苦蕎鋅指蛋白基因FtLSD1的克隆及其對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答

高 飛,姚攀鋒,雒曉鵬,李成磊,吳 琦,姚慧鵬

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院,四川雅安 625014)

苦蕎鋅指蛋白基因FtLSD1的克隆及其對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答

高 飛,姚攀鋒,雒曉鵬,李成磊,吳 琦,姚慧鵬*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院,四川雅安 625014)

根據(jù)苦蕎(Fagopyrumtataricum)花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分別以苦蕎DNA和cDNA為模板,克隆得到1個(gè)苦蕎C2C2型鋅指蛋白基因FtLSD1(GenBank登錄號(hào)KP252134)的DNA序列和cDNA序列,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,研究了FtLSD1基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果顯示:苦蕎FtLSD1基因DNA全長(zhǎng)2 427 bp,由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成,符合GU-AG剪切原則;cDNA序列包含一個(gè)528 bp開放閱讀框,編碼175個(gè)氨基酸,具有LSD1家族的典型結(jié)構(gòu)域;UV-B照射和水楊酸處理均能使FtLSD1基因的表達(dá)量上升,且UV-B處理在6 h達(dá)到最大,為0 h(CK)的3.84倍;水楊酸處理于10 h達(dá)到最大,為0 h(CK)的3.44倍,而4 ℃冷脅迫下該基因表達(dá)量保持穩(wěn)定。推測(cè)該基因可能參與苦蕎抗UV-B和高濃度水楊酸等非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng),為苦蕎的抗逆性研究提供新的視角。

苦蕎;鋅指蛋白LSD1;基因克隆;非生物脅迫

類LSD1基因編碼一類特殊的C2C2型鋅指蛋白,含有3個(gè)特殊的鋅指結(jié)構(gòu)域:CxxCxRxxLMYxxGAxSVxCxxC,又稱為zf-LSD1結(jié)構(gòu)域[1]。該基因家族克隆的首個(gè)基因是擬南芥AtLSD1,隨后在水稻、小麥、玉米等植物中發(fā)現(xiàn)并克隆出更多含有zf-LSD1結(jié)構(gòu)域的基因[2-3]。功能研究表明,這類LSD1型鋅指蛋白在細(xì)胞過(guò)敏性死亡、植物廣譜抗病性以及植物對(duì)低溫、長(zhǎng)日照等非生物環(huán)境脅迫具有調(diào)控功能[4]。Danie等[5]研究表明,擬南芥AtLSD1基因功能是通過(guò)應(yīng)答水楊酸(salicylic acid,SA)信號(hào)分子,上調(diào)銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)來(lái)清除由病原菌或者其它非生物脅迫造成的過(guò)量積累的活性氧(reactive oxygen species,ROS),減輕氧迸發(fā)引起的二次傷害。

苦蕎(Fagopyrumtataricum)又稱韃靼蕎麥,屬蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬一年生草本植物。主要分布在中國(guó)西南高寒山地[6]。苦蕎含有豐富的生物類黃酮,對(duì)人類多種疾病具有預(yù)防治療作用,被譽(yù)為新型的綠色保健食品,備受青睞[7-8]?？嗍w抗逆能力強(qiáng),能適應(yīng)高寒、高海拔、強(qiáng)紫外及干旱等惡劣環(huán)境。目前,關(guān)于苦蕎抗逆及抗氧化的研究主要集中于黃酮類化合物和SOD酶類對(duì)ROS的清除方面。Suzuki等[9]證明苦蕎在受到紫外線、冷和干旱脅迫時(shí)葉片中的蘆丁含量以及蘆丁葡萄糖苷酶活性顯著上升,以此來(lái)清除脅迫條件下產(chǎn)生的過(guò)量ROS。董新純等[10]研究發(fā)現(xiàn),苦蕎經(jīng)UV-B處理后,其SOD總活性提高,說(shuō)明苦蕎在受到脅迫時(shí),通過(guò)提高抗氧化酶活性清除ROS以保護(hù)細(xì)胞,而其中的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)獲得的苦蕎花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),采用RT-PCR技術(shù)克隆苦蕎抗逆相關(guān)的鋅指蛋白FtLSD1基因序列,并采用UV-B、2 mmol/L水楊酸和4 ℃冷脅迫處理二葉期苦蕎,探究FtLSD1基因的表達(dá)與外界非生物脅迫的相關(guān)性,為從分子水平探究苦蕎抗逆和抗氧化的機(jī)制提供參考,也為苦蕎的抗逆性研究提供新的視角。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

苦蕎(‘西蕎二號(hào)’)種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱,培養(yǎng)條件為光照16 h,黑暗8 h,溫度(22±2) ℃,相對(duì)濕度60%,培養(yǎng)至二葉期供試備用。

UV-B處理:使用10 W UV-B(308 nm)LED燈照射二葉期苦蕎,光照距離30 cm。水楊酸處理:使用2 mmol/L濃度水楊酸,葉面噴施二葉期苦蕎,以葉面滴水為度,以上處理均于處理前0 h、處理后2、4、6、8、10和12 h分別取供試樣品葉片,液氮冷凍后置于-80 ℃?zhèn)溆谩? ℃冷處理:將二葉期苦蕎轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)條件為光照16 h,黑暗8 h,溫度4 ℃,相對(duì)濕度60%的光照培養(yǎng)箱,于處理前0 h、處理后12、24、36、48、60和72 h取供試樣品葉片,液氮冷凍后置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1FtLSD1 DNA序列和cDNA序列的克隆 采用改良SDS法[11]提取苦蕎葉片總DNA,采用植物RNAout試劑盒提取各處理樣品的總RNA,并以其為模板使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒反轉(zhuǎn)錄制備cDNA第一條鏈。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室獲得的苦蕎花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物FtLSD1f(5′-TTCTACCATTTTACGCCTCCCTCC-3′)和FtLSD1r(5′-CGACCGGTACGCTGTTGAGTATAAC-3′),分別以苦蕎總DNA和cDNA第一條鏈為模板,PCR擴(kuò)增FtLSD1 DNA序列和cDNA序列,PCR產(chǎn)物回收純化后連接至pMD19-T 載體,陽(yáng)性克隆送上海英駿生物公司測(cè)序。

1.2.2 序列分析 使用NCBI在線工具Blast進(jìn)行FtLSD1核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列同源性分析;使用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì);利用MEGA 5.0將對(duì)比結(jié)果采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 苦蕎FtLSD1基因表達(dá) 設(shè)計(jì)1對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR特異引物FtLSD1 Qf (5′-TGTATCCCTT-TGGAGCACCATCAG-3′)和FtLSD1 Qr(5′-GCCAACCACAACATTGCTGACC-3′),以苦蕎組蛋白H3基因[12]為內(nèi)參基因,引物為H3Qf(GAAATTCGCAAGTACCAGAAGAG)和H3Qr(CCAACAAGGTATGCCTCAGC),采用Takara公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix ExTaqTMⅡ(Perfect Real Time),在BIO-RAD公司的CFX96 Real-Time System進(jìn)行熒光定量,數(shù)據(jù)采用2-△△CT方法[13]分析,采用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)水楊酸、UV-B和冷脅迫下苦蕎FtLSD1基因的表達(dá)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎FtLSD1基因DNA序列和cDNA序列的克隆

采用特異引物FtLSD1f和FtLSD1r,以苦蕎DNA為模板,PCR擴(kuò)增得到4 000 bp左右條帶,測(cè)序結(jié)果表明該片段長(zhǎng)4 080 bp(圖1,A)。用該特異引物,以苦蕎cDNA為模板,PCR擴(kuò)增得到900 bp左右條帶(圖1,B),測(cè)序結(jié)果表明該片段長(zhǎng)877 bp。

2.2 核苷酸序列分析

通過(guò)Blast 比對(duì)苦蕎FtLSD1 DNA和cDNA序列,確定其全長(zhǎng)DNA序列為2 427 bp,由6個(gè)外顯子,5個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成(圖2),符合標(biāo)準(zhǔn)的GU-AG剪切原則。此外,位于ATG上游5 ′-UTR的-2 bp和-1 194 bp之間,存在1個(gè)長(zhǎng)度為1 391 bp插入片段,同時(shí)符合GU-AG剪切原則,屬于特殊的內(nèi)含子結(jié)構(gòu),是比較少見的基因類型[14]。Prediction在線軟件分析結(jié)果表明,在距離起始密碼子-1 140 bp至-1 190 bp存在1個(gè)可能的啟動(dòng)子基礎(chǔ)序列?？嗍wFtLSD1 cDNA序列包含一個(gè)528 bp開放閱讀框(ORF)。Blast序列比對(duì)顯示,該cDNA序列與豌豆(Pisumsativum)、可可(Theobromacacao)和毛果楊(Populustrichocarpa)的相似性分別為69%、69%和65%。表明克隆得到的序列屬于類LSD1基因家族。

2.3 氨基酸序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

DNAman分析表明,FtLSD1基因編碼175個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)(pI)為8.37,相對(duì)分子質(zhì)量為18.38 KDa,無(wú)信號(hào)肽。SOPMA預(yù)測(cè)表明,該序列由13.14% α-螺旋、24.57%延伸鏈、6.86% β-轉(zhuǎn)角和55.43%無(wú)規(guī)則卷曲組成。NCBI Blast結(jié)果表明,苦蕎FtLSD1與擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtLSD1、可可(Theobromacacao)TcLSD1和豌豆(Pisumsativum)PsLSD1相似性分別為59%、66%

圖1 苦蕎FtLSD1 DNA(A)和cDNA(B)擴(kuò)增

圖2 FtLSD1基因結(jié)構(gòu)示意圖ATG表示起始密碼子;TAA表示終止密碼子

和64%。將FtLSD1氨基酸序列與其它物種LSD1氨基酸序列進(jìn)行對(duì)序列比對(duì)結(jié)果(圖3)表明,苦蕎FtLSD1與擬南芥等植物的LSD1都具有3個(gè)共同的保守肽基序,結(jié)構(gòu)為CxxCxRxxLMYxxGAxSVxCxxC,是鋅指蛋白的典型的保守序列,而其它區(qū)域相似性較低。

采用MEGA 5.0軟件將LSD1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),并采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖4),發(fā)現(xiàn)苦蕎FtLSD1與擬南芥AtLSD1、甘藍(lán)BoLSD1、BoLSD2等共分布于進(jìn)化樹簇Ⅰ,而擬南芥AtLOL1、水稻OsLSD1和玉米ZmLOL1等分布于進(jìn)化樹簇Ⅱ。

2.4 苦蕎FtLSD1表達(dá)分析

使用熒光定量PCR分析FtLSD1在UV-B、水楊酸和4 ℃冷處理下各個(gè)時(shí)間段的轉(zhuǎn)錄水平。以苦蕎組蛋白H3為內(nèi)參基因,0 h為對(duì)照組,使用2-△△CT法計(jì)算FtLSD1基因表達(dá)量變化的倍數(shù)關(guān)系。UV-B處理結(jié)果(圖5)表明,FtLSD1基因表達(dá)從UV-B處理2 h開始上升,到6 h達(dá)到最大,為對(duì)照(0 h)的3.84倍,6 h后有所下降,但仍然維持較高表達(dá)量。水楊酸處理結(jié)果(圖5)表明,FtLSD1基因的表達(dá)量從水楊酸處理的2 h開始上升,4 h有所下降,但在0～10 h表達(dá)量保持穩(wěn)定上升趨勢(shì),到10 h達(dá)到最大值,為對(duì)照(0 h)的3.44倍;12 h后表達(dá)量突然下降,僅為對(duì)照(0 h)的1.85倍。

圖3 不同植物L(fēng)SD1氨基酸序列比對(duì)圖中從上至下依次代表的是苦蕎、甘藍(lán)、擬南芥、玉米、水稻、竹子、擬南芥中相應(yīng)的LSD1氨基酸序列;劃線部分為zf-LSD1鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域

圖4 苦蕎LSD1與其他植物L(fēng)SD1氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 UV-B和SA處理?xiàng)l件下FtLSD1表達(dá)量

圖6 4 ℃冷處理?xiàng)l件下FtLSD1表達(dá)量

4 ℃冷處理結(jié)果(圖6)表明,FtLSD1基因的表達(dá)量整體趨勢(shì)保持穩(wěn)定,12 h開始上升,48 h達(dá)到最大值,為對(duì)照(0 h)的1.35倍。60 h下降回到冷處理前的水平,然后維持穩(wěn)定。

3 討 論

高通量測(cè)序技術(shù)作為新一代的測(cè)序技術(shù),目前廣泛應(yīng)用于基因組和轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序,Lai等[15]根據(jù)獲得的紅薯(Ipomoeabatatas)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆得到紅薯尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶,目前根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆獲得基因序列已經(jīng)成為一種快速高效的克隆方法,與RACE等其它技術(shù)相比,具有簡(jiǎn)便、高效、節(jié)省經(jīng)費(fèi)等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)獲得的苦蕎花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),首次在苦蕎中克隆得到1條鋅指蛋白基因FtLSD1,獲得該基因的DNA和cDNA序列,為從分子水平研究苦蕎抗逆性提供一條靶基因。

Liu等[16]對(duì)植物L(fēng)SD1型鋅指蛋白家族進(jìn)行了分類,含有3個(gè)zf-LSD1蛋白、2個(gè)zf-LSDl蛋白以及1個(gè)zf-LSDl蛋白,同時(shí)發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控細(xì)胞死亡、植物抗病性以及植物對(duì)非生物脅迫抗逆性功能的鋅指蛋白多屬于3個(gè)zf-LSD1蛋白的亞家族。通過(guò)氨基酸序列比對(duì),可知FtLSD1具有3個(gè)典型的C2C2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域zf-LSDl,且與十字花科植物擬南芥AtLSD1和甘藍(lán)BoLSD1高度同源,而與禾本科植物玉米ZmLOL1、水稻OsLSD1和竹子BohLOL1相比,僅在鋅指蛋白保守結(jié)構(gòu)域zf-LSD1(CxxCxRxxLMYxxGAxSVxCxxC)處保守,而在3個(gè)zf-LSD1間隔區(qū)域保守性較低,這種結(jié)構(gòu)為該類蛋白調(diào)控功能的多樣化提供了分子依據(jù)。另外,FtLSD1氨基酸序列第一個(gè)zf-LSD1結(jié)構(gòu)域的第10個(gè)氨基酸Met被同為疏水氨基酸的Leu取代,但不影響其鋅指結(jié)構(gòu)域的形成[17],相關(guān)功能是否存在不同有待進(jìn)一步研究。由進(jìn)化樹可知,同一物種的擬南芥AtLSD1和AtLOL1分屬不同的簇,而研究表明AtLSD1和AtLOL1具有相反的功能,AtLSD1參與負(fù)調(diào)控ROS介導(dǎo)的信號(hào)通路,而AtLOL1參與正調(diào)控,推測(cè)苦蕎FtLSD1與AtLSD1具有相似的功能,參與負(fù)調(diào)控ROS介導(dǎo)的信號(hào)通路,限制植物對(duì)外界的應(yīng)激,防止細(xì)胞死亡的擴(kuò)散[18]。

據(jù)報(bào)道,SA處理、UV-B處理和冷刺激等非生物脅迫均能打破植物體內(nèi)氧代謝平衡,造成ROS的過(guò)量積累,引起細(xì)胞的死亡。Kliebenstein等[19]研究表明,擬南芥AtLSD1通過(guò)上調(diào)銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)來(lái)清除ROS,防止細(xì)胞死亡的擴(kuò)散。本研究發(fā)現(xiàn),苦蕎FtLSD1基因在水楊酸和UV-B處理?xiàng)l件下表達(dá)上調(diào),說(shuō)明FtLSD1可能參與了苦蕎的抗UV-B和水楊酸的防衛(wèi)反應(yīng),其中UV-B處理?xiàng)l件下FtLSD1表達(dá)上調(diào)較水楊酸處理迅速,說(shuō)明該基因?qū)Σ煌耐饨绱碳ぞ哂胁煌捻憫?yīng)速度。而4 ℃冷處理?xiàng)l件下,FtLSD1基因表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定。Huang等[20]研究表明,4 ℃冷處理?xiàng)l件下擬南芥AtLSD1表達(dá)量在72 h內(nèi)表達(dá)量維持穩(wěn)定,而在72 h后開始積累,暗示在冷脅迫的初期階段,植物可能存在其它的途徑來(lái)抵抗冷刺激。

苦蕎主要分布在中國(guó)西南山區(qū),該地區(qū)干旱、晝夜溫差大、紫外線強(qiáng),而苦蕎具有良好的適應(yīng)性,表現(xiàn)出良好的抗逆性能。已有的研究主要集中在苦蕎如何通過(guò)提高黃酮類物質(zhì)合成來(lái)參與抗逆過(guò)程,而本實(shí)驗(yàn)則首次對(duì)苦蕎抗逆相關(guān)的鋅指蛋白基因FtLSD1進(jìn)行研究,分析其在UV-B、水楊酸和冷處理等非生物學(xué)脅迫下的響應(yīng),為研究苦蕎的抗逆機(jī)制提供新的思路。

[1] DIETRICH R A,RICHBERG M H,SCHMIDT R,etal.A novel zinc finger protein is encoded by theArabidopsisLSD1 gene and functions as a negative regulator of plant cell death[J].Cell,1997,88(5):685-694.

[2] WANG L J(王麗娟),TIAN Y CH(田穎川),HE CH Z(何朝族).Cloning of a novel rice geneOsLSD1 and bioinformatic analysis ofLSD1-like gene family fromArabidopsisand rice[J].ProgressinBiochemistryandBiophysics(生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展),2005,32(3):268-274(in Cihinese).

[3] HUANG X J(黃新杰),GUO J(郭 軍),QU ZH P(屈志鵬),etal.In silico cloning and sequence analysis of aTaLSD1 zinc finger protein gene from wheat infected by stripe rust fungus[J].ActaBot.Boreal.-Occident.Sin.(西北植物學(xué)報(bào)),2007,27(11):2 147-2 152(in Cihinese).

[4] SHENG H Y,CHOUN S L,FU H W,etal.Analysis of the expression ofBohLOL1,which encodes an LSD1-like zinc finger protein inBambusaoldhamii[J].Planta,2011,234:1 179-1 189.

[5] DANIE H A,CHRISTINE R A,BEN F H,etal.Runaway cell death,but not basal disease resistance,in lsd1 is SA- andNIM1/NPR1-dependent[J].ThePlantJournal,2002,29(3):381-391.

[6] KITABAYASHI H,UJIHARA A,HIROSE T,etal.On the genotypic differences for rutin content in tatary buckwheat,FagopyrumtataricumGaertn[J].BreedingScience,1995,45(2):189-194.

[7] CALABRO M L,TOMMASINI S,DONATO P,etal.The rutin/beta-cyclodextrin interactions in fully aqueous solution:Spectroscopic studies and biological assays[J].JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,2005,36(5):1 019-1 027.

[8] ZWIRTES O I R,FERNANDES S C,VIEIRA I C.Development of a biosensor based on gilo peroxidase immobilized on chitosan chemically crosslinked with epichlorohydrin for determination of rutin[J].JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,2006,41(2):366-372.

[9] SUZUKI T,HONDA Y,MUKASA Y J.Effects of UV-B radiation,cold and desiccation stress on rutin concentration and rutin glucosidase activity in tartary buckwheat (Fagopyrumtataricum) leaves[J].PlantScience,2005,168:1 303-1 307.

[10] DONG X CH(董新純),ZHAO SH J(趙世杰),GUO SH SH(郭珊珊),etal.Role of flavonoids on stress injury and antioxydative enzymes inFagopyrumtataricunseedings under enhanced UV-B radiation[J].JournalofShandongAgriculturalUniversity(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)),2006,37(2):157-162(in Cihinese).

[11] LI CH L(李成磊),FENG ZH Y(馮爭(zhēng)艷),BAI Y CH(白悅辰),etal.Molecular cloning and prokaryotic expression of phenylalanine ammonialyase geneFdPALfromFagopyrumdibotrys[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica(中國(guó)中藥雜志),2011,36(23):3 238-3 243(in Cihinese).

[12] BAI Y C,LI C L,ZHANG J W,etal.Characterization of two tartary buckwheat R2R3-MYB transcription factors and their regulation of proanthocyandin biosynthesis[J].PhysiologiaPlantarum,2014,152(3):431-440.

[13] THOMAS D S,KENNETH J L.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J].NatureProtocols,2008,3(6):1 101-1 108.

[14] WEI ZH G(衛(wèi)正國(guó)),CHEN Y H(陳玉華),LI B(李 兵),etal.Cloning and structure analysis of cytochrome P450 gene CYP305B1 fromBombyxmori[J].ScienceofSericulture(蠶業(yè)科學(xué)),2009,35(1):144-147(in Cihinese).

[15] LAI X J,GU Y H,TAO X,etal.Cloning and characterization of uridine diphosphate glucose dehydrogenase gene fromIpomoeabatatas[J].RussianJournalofPlantPhysiology,2014,61(3):298-308.

[16] LIU Q P,XUE Q Z.Molecular phylogeny,evolution,and functional divergence of theLSD1-like gene family:inference from the rice genome[J].JournalofMolecularEvolution,2007,64(3):354-363.

[17] BROWN R S.Zinc finger proteins:getting a grip on RNA[J].CurrentOpinioninStructuralBiology,2005,15(1):94-98.

[18] KAMINAKA H,NAKC C,EPPLE P,etal.bZIP10-LSD1 antagonism modulates basal defense and cell death inArabidopsisfollowing infection[J].EMBOJournal,2006,25(18):4 400-4 411.

[19] DJ KLIEBENSTEIN,RA DIETRICH,AC MARTIN,etal.LSD1 regulates salicylic acid induction of copper zinc superoxide dismutase inArabidopsisthaliana[J].MolecularPlant-microbeInteractions,1999,12(11):1 022-1 026.

[20] HUANG X Z,LI Y S,ZHANG X Y,etal.TheArabidopsisLSD1 gene plays an important role in the regulation of low temperature-dependent cell death[J].NewPhytologist,2010,187(2):301-312.

(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis of Zinc Finger Protein GeneFtLSD1 inFagopyrumtataricumunder Abiotic Stress

GAO Fei,YAO Panfeng,LUO Xiaopeng,LI Chenglei,WU Qi,YAO Huipeng*

(College of Life Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an,Sichuan 625014,China)

According to transcriptome data ofFagopyrumtataricumat flowering,using PCR and RT-PCR techniques,the DNA and full-length cDNA sequences ofFtLSD1 gene (GenBank accession number:KP252134) were amplified fromF.tataricum.The obtained sequences were analyzed by bioinformatics software,and the expressionFtLSD1 gene were analysed by qPCR under UV-B,SA and 4 ℃ cold stress.The results showed that the DNA sequence ofFtLSD1 gene was 2 427 bp,of which consisted 6 exons and 5 introns,in line with the principle of GU-AG splicing,and the cDNA ofFtLSD1 contained a 528 bp ORF.The UV-B radiation and 2 mmol/L salicylic acid could lead to a significant increase in the expression of theFtLSD1 gene,while 4 ℃ cold stress remained stable expression levels of the gene.The results expected to lay a foundation for study the stress resistance inF.tataricum.

Fagopyrumtataricum;zinc finger protein LSD1;gene cloning;abiotic stress

1000-4025(2015)04-0669-05

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0669

2014-12-12;修改稿收到日期:2015-02-09

四川省教育廳青年基金(13ZB0294)

高 飛(1991-),男,在讀碩士研究生,主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail:gaofeibiology@aliyun.com

*通信作者:姚慧鵬,博士,副教授,主要從事植物分子生物學(xué)研究。 E-mail:yaohuipeng0921@163.com

Q785;Q789

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