCCTCTC)。qRT-PCR反應體系如下:20 μL體系,10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ(購于TaKaRa公司),10 μmol·L-1的上下游引物各0.8 μL,2 μL cDNA模板,6.4 μL dH2O;反應程序如下:95 ℃預變性2 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸20 s,循環(huán)40次。每個樣品設3次重復。反應結束,利用2-△△Ct法進行相對表達量分析。

2 結果與分析

2.1 CaG6PDH基因的分離

分別以辣椒雄性不育系與保持系cDNA為模板,采用特異性引物進行CaG6PDH基因PCR擴增。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴增結果送北京梓熙生物科技有限公司測序,結果表明目的片段為1 533 bp的完全編碼序列,與預期結果相符(圖1)。

2.2 辣椒CaG6PDH基因的生物信息學分析

RT-PCR產物測序結果表明,編碼區(qū)全長1 533 bp,編碼510個氨基酸(圖2)。生物信息學分析表明CaG6PDH蛋白質等電點為6.27,分子量為58 541.87 ku,無信號肽,亞細胞定位顯示該蛋白位于細胞質的概率是76.7%。通過Blast(protein)預測辣椒CaG6PDH蛋白的保守結構域,CaG6PDH屬于G6PD_N與G6PD_C超家族。通過SOPMA 程序預測CaG6PDH蛋白的二級結構中含212 aa的α-螺旋(41.57%),73 aa的延伸鏈結構(14.31%),34 aa的β-轉角(6.67%),191 aa的無規(guī)則卷曲(37.45%)。

2.3 CaG6PDH氨基酸序列比對及其分子進化關系

對雄性不育系與保持系PCR產物的測序結果進行比對,雄性不育系與保持系中CaG6PDH的氨基酸序列無差異。通過Blast(protein)比對可知,辣椒CaG6PDH氨基酸序列與多種作物G6PDH氨基酸序列具有相似性,分別與馬鈴薯相似性達96%,番茄96%,本氏煙95%,煙草95%等(圖3)。利用辣椒CaG6PDH與以上7種作物的氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹,表明辣椒的CaG6PDH氨基酸序列與馬鈴薯、番茄的親緣關系較近(圖4)。

2.4 CaG6PDH基因的組織表達分析

實時熒光定量結果表明,保持系6個組織中CaG6PDH基因均有表達,但在不同組織中表達量的差異較為明顯,其中在胎座中的表達量最高,在莖中的表達量最低,兩者表達量相差達1 548倍。莖、葉、花中的表達量相差很小,葉、花與莖的表達量相比,分別是其2.3倍和1.3倍;莖、葉、花與果皮、胎座、種子的表達量差異較大,此結果可能是由于不同組織處于不同發(fā)育時期,CaG6PDH基因表達量也存在一定的差異(圖5)。

圖1 辣椒CaG6PDH基因擴增結果

圖2 CaG6PDH基因編碼區(qū)序列及對應的氨基酸序列

2.5 CaG6PDH基因在不育系與保持系花期的表達分析

實時熒光定量PCR結果表明,雄性不育系與保持系中CaG6PDH基因的表達量在小孢子形成初期基本一致。在小孢子細胞分裂期至小孢子成熟期,G6PDH在雄性不育系中的表達都遠遠高于保持系。G6PDH在雄性不育系中的表達呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在小孢子單核期達到最大值;而在保持系中的表達則一直呈現(xiàn)下降趨勢,到小孢子成熟期達到最低點。此結果表明CaG6PDH基因在雄

性不育系與保持系中的表達存在差異,其在雄性不育系中的表達較高可能與雄性不育的形成密切相關(圖6)。

3 討 論

Graeve等[11]在1994年首次從馬鈴薯胞質中克隆出了G6PDH基因,隨后許多研究者在小麥、煙草、馬鈴薯、菠菜、水稻、苜蓿、甜楊等作物中均克隆出了G6PDH基因[12-16,20-21]。研究表明G6PDH基因的表達與植物的抗逆性、植物的生長發(fā)育有密切關系。例如,水稻的G6PDH基因與穗的發(fā)育相關,能夠調控其生長發(fā)育[22];甜楊中的G6PDH基因與其抗凍性具有密切關系[21]。目前在辣椒中CaG6PDH基因功能的研究相對較少,本研究從辣椒雄性不育系與保持系中克隆出CaG6PDH基因,旨在研究CaG6PDH基因對辣椒雄性不育形成的作用。

圖3 辣椒與其他物種G6PDH基因推導的氨基酸比對

圖4 辣椒與其他物種G6PDH基因推導氨基酸序列進化樹分析標尺代表遺傳距離;數(shù)值代表從1 000次重復計算得到的Bootstrap百分比值;括號內為氨基酸登錄號

圖5 CaG6PDH基因在9704B不同組織中的表達圖中數(shù)據(jù)為3次重復的平均值±SD;*.表示P<0.05為顯著;**.表示P<0.01為極顯著;圖6同

同一植物不同器官呼吸速率有很大的差異,一般生長旺盛、幼嫩的器官的呼吸速率比生長緩慢、年老的快,生殖器官的呼吸作用比營養(yǎng)器官強。本研究發(fā)現(xiàn),辣椒CaG6PDH基因在辣椒植株不同組織中的表達水平不一致,其中果皮、胎座和種子中的表達水平要遠遠高于莖和葉,這可能與取材時營養(yǎng)器官(莖和葉)是已經(jīng)成熟的,而生殖器官(果實)是正在發(fā)育的有關,其果皮、胎座和種子的呼吸作用要遠遠強于莖和葉,而G6PDH基因編碼呼吸作用過程中一個十分重要的酶,因此其在果實(果皮、胎座和種子)中表達水平要遠高于莖和葉。

圖6 CaG6PDH基因在9704A與9704B花蕾不同發(fā)育時期的表達1.小孢子形成初期;2.小孢子細胞分裂期;3.小孢子單核期;4.小孢子成熟期

植物花粉的發(fā)育過程中需要充足的能量補給,如果在花粉的發(fā)育過程中能量的供給出現(xiàn)問題,會導致花粉發(fā)育不良,從而導致敗育。大量研究表明植物雄性不育系的線粒體基因發(fā)生了重組。線粒體是植物能量供應的主要器官,線粒體基因的重組會使呼吸作用的某些途徑受到影響,干擾呼吸途徑某些基因的正常表達,從而造成能量供應的異常,影響小孢子的發(fā)育。本研究結果表明,CaG6PDH在雄性不育系與保持系花的小孢子形成初期表達量沒有明顯差異,但從小孢子細胞分裂期開始到小孢子成熟期,雄性不育系的表達量均明顯高于保持系。我們推測,在小孢子發(fā)育時期雄性不育系中由于線粒體基因的重組導致能量代謝發(fā)生紊亂,破壞了能量代謝的平衡,使得CaG6PDH在雄性不育系中的表達出現(xiàn)異常。由于小孢子發(fā)育環(huán)境十分敏感,能量供應的異常可能干擾小孢子的正常發(fā)育而導致敗育。

本研究首次從辣椒雄性不育系與保持系中分離出了CaG6PDH基因,并對其編碼區(qū)進行克隆,序列分析和功能預測,并研究了其在不同組織(保持系)以及不同發(fā)育階段花蕾(雄性不育系與保持系)表達譜,此研究可為深入研究辣椒雄性不育與能量代謝之間的關系提供參考。

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(編輯:宋亞珍)

Clone and Expression Analyses ofCaG6PDHGene from Pepper Cytoplasmic Male Sterility Line

Lü Junheng1,WEN Jinfen2,MO Yunrong1,ZHAO Kai1,MA Zhongfei3,DENG Minghua1*

(1 College of Landscape and Horticulture,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2 Faculty of Modern Agricultural Engineering,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China;3 Horticultural Technology Extension Station of Zhaoyang District,Zhaotong,Yunnan 657000,China)

In order to study the relationship between of pepper cytoplasmic male sterility and energy metabolism,we cloned pepper glucose-6-phosphate dehydrogenase gene (CaG6PDH) based on theG6PDHhomologous sequences of the related species tomato by the electronic cloning in this research.Real-time quantitative-PCR was used to analyze the gene expression levels in the different stages of flower development in the cytoplasmic male sterility line (9704A) and its maintainer line (9704B),and different tissues(stem,leaf,flower,pericarp,placenta and seed) in the 9704B.The results showed that there was no difference of cDNA sequences between theCaG6PDHin the 9704A and the 9704B.Sequence prediction showed that the 1 533 bp cDNA sequences represent 1 single gene,which encodes 510 amino acids.CaG6PDHgene has a different expression in the different tissues in the 9704B,the highest in the placenta and the lowest in the stem.CaG6PDHgene expression in 9704A was higher than that in 9704B during the different stages of flower development,especially in the uninucleate microspore stage and mature pollen stage.The abnormal expression level ofCaG6PDHin the 9704A disturbed the balance of energy metabolism and interfered the development of microspore,then resulted male sterility in the pepper.

CapsicumannuumL.;glucose-6-phosphate dehydrogenase;cytoplasmic male sterility;gene cloning;Real-time quantitative-PCR

1000-4025(2015)04-0682-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0682

2014-10-10;修改稿收到日期:2015-01-30

云南省應用基礎研究項目(2013FB038)

呂俊恒(1989-),男,在讀碩士研究生,主要從事蔬菜分子生物學方面的研究。E-mail:417911509@qq.com

*通信作者:鄧明華,博士,副教授,主要從事蔬菜分子生物學方面的研究。E-mail:dengminghua2013@163.com

Q785;Q789

A