高危型HPV感染宮頸病變中E6/E7 mRNA的表達(dá)水平

劉甚佳，尹利榮，李洪林

宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女健康和生命的惡性腫瘤，發(fā)病率位居婦科惡性腫瘤的第二位，是由其癌前病變，即宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neo?plasia,CIN）逐步發(fā)展形成。宮頸癌及其癌前病變的發(fā)生和發(fā)展與高危型人乳頭狀瘤病毒（HR-HPV）的感染密切相關(guān)。人乳頭狀瘤病毒（HPV）的早期基因E6/E7具有較強的抗原性，且在宮頸高級別病變中持續(xù)高表達(dá)，其在感染過程中產(chǎn)生的早期蛋白E6/E7在宿主細(xì)胞中的表達(dá)是導(dǎo)致宮頸癌的關(guān)鍵因素[1]。目前應(yīng)用HPV E6/E7 mRNA檢測的方法在宮頸疾病篩查中尚未廣泛普及，臨床資料相對較少，本研究應(yīng)用支鏈DNA(b-DNA)技術(shù)對HR-HPV感染患者宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行HPV E6/E7 mRNA檢測，了解其在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌脫落細(xì)胞中的表達(dá)情況，以評估此方法作為宮頸癌及癌前病變篩查輔助指標(biāo)的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 連續(xù)入選2013年11月—2014年5月在我院婦科就診的HR-HPV感染者265例，研究組共165例，其中CINⅠ級組88例，CINⅡ級組33例，CINⅢ級組28例，宮頸癌組16例；余100例正常宮頸或慢性炎癥者為對照組。均無先天性遺傳病、嚴(yán)重內(nèi)科疾病及其他部位腫瘤。

1.2 試劑及儀器 宮頸穩(wěn)態(tài)試劑盒（Diacarta Inc,美國）及96孔檢測板購自科蒂亞（新鄉(xiāng)）生物技術(shù)有限公司；DiaCarta臺式冷光儀；恒溫箱（型號QS071）。

1.3 方法

1.3.1 HPVE6/E7 mRNA的檢測 （1）標(biāo)本采集：使用液基細(xì)胞學(xué)Autocyteprep系統(tǒng)專用刷插入受檢者子宮頸旋轉(zhuǎn)8～10圈，收集宮頸口及頸管脫落上皮細(xì)胞，然后將刷頭部放入裝有CytoRich保存液的小瓶內(nèi)供HPVE6/E7 mRNA檢測。（2）實驗步驟：將液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本放入離心管水平離心2次（3 000 r/min，5 min），使標(biāo)本同質(zhì)化。加入600 μL細(xì)胞裂解液和5 μL蛋白酶K，吹打混勻，放入65℃恒溫箱1 h，中間取出標(biāo)本管振蕩2～3次，使細(xì)胞充分裂解，待測。按照宮頸穩(wěn)態(tài)試劑盒說明書操作及配置相關(guān)溶液并布板，其中陽性對照液，空白對照液均做復(fù)孔。經(jīng)過信號放大，加入標(biāo)記熒光物質(zhì)的底物后，在冷光儀上檢測。檢測結(jié)果為光子數(shù)，經(jīng)計算軟件轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)?？蓹z測HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、66、26、55、61、73、83等19種高危亞型的HPVE6/E7 mRNA片段。

1.3.2 薄層液基細(xì)胞學(xué)（TCT）檢測 標(biāo)本采集方法同上，采用新柏氏TCT檢測系統(tǒng)，使用TBS描述性診斷報告，包括正常、非典型鱗狀細(xì)胞（ASC）、低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變（LSIL）、高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變（HSIL）、宮頸癌等。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗，計量資料以M(P25，P75)表示，比較采用Kruskal-wallis H檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，兩兩比較時校正檢驗水準(zhǔn)為α=0.005。

2 結(jié)果

2.1 各組HPVE6/E7 mRNA陽性率及表達(dá)量比較 CINⅡ級、CINⅢ級和宮頸癌組的HPV E6/E7 mRNA陽性率及表達(dá)量高于對照組和CINⅠ級組（P＜0.005）。CINⅡ級、CINⅢ級和宮頸癌組間無明顯差異，正常組與CINⅠ級組無明顯差異（均P＞0.005），見表1。

2.2 不同TCT診斷級別中HPV E6/E7 mRNA表達(dá)水平比較 HSIL和宮頸癌組的HPV E6/E7 mRNA陽性率及表達(dá)量顯著高于正常、ASC和LSIL組（P＜0.05），見表2。

Tab.1 Comparison of HPV E6/E7 mRNA positive rate and transcription levels between five groups表1 各組HPV E6/E7 mRNA陽性率及表達(dá)水平比較

Tab.2 The transcription level of HPV E6/E7 mRNA in different TCT diagnosis level表2HPV E6/E7 mRNA在不同TCT診斷級別中的表達(dá)情況

3 討論

3.1 HPV E6/E7 mRNA在宮頸癌及CIN中的研究現(xiàn)狀及意義 宮頸癌是目前唯一病因明確的婦科惡性腫瘤，與HR-HPV的持續(xù)感染有關(guān)[2]。99.7%的宮頸癌組織中可檢測到HPV，未感染HPV者幾乎不會發(fā)生宮頸癌（陽性預(yù)測值＞99.0%）[3]。HPV產(chǎn)生的早期蛋白E6/E7在宿主細(xì)胞中的過度表達(dá)是導(dǎo)致宮頸癌的關(guān)鍵因素。其主要機制為：HPV感染宿主細(xì)胞后，其E6/E7致癌基因可顯著抑制p53和Rb這2種抑癌蛋白，從而干擾細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，促使細(xì)胞無規(guī)則生長[4]。其中，E6蛋白通過結(jié)合宿主細(xì)胞p53抑癌基因使之失活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡途徑失能促使細(xì)胞永生化；E7蛋白通過使Rb失活，影響細(xì)胞周期，啟動端粒酶基因，從而使細(xì)胞永生，癌變發(fā)生[5]。而HPV E6/E7 mRNA正是病毒癌基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其表達(dá)會導(dǎo)致宿主細(xì)胞最終向惡性方向轉(zhuǎn)化[6]。然而，大部分女性感染HPV只是暫時性的，即使HPV持續(xù)存在，但并不必然導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生，80%的HRHPV感染是一過性的[7]。HR-HPV感染的女性中大約只有1%會逐漸發(fā)展為宮頸癌[8]。HPV致癌過程不是一個勻速過程，病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的“整合”增加了基因不穩(wěn)定性，標(biāo)志著惡性轉(zhuǎn)化的開始[9]。游離狀態(tài)的病毒在人體正常免疫調(diào)節(jié)下多數(shù)可以自動清除，只有病毒整合至宿主細(xì)胞數(shù)量到達(dá)一定程度時，才會發(fā)展為高級別病變甚至發(fā)生宮頸癌。CIN存在自然轉(zhuǎn)歸的問題，隨著CIN級別的提高，病變的逆轉(zhuǎn)率逐漸下降，病變的進(jìn)展率逐漸升高，說明低級別CIN有可逆性，而高級別CIN與發(fā)展為浸潤性癌有一定關(guān)系[10]。HPV E6/E7 mRNA在宮頸組織中表現(xiàn)了癌基因活性，其水平與病變的嚴(yán)重程度相關(guān)。HPV E6/E7 mRNA檢測可以篩查出真正高級別病變，為臨床篩查方法提供了新選擇。

3.2 HPV E6/E7 mRNA檢測篩查高級別宮頸病變的診斷性能和優(yōu)勢 本試驗采用b-DNA技術(shù)對HPV E6/E7 mRNA進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：在HR-HPV感染者中，HPV E6/E7 mRNA在正常組、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌組中的陽性表達(dá)率和表達(dá)量基本隨病理級別的升高呈增強趨勢，提示HPV E6/E7 mRNA水平與病變的嚴(yán)重程度相關(guān)。CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的HPV E6/E7陽性率及表達(dá)量明顯高于正常組和CINⅠ組，說明這種檢測方法在篩查高級別宮頸病變方面有優(yōu)勢，與Liu等[11-12]研究結(jié)果一致。低級別CIN（CINⅠ)有可逆性，而高級別CIN (CINⅡ、CINⅢ)與發(fā)展為浸潤型癌有關(guān)，HPV E6/E7 mRNA檢測可分流高、低危人群。另外，本試驗結(jié)果還顯示HPV E6/E7 mRNA檢測隨著TCT診斷級別的提高，其陽性率及表達(dá)量也基本呈上升趨勢，也說明HPV E6/E7 mRNA檢測用于宮頸病變篩查結(jié)果與細(xì)胞學(xué)診斷在一定程度上相符合。有文獻(xiàn)報道在檢測高級別宮頸病變中，HPVE6/E7 mRNA較HPV DNA具有更高特異性（85%vs 40.83%）［13]。測定E6/ E7 mRNA有助于區(qū)分一過性感染（低表達(dá)）和發(fā)展為癌（高表達(dá)）的人群，尤其對于TCT示ASC-US的單純一過性感染及可逆的低級別宮頸病變（CINⅠ）患者，E6/E7 mRNA檢測可給予良好補充和有效提示，可以有效排除風(fēng)險，從而減輕患者的心理壓力，避免過度治療。

HPVE6/E7 mRNA檢測作為一種新的宮頸病變輔助診斷指標(biāo)，其操作簡單，無創(chuàng)、安全、價格低廉的優(yōu)點適合于臨床宮頸病變的篩查，特別對于篩查出高級別的宮頸病變有重要意義。

[1]Lu X,Lin Q,Lin M,et al.Multiple-integrations of HPV16 genome and altered transcription of viral oncogenes and cellular genes are asso?ciated with the development of cervical cancer[J].PLoS One，2014，9(7): e97588.doi:10.1371/journal.pone.0097588.eCollection 2014.

[2]Schwarz JK,Siegel BA,Dehdashti F，et al.Metabolic response on posttherapy FDG-PET predicts patterns of failure after radiotherapy for cervical cancer[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2012,83(1):185-190. doi:10.1016/j.ijrobp.2011.05.053.

[3]LI YL.The clinical research progress of HPV infection and cervical lesion[J].Medical Journal of the Chinese People’s Armed Police Forces,2012,23(2):93-96.[李亞里.HPV感染與宮頸癌前病變的臨床研究進(jìn)展[J].武警醫(yī)學(xué),2012,23（2）：93-96].

[4]Shaikh F,Sanehi P,Rawal R.Molecular screening of compounds to the predicted Protein-Protein Interaction site of Rb1-E7 with p53-E6 in HPV[J].Biomedical Informatics,2012,8(13):607-612.doi: 10.6026/97320630008607.

[5]Belyaeva TA,Nicol C,Cesur O,et al.An RNA aptamer targets the PDZ-binding motif of the HPV16 E6 oncoprotein[J].Cancers(Ba?sel)，2014，6(3):1553-1569.doi:10.3390/cancers6031553.

[6]Rampias T,Boutati E,Pectasides E,et al.Activation of Wnt signaling pathway by buman papillomavirus E6 and E7 oncogenes in HPV16-positive oropharyngeal squamous carcinoma cells[J].Mol Cancer Res,2010,8(3):433-443.doi:10.1158/1541-7786.MCR-09-0345.

[7]Mehlhorn G,Obermann E,Negri G,et al.HPV L1 detection discrimi?nates cervical precancer from transient HPV infection:a prospec?tive international multicenter study[J].Mod Pathol，26(7):967-974. doi:10.1038/modpathol.2012.233.

[8]Josefsson AM,Magnusson PK,Ylitalo N,et al.Viral load of human papilloma virus 16 as a detetmination for development of cervical carcinoma in situ:a nested case-control study[J].Lancet,2000,355 (9222):2189-2193.doi:10.1016/S0140-6736(00)02401-6.

[9]Pett M,Coleman N.Integration of high-risk human papillomavirus a key event in cervical carcinogenesis[J].J Pathol,2007,212(4):356-367.doi:10.1002/path.2192.

[10]Discacciati MG,da Silva ID,Villa LL,et al.Prognostic Value of DNA and mRNA E6/E7 of Human Papillomavirus in the Evolution of Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade 2[J].Biomark Insights, 2014,13(9):15-22.doi:10.4137/BMI.S14296.eCollection 2014.

[11]Liu TY,Xie R,Luo L,et al.Diagnostic validity of human papilloma?virus E6/E7 mRNA test in cervical cytological samples[J].J Virol Methods,2014,196:120-125.doi:10.1016/j.jviromet.2013.10.032.

[12]Li SR，Liu DQ，Hu FY.TNF-α,E2,E6 and E7 in Different Cervi?cal Lesion and Correlation Analysis between Them[J].J Int Obstet Gynecol，2014，41(3):321-323.[李世蓉，劉冬青，胡鳳英.TNF-α、E2、E6及E7在不同宮頸病變組織中的表達(dá)及其相關(guān)性分析[J].國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志,2014，41(3):321-323].

[13]Munkhdelger J,Choi Y,Lee D,et al.Comparison of the perfor?mance of the NucliSENS EasyQ HPV E6/E7 mRNA assay and HPV DNA chip for testing squamous cell lesions of the uterine cervix[J]. Diagn Microbiol Infect Dis,2014,79(4):422-427.doi:10.1016/j.di?agmicrobio.2014.04.004.