玉米胚胎發(fā)生后期豐富蛋白基因的啟動(dòng)子克隆與功能驗(yàn)證

鄒郁陶,劉 鑫,牟 巍,高學(xué)煥,付鳳玲,李晚忱

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 玉米研究所,成都 611130)

玉米胚胎發(fā)生后期豐富蛋白基因的啟動(dòng)子克隆與功能驗(yàn)證

鄒郁陶,劉 鑫,牟 巍,高學(xué)煥,付鳳玲,李晚忱*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 玉米研究所,成都 611130)

該研究在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,克隆玉米胚胎發(fā)生后期豐富蛋白基因(MGL3)的啟動(dòng)子序列(pMGL3),進(jìn)行非生物逆境應(yīng)答元件分析以及實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證其非生物逆境脅迫響應(yīng)特性,構(gòu)建了pMGL3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因(GUS)表達(dá)載體,基因槍法轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織,通過(guò)GUS染色驗(yàn)證pMGL3啟動(dòng)子在非生物逆境脅迫下的驅(qū)動(dòng)活性。再根據(jù)啟動(dòng)子序列分析結(jié)果,去除不同的順式作用元件,構(gòu)建不同長(zhǎng)度pMGL3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS表達(dá)載體,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草葉盤,以確定pMGL3啟動(dòng)子的最短活性序列。結(jié)果顯示:pMGL3啟動(dòng)子長(zhǎng)1 554 bp,存在多種與非生物逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)的調(diào)控元件,在干旱、高鹽、低溫脅迫及脫落酸、乙烯誘導(dǎo)下驅(qū)動(dòng)MGL3基因增量表達(dá),用以驅(qū)動(dòng)GUS基因轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織,在高滲、高鹽、低溫脅迫及脫落酸誘導(dǎo)下具有驅(qū)動(dòng)活性,且截短至325 bp仍可保持驅(qū)動(dòng)活性。研究表明,pMGL3啟動(dòng)子的確有非生物逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)活性,進(jìn)一步驗(yàn)證其作用機(jī)理后可運(yùn)用于玉米抗逆轉(zhuǎn)基因研究。

非生物脅迫;胚胎發(fā)生后期豐富蛋白;玉米;啟動(dòng)子

近年來(lái),人類活動(dòng)和氣候變化等引起的非生物脅迫愈加嚴(yán)重,已成為中國(guó)及世界許多地區(qū)作物生產(chǎn)的主要限制因素[1]。耐旱、耐鹽堿等對(duì)非生物逆境的抗性一直是常規(guī)玉米育種的重要目標(biāo)性狀。雖然不同玉米種質(zhì)對(duì)非生物逆境的抗性存在明顯差異,但其遺傳性質(zhì)較為復(fù)雜,多年來(lái)遺傳改良的進(jìn)展不大,難以滿足玉米生產(chǎn)對(duì)品種抗逆性的要求[2-4]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可轉(zhuǎn)化利用外源抗性基因,是改良玉米非生物逆境抗性的有效途徑[5-9]。然而,在以往的轉(zhuǎn)基因研究中,多采用ubiquitin、CaMV35S等組成型強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)。雖然抗逆性得以改良提高,但外源抗逆基因的持續(xù)表達(dá),過(guò)量消耗植物營(yíng)養(yǎng)和能源,又會(huì)阻礙植物的正常生理代謝,致使非脅迫條件下的生長(zhǎng)發(fā)育受到制約,限制了產(chǎn)量潛力的進(jìn)一步發(fā)揮[10-13]。轉(zhuǎn)而改用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,只在逆境脅迫時(shí)才驅(qū)動(dòng)外源抗性基因表達(dá),渡過(guò)逆境后又恢復(fù)正常,就可降低外源基因過(guò)量表達(dá)造成的適應(yīng)性代價(jià)[14]。而且還有研究表明,用內(nèi)源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的驅(qū)效率往往比外源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子要高[15-17]。

因此,要很好地發(fā)揮外源基因在非生物逆境抗性轉(zhuǎn)基因玉米種質(zhì)培育中的作用,除對(duì)外源基因本身的功能選擇外,還應(yīng)注重選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,既可在逆境脅迫條件下適當(dāng)驅(qū)動(dòng)外源抗逆基因的表達(dá),提高玉米對(duì)非生物逆境的抗性,又可在非脅迫條件下降低外源基因過(guò)量表達(dá)造成的適應(yīng)性代價(jià)。因?yàn)橛衩坠δ芑蚪M研究比擬南芥和水稻等模式植物滯后,除發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)生后期豐富蛋白基因rab17和轉(zhuǎn)錄因子基因Vp1(Viviparous1)的啟動(dòng)子響應(yīng)脫落酸誘導(dǎo)[18-19],磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因ZmPEAMT的啟動(dòng)子區(qū)域存在高鹽、高溫應(yīng)答元件[20],抗病基因ZmRXO1的啟動(dòng)子區(qū)域存在茉莉酸、赤霉素和脫落酸應(yīng)答元件,可在非生物逆境脅迫條件下驅(qū)動(dòng)下游基因的表達(dá)而外[21],鮮有關(guān)于玉米內(nèi)源非生物逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)子克隆及功能驗(yàn)證方面的報(bào)道。

胚胎發(fā)生后期豐富蛋白(LEA)可在脫水、高滲和低溫等非生物逆境脅迫下保護(hù)細(xì)胞內(nèi)其他蛋白的活性[22-30]。其中,尤以第3亞家族的LEA蛋白的這種保護(hù)作用最為明顯[27-30]。轉(zhuǎn)化利用LEA蛋白的編碼基因,可以提高植物對(duì)非生物逆境的抗性[8-9]。而且,LEA蛋白編碼基因的啟動(dòng)子對(duì)各種非生物逆境脅迫也有應(yīng)答,可在植物轉(zhuǎn)基因操作中用以驅(qū)動(dòng)其他抗逆基因的逆境誘導(dǎo)表達(dá)[31-32]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上[22,26],先用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證玉米LEA蛋白第3亞家族一個(gè)成員的編碼基因MGL3在非生物逆境脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá),然后對(duì)其上游序列作啟動(dòng)子分析,并克隆其啟動(dòng)子pMGL3,用以構(gòu)建驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS的表達(dá)載體,基因槍法轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織。通過(guò)愈傷組織的GUS熒光值與熒光素酶(LUC)發(fā)光值的比值GUS/LUC,評(píng)價(jià)pMGL3啟動(dòng)子在非生物逆境脅迫及激素誘導(dǎo)條件下的驅(qū)動(dòng)活性,以期為抗逆轉(zhuǎn)基因玉米研究提供更多的選擇。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

為驗(yàn)證pMGL3啟動(dòng)子對(duì)非生物逆境脅迫的響應(yīng),先在各種不同的非生物脅迫及激素誘導(dǎo)條件下,qRT-PCR檢測(cè)MGL3基因的差異表達(dá)。取玉米自交系‘178’種子,10% NaClO消毒后發(fā)芽至二葉期,用改良Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)至四葉期[33],分別用16%聚乙二醇6000(PEG-6000)模擬干旱[34]和高鹽(200 mmol·L-1NaCl)處理72 h,低溫(4 ℃)和高溫(42 ℃)處理24 h,以及100 μmol·L-1脫落酸(ABA)和100 μmol·L-1乙烯利誘導(dǎo)24 h,3次重復(fù)。在模擬干旱、高鹽處理的0、12、24、48、72 h,以及低溫、高溫處理和ABA、乙烯利誘導(dǎo)的0、2、6、12、24 h取樣,用Trizol試劑盒(TaKaRa,大連)提取總RNA,再用PrimeScriptTM試劑盒(TaKaRa,大連)反轉(zhuǎn)錄成cDNA,稀釋5倍后作qRT-PCR模板。

1.2 非生物脅迫處理與qRT-PCR檢測(cè)

根據(jù)玉米LEA蛋白第3亞家族成員MGL3(GenBank登錄號(hào)NP_001105298)對(duì)應(yīng)的mRNA序列(GenBank登錄號(hào)NM_001111828)[22,26],用Primer 6.0軟件(http://www.premierbiosoft.com)設(shè)計(jì)特異PCR引物(5′-GACCCTGTTTGCTTGTTC-3′/5′-ACACTTGATGACGCAGAA-3′),生工生物工程公司(上海)合成。以玉米18S基因作內(nèi)參,10 μL反應(yīng)體系包括:熒光染料SsoFast EvaGreen supermix(Bio-Rad,美國(guó))5.0 μL、上下游引物(10.0 μmol·L-1)各0.5 μL和稀釋后的cDNA模板1.0 μL。在 CFX96定量PCR儀(Bio-Rad,美國(guó))進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性2 s,60.2 ℃退火10 s,循環(huán)44次。然后,以每步0.5 ℃/0.01 s速度升高至95 ℃,繪制熔解曲線。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)MGL3基因的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定,計(jì)算不同脅迫或誘導(dǎo)時(shí)間MGL3基因表達(dá)量相對(duì)于0 h對(duì)照的倍數(shù)。

1.3 啟動(dòng)子序列分析與克隆

以玉米LEA蛋白第3亞家族成員MGL3對(duì)應(yīng)的mRNA序列為探針[22,26],與玉米自交系‘B73’基因組RefGen_v3版本(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)序列比對(duì),定位MGL3基因在基因組中的物理位置。用啟動(dòng)子分析軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/),查找編碼序列上游1 500 bp以內(nèi)的CAAT與TATA框等重要啟動(dòng)子序列特征,預(yù)測(cè)pMGL3啟動(dòng)子序列,并分析其中與非生物脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件。

根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果,用Primer 6.0軟件(http://www.premierbiosoft.com)設(shè)計(jì)特異PCR引物(5′-AAGCTTGAACTCTCGACCTCAGGATAACTC-3′/5′-GGATCCGGCAGCAGGGTCTCTCAAG-3′),并引入載體構(gòu)建所需要的限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ的識(shí)別位點(diǎn)(括號(hào)中下劃線部分)。以玉米自交系‘B73’的基因組DNA為模板,用高保真DNA聚合酶PCR擴(kuò)增pMGL3啟動(dòng)子序列。20 μL反應(yīng)體系包括:PCR緩沖液SxPrimerSTAR(Mg2+)4 μL,dNTP 1.64 μL,上下游引物各0.5 μL,玉米自交系‘B73’基因組DNA 1 μL,DNA聚合酶PrimerSTAR HS 0.2 μL,ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性10 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸90 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離,回收純化1 500 bp左右的目的片段。

1.4 瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建與玉米愈傷組織轉(zhuǎn)化

用限制性內(nèi)切HindⅢ和BamHⅠ分別雙酶切上述回收純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和單子葉植物瞬時(shí)表達(dá)載體pBI221-Ubi-GUS[35],瓊脂糖凝膠電泳分離,回收、純化pMGL3啟動(dòng)子序列和去除組成型啟動(dòng)子Ubi序列的表達(dá)載體片段,用T4DNA連接酶(TaKaRa,大連)連接,構(gòu)建pMGL3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS的瞬時(shí)表達(dá)載體pBI221-pMGL3-GUS(圖1),熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株的感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)氨芐青霉素抗性培養(yǎng)基上篩選后擴(kuò)大培養(yǎng),菌液PCR和HindⅢ和BamHⅠ雙酶檢測(cè)后,送生工生物工程公司(上海)測(cè)序驗(yàn)證。

取濃度為1.0 μg·μL-1瞬時(shí)表達(dá)載體 pBI221-pMGL3-GUS質(zhì)粒DNA 3 μL,并以單子葉植物組成型啟動(dòng)子Ubi驅(qū)動(dòng)熒光素酶基因LUC的表達(dá)載體pUbi-LUC為內(nèi)參,以消除愈傷組織間基因槍轉(zhuǎn)化率的差異。加入20 μL 0.5 mol·L-1亞精胺和50 μL 2.5 mol·L-1CaCl2,沉淀到3 mg直徑60 μm的金粉(金粉·甘油=60 mg·mL-1)上,用乙醇和無(wú)菌蒸餾水反復(fù)洗滌,渦旋震蕩并用色譜級(jí)140 μL 70%乙醇洗滌后,加入60 μL無(wú)水乙醇,渦旋震蕩1 min并用超聲波處理3～5 s使金粉分散懸浮。在DuPont PDS1000/He型基因槍上,以1 100 psi系統(tǒng)壓力和70 cm汞柱真空度,每槍1.0 μg·mg-1(質(zhì)粒/金粉),轉(zhuǎn)化在N6高滲培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)4 h的玉米胚性愈傷組織各10皿[36],每皿100塊愈傷組織。

1.5 GUS染色檢測(cè)

將轉(zhuǎn)化后的愈傷組織轉(zhuǎn)接到N6繼代培養(yǎng)基上,27 ℃黑暗培養(yǎng)2 d后,選大小和形態(tài)基本一致的愈傷組織各15皿,每皿60塊愈傷組織,分別實(shí)施高滲(8%甘露醇)、高鹽(200 mmol·L-1NaCl)、低溫(4 ℃)處理和ABA(100 μmol·L-1)誘導(dǎo)24 h。每處理3皿,其余3皿作空白對(duì)照。處理結(jié)束后,用Jefferson等[37]的方法染色,解剖顯微鏡下觀察照像。

1.6 5′-端缺失實(shí)驗(yàn)

為確定pMGL3啟動(dòng)子具有啟動(dòng)活性的最短序列,根據(jù)啟動(dòng)子序列分析結(jié)果設(shè)計(jì)6對(duì)PCR引物F1/R1、F1/R2、F2/R1、F3/R1、F4/R1和F5/R2,以玉米自交系‘B73’基因組DNA為模板,分別擴(kuò)增pMGL3啟動(dòng)子序列全長(zhǎng)的1 554 bp片段、增加5′-端非編碼序列(5′-untranslated region,5′-UTR)的1 720 bp片段,以及去除不同非生物脅迫應(yīng)答元件的1 129、690、429和325 bp片段,通過(guò)相應(yīng)的酶切連接取代包含雙子葉植物增強(qiáng)子AtADH5′-UTR的表達(dá)載體pRI201-AN-GUS(TaKaRa,大連)中的35S啟動(dòng)子(圖2),并以組成型強(qiáng)啟動(dòng)子ubiquitin為對(duì)照,構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大葉煙草品種‘Wisconsin 38’葉盤,經(jīng)篩選鑒定后分化培養(yǎng)愈傷組織,GUS染色鑒定上述截短片段是否能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)。

圖1 pMGL3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS表達(dá)載體(pBI221-pMGL3-GUS)

2 結(jié)果與分析

2.1 MGL3基因在非生物逆境脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)

對(duì)qRT-PCR結(jié)果的方差分析表明,在模擬干旱脅迫初期(0～24 h),MGL3基因表達(dá)水平與0 h空白對(duì)照無(wú)差異,但在48 h時(shí)有一表達(dá)高峰,72 h后下降(圖3)。在高鹽脅迫下,MGL3基因的表達(dá)從12 h開(kāi)始上升,24 h達(dá)到高峰,隨后下降(圖3)。在低溫脅迫下,MGL3基因表達(dá)的高峰出現(xiàn)在6 h,其他時(shí)間段與0 h空白對(duì)照無(wú)顯著差異(圖4)。MGL3基因表達(dá)對(duì)高溫脅迫的應(yīng)答不明顯,只在24 h后才略有升高(圖4)。在ABA和乙烯誘導(dǎo)下,MGL3基因表達(dá)的高峰分別出現(xiàn)在6 h和2 h,其余時(shí)間段與0 h空白對(duì)照的差異不顯著(圖4)。結(jié)果表明,MGL3基因的表達(dá)響應(yīng)多種非生物逆境脅迫,其啟動(dòng)子pMGL3很可能具有非生物逆境啟動(dòng)活性。

2.2 pMGL3啟動(dòng)子序列

以玉米LEA蛋白第3亞家族成員MGL3對(duì)應(yīng)的mRNA序列為探針,與玉米自交系“B73”基因組RefGen_v3版本序列比對(duì),將MGL3基因定位于第6染色體Chr6:162162323～162163588,與此段基因組序列的一致性為100%。用PlantCARE軟件對(duì)其編碼序列上游1 500 bp(Chr6:162160979～162162478)啟動(dòng)子序列分析表明,除TATA框等啟動(dòng)子序列的基本元件外,還包括MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS、脫水應(yīng)答元件ABRE及ARE等多種響應(yīng)非生物逆境脅迫的順式作用元件(圖5、表1)。

圖2 包含雙子葉植物增強(qiáng)子AtADH5′-UTR的表達(dá)載體(pRI201-AN-GUS)

2.3 逆境脅迫下pMGL3驅(qū)動(dòng)GUS基因瞬時(shí)表達(dá)

根據(jù)啟動(dòng)子序列分析設(shè)計(jì)的特異PCR引物,以玉米自交系‘B73’基因組DNA為模板,擴(kuò)增得到的片段約長(zhǎng)1 500 bp(圖6),實(shí)際測(cè)序結(jié)果為1 554 bp,與預(yù)測(cè)結(jié)果相符合。

擴(kuò)增片段經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后插入單子葉植物表達(dá)載體pBI221-Ubi-GUS,構(gòu)建成MGL3基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)載體pBI221-pMBL3-GUS,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)菌液PCR檢測(cè)挑陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng),再經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切鑒定(圖7)和測(cè)序驗(yàn)證,與預(yù)期相符。

用表達(dá)載體pBI221-pMGL3-GUS基因槍法轉(zhuǎn)化玉米胚性愈傷組織,在8%甘露醇高滲、200 mmol·L-1NaCl高鹽和4 ℃低溫脅迫及100 mol·L-1ABA誘導(dǎo)條件下,GUS染色均可顯現(xiàn)靛藍(lán)色斑點(diǎn),而空白對(duì)照沒(méi)有顯現(xiàn)(圖8),說(shuō)明pMGL3啟動(dòng)子的確有非生物逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)功能。

圖3 MGL3基因在干旱和高鹽脅迫下的差異表達(dá)

圖4 MGL3基因在低溫、高溫脅迫和ABA、乙烯誘導(dǎo)下的差異表達(dá)

圖5 玉米MGL3基因啟動(dòng)子序列及其非生物逆境脅迫應(yīng)答元件下劃實(shí)線表示非生物逆境脅迫應(yīng)答元件,下劃虛線表示截短引物

表1 玉米MGL3基因啟動(dòng)子的非生物逆境脅迫應(yīng)答元件

2.4 保持啟動(dòng)活性的截短片段

瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草愈傷組織的GUS染色結(jié)果表明,5′端截短不同長(zhǎng)度的pMGL3啟動(dòng)子片段,均能驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá),愈傷組織呈現(xiàn)靛藍(lán)色斑點(diǎn)(圖9)。一直截短至325 bp仍可保持pMGL3啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性。由此說(shuō)明,這325 bp上游的非生物逆境脅迫應(yīng)答元件,雖然可能響應(yīng)脅迫誘導(dǎo)而增強(qiáng)pMGL3啟動(dòng)子的活性,但并不是保持驅(qū)動(dòng)活性所必需的。

圖6 MGL3基因啟動(dòng)子擴(kuò)增片段M.DL2000;1.pMGL3啟動(dòng)子

圖7 表達(dá)載體pBI221-pMGL3-GUS酶切鑒定M.DL2000;1.表達(dá)載體pBI221-pMGL3-GUS經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切片段

圖8 pBI221-pMGL3-GUS轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織GUS染色

圖9 pMGL3啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度截短片段驅(qū)動(dòng)GUS基因轉(zhuǎn)化煙草愈傷組織GUS染色a～f.分別為1 720、1 554、1 129、 690、429和325 bp片段;g.Ubiquitin;h.空白對(duì)照

3 討 論

PlantCARE分析結(jié)果表明,pMGL3啟動(dòng)子含有ABRE、ARE、MBS、TC-rich repeat等順式作用元件。這些元件的非生物逆境應(yīng)答特性在以往的研究中已有較多的報(bào)道。譬如,ABRE元件與高鹽脅迫[22-23]、干旱脅迫和ABA誘導(dǎo)相關(guān)[38],ARE與厭氧應(yīng)答相關(guān)[39],MBS元件與干旱等多種非生物逆境脅迫相關(guān)[38,40],TC-rich repeat與防衛(wèi)和脅迫有關(guān)[41-42],TCA-element參與水楊酸反應(yīng)[42-43]等等。

在本研究中,根據(jù)序列中非生物逆境順式作用元件分析結(jié)果,將pMGL3啟動(dòng)子截短至325 bp仍可保持其驅(qū)動(dòng)活性,還不能說(shuō)明是否為pMGL3啟動(dòng)子保持驅(qū)動(dòng)活性的最短片段,而只說(shuō)明那些與非生物逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件只起基因表達(dá)強(qiáng)度的調(diào)控作用,而不起開(kāi)關(guān)的決定性作用。棉花胚胎發(fā)生后期豐富蛋白基因D113啟動(dòng)子5′端截短實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明,保持非生物逆境響應(yīng)及驅(qū)動(dòng)活性的最短序列在158至574 bp之間[44]。有研究表明,不同來(lái)源的胚胎發(fā)生后期豐富蛋白基因啟動(dòng)子,對(duì)非生物逆境的響應(yīng)及驅(qū)動(dòng)活性不盡相同。譬如,大麥胚胎發(fā)生后期豐富蛋白基因啟動(dòng)子Dhn4s的驅(qū)動(dòng)活性是來(lái)自大麥和水稻同源啟動(dòng)子HVA1s和wsi18j的2倍,是來(lái)自水稻同源啟動(dòng)子rab16Bj的17倍[45]。要明確這些非生物逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)順式作用元件對(duì)基因表達(dá)強(qiáng)度的具體調(diào)控作用,更需要對(duì)其驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)做定量分析。本研究的定量PCR分析結(jié)果能夠從整體上說(shuō)明這一問(wèn)題,但截短去除不同順式作用元件后的pMGL3啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)GUS基因轉(zhuǎn)化煙草愈傷的GUS染色,只能定性地說(shuō)明各種不同長(zhǎng)度的截短片段仍保持其驅(qū)動(dòng)活性,不能說(shuō)明驅(qū)動(dòng)活性的定量變化。

在模式植物上的研究表明,胚胎發(fā)生后期豐富蛋白基因的啟動(dòng)子可響應(yīng)多種非生物逆境脅迫的誘導(dǎo),驅(qū)動(dòng)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)[46-47]。本研究克隆的玉米胚胎發(fā)生后期豐富蛋白基因MGL3的啟動(dòng)子pMGL3,存在多種與非生物逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)的調(diào)控元件,可響應(yīng)干旱、高鹽、低溫等多種非生物逆境脅迫和激素誘導(dǎo),驅(qū)動(dòng)下游基因的表達(dá)。進(jìn)一步研究驗(yàn)證其作用機(jī)理后,可為抗逆轉(zhuǎn)基因玉米研究提供更多的選擇。

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(編輯:宋亞珍)

封面植物介紹——秦嶺石蝴蝶

秦嶺石蝴蝶(PetrocosmeaqinlingensisW.T.Wang),隸屬于苦苣苔科,石蝴蝶屬,是本屬分布最北緣的種,為多年生宿根草本。葉7～12枚,具長(zhǎng)或短柄;葉片草質(zhì),寬卵形、菱狀卵形或近圓形,長(zhǎng)0.7～3 cm,寬0.7～2.8 cm,頂端圓形或鈍,基部寬楔形,邊緣淺波狀或有不明顯圓齒,兩面疏被貼服短柔毛?；ㄐ?～6,頂生1花?；ㄝ?裂達(dá)基部,外面疏被短柔毛;花冠淡紫色,外面疏被貼服短柔毛,內(nèi)面在上唇被白色柔毛;花冠筒長(zhǎng)約2.8 mm,上唇長(zhǎng)約4.8 mm,2深裂,下唇與上唇近等長(zhǎng),3深裂,所有裂片近長(zhǎng)圓形,頂端圓形?？捎廴?,著生于近花冠基部。雌蕊長(zhǎng)約5 mm,子房與花柱被開(kāi)展的白色柔毛,柱頭小,球形。花期8～9月。秦嶺石蝴蝶花冠筒內(nèi)面被毛,與其近緣種中華石蝴蝶(P.sinensisOliv.)的區(qū)別是后者花冠筒內(nèi)面無(wú)毛。

秦嶺石蝴蝶是由我國(guó)著名分類學(xué)家王文采教授在20世紀(jì)80年代描述并命名的新物種。模式標(biāo)本產(chǎn)地為陜西省勉縣茶店,之后近30年間的調(diào)查中,均未發(fā)現(xiàn)其野生居群。直到近年,在陜西省第二次野生植物資源調(diào)查和漢中市極小種群野生植物秦嶺石蝴蝶、廟臺(tái)槭資源調(diào)查中被重新發(fā)現(xiàn)。

秦嶺石蝴蝶是秦嶺地區(qū)特有的珍稀瀕危野生植物,一般生長(zhǎng)于陰濕山谷巖石上,群落上層為落葉闊葉林,郁閉度比較高。由于其野生居群地理分布極為狹窄,個(gè)體數(shù)量稀少,已經(jīng)被列入第一批國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物,具有較高的科研價(jià)值。

(圖文分別由陜西理工學(xué)院 王勇、楊培君,略陽(yáng)縣野生動(dòng)植物保護(hù)管理站 李長(zhǎng)波和勉縣野生動(dòng)植物保護(hù)管理站 樊榮 提供)

Cloning and Functional Validation of Late EmbryogenesisAbundant Protein Gene Promoter from Maize

ZOU Yutao,LIU Xin,MU Wei,GAO Xuehuan,FU Fengling,LI Wanchen*

(Maize Research Institute,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China)

It has important significance for transgenic resistance research to clone and validate endogenous inducible promoters in response to abiotic stresses,and use to construct inducible expression vectors.In this study,the sequence of the late embryogenesis abundant late gene (MGL3) promoter (pMGL3) was cloned from maize according to bioinformatics analysis.After analysis for abiotic stress-responsive elements and abiotic response by quantitative real-time PCR,we used this sequence to construct expression vector of the reporter geneGUS,and used to transform maize calli by biolistic method.The promotion activity of thepMGL3 promoter under abiotic stress was validated by GUS staining.In addition,the differentcis-acting elements was removed according to promoter sequence analysis,used to construct expression vectors of the reporter geneGUS,and transform tobacco discs byAgrobacteriummediation,in order to determine the shortest active sequence of thepMGL3 promoter.The results showed that thepMGL3 promoter is 1 554 bp long,containing multiple regulatory elements in response to abiotic stress.The expression of theMGL3 gene is increased under the stress of drought,high salt and low temperature,and induction of abscisic acid and ethylene.The calli transformed by theGUSgene under control of thepMGL3 promoter showed promotion activity under high osmotic,high salt,low temperature stresses,and abscisic acid induction.However,it kept promotion activity when truncated to as short as 325 bp.These results indicated that thepMGL3 promoter has promotion activity in response to abiotic stresses,and can be applied to maize transgenic studies for abiotic tolerance after further validation for its mechanism.

abiotic stress;late embryogenesis abundant protein;maize;promoter

1000-4025(2015)04-0653-09

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0653

2014-11-26;修改稿收到日期:2015-01-22

國(guó)家自然科學(xué)基金(31071433)

鄒郁陶(1990-),女,在讀碩士研究生,主要從事玉米遺傳育種與生物技術(shù)研究。E-mail:457510642@qq.com

*通信作者:李晚忱,教授,主要從事玉米遺傳育種與生物技術(shù)研究。E-mail:aumdyms@sicau.edu.cn

Q789

A