金銀花花色素的種類和含量的研究

任玉鋒，馬永平，王文麗

(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川 750021)

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金銀花花色素的種類和含量的研究

任玉鋒，馬永平，王文麗

(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川 750021)

[目的]研究金銀花各花期花色素種類和含量的變化。[方法]通過對(duì)不同花期金銀花進(jìn)行了特征顯色反應(yīng)、紫外-可見光譜掃描分析和花色素含量的測(cè)定，分析了金銀花各花期花色素的種類和含量的變化。[結(jié)果]金銀花不同花期的花色素由類黃酮、葉綠素和類胡蘿卜素三大類組成，類黃酮中僅含有黃酮、鄰二酚羥基；米蕾期到金花期，葉綠素含量逐漸下降，類胡蘿卜素、黃酮類色素含量總體呈上升趨勢(shì)，導(dǎo)致花色由白到黃的變化。[結(jié)論]該研究為金銀花花色變化提供了理論依據(jù)。

金銀花；花色色素；種類；含量

金銀花(LonicerajaponicaThunb.)又名忍冬，為忍冬科多年生半常綠纏繞木質(zhì)藤本植物。金銀花因其花“初開時(shí)花色俱白，二三日后花色變得金黃，黃白相映，故呼金銀花?！苯疸y花清香飄逸，沁人心脾，是人們喜愛的觀賞植物，是園林綠化中最常見的樹種之一，常被栽植于墻壁或籬笆兩側(cè)用于觀賞。根據(jù)金銀花花色的變化，可以將金銀花開花過程分為米蕾期、三青期、二白期、大白期、銀花期、金花期[1]。目前國(guó)內(nèi)外已有很多關(guān)于金銀花的研究報(bào)道，主要集中在組織培養(yǎng)[2-3]、化學(xué)成分[4-5]、優(yōu)良品種培育[6]、質(zhì)量[7]等方面。金銀花的質(zhì)量研究，多以金銀花所含抗菌有效成分綠原酸、異綠原酸、黃酮類物質(zhì)和揮發(fā)油等為指標(biāo)，對(duì)不同產(chǎn)地、品種、加工方法、生境、栽培變異、發(fā)育階段、貯藏時(shí)間和提取方法等進(jìn)行考查，以有效成分含量多少及變化情況做出質(zhì)量?jī)?yōu)劣或可行的評(píng)價(jià)[7]。花色的研究一直未見報(bào)道，該研究通過對(duì)金銀花花色素的種類和含量的研究，為金銀花花色變化的生理機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 花朵采集與處理2012年5月中旬，每天10：00于北方民族大學(xué)校園內(nèi)隨機(jī)采取新鮮的金銀花米蕾期、三青期、二白期、大白期、銀花期和金花期6個(gè)花期的花朵，放入冰盒，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

1.2 金銀花花色素的定性鑒定和定量測(cè)定

1.2.1特征顯色反應(yīng)試驗(yàn)。

1.2.1.1石油醚、鹽酸和氨水測(cè)試(花色素類型的定性分析)。用不銹鋼鑷子避開雄蕊將各花期的花瓣拔下，取花瓣0.2 g分別放入具塞試管中，分別加入石油醚、10.0%鹽酸和30.0%氨水各約5 ml，迅速研磨至勻漿，觀察濾液顏色并記錄。

1.2.1.2類黃酮的顯色反應(yīng)。避開雄蕊取各花期的新鮮花瓣 各0.2 g，用甲醇提取，定容至 25 ml，各取 2 ml 提取液，進(jìn)行下列顏色反應(yīng)：①醋酸鉛反應(yīng)，加 1.0%Pb(CH3COO)·3H2O 2 ml，搖勻，靜置 2 h；②三氯化鐵反應(yīng)，加5.0%FeCl3·6H2O 2 ml；③三氯化鋁反應(yīng)，加 1.0%A1Cl3·6H2O 甲醇溶液 1 ml；④濃硫酸反應(yīng)，加 1.5 ml 濃 H2SO4，搖勻，再置沸水浴 5 min；⑤堿性試劑反應(yīng)，加 5%Na2CO33 ml，搖勻，密閉靜置 30 min，然后再通空氣 10 min；⑥氨性氯化鍶反應(yīng)，取甲醇 10 ml，加氨水定容至 25 ml，成為被氨水飽和的甲醇溶液。對(duì)樣品液加 0.01 mol/L SrCl·26H2O 甲醇液10滴，再加被氨水飽和的甲醇液 10 滴，搖勻，靜置 1 h；⑦硼酸反應(yīng)，加 1%C2H2O4·2H2O 10滴，再加 2%H3BO33 ml。

1.2.2花色色素種類的鑒定。

1.2.2.1色素中葉綠素、類胡蘿卜素的鑒定。 取各花期新鮮花瓣1.0 g，用95%乙醇提取、定容至25 ml，立刻用紫外-可見分光光度計(jì)在400～800 nm范圍內(nèi)掃描，石英杯光徑為1 cm。

1.2.2.2花色色素的紫外-可見光譜分析。稱各花期1.0 g新鮮花瓣，用甲醇研磨提取。過濾定容至25 ml，以甲醇為空白，在 400～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定可見光的各自最大吸收峰，將過濾液稀釋50倍后于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定紫外光的各自最大吸收峰。

1.3 花色素含量的測(cè)定。

1.3.1色素中類葉綠素、類胡蘿卜素含量的測(cè)定。稱取新鮮的花瓣1.0 g，剪碎后放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉末及2～3 ml 95%乙醇研成勻漿，靜置暗處約10 min，將提取液移入25 ml容量瓶中，并用95%的乙醇反復(fù)沖洗至無色為止。最后用95%乙醇定容至25 ml，搖勻。取光徑1 cm的比色杯，注入上述色素乙醇提取液，以95%乙醇另一同樣的比色杯內(nèi)作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)663、646、470 nm下測(cè)定吸光度。其中，Ca=13.95A665-6.88A649、Cb=24.96A649-7.32A665，類胡蘿卜素的濃度C=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245，葉綠素的濃度C=Ca+Cb。

1.3.2色素中總黃酮含量的測(cè)定。

1.3.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試溶液在 400～600 nm 進(jìn)行掃描，其均在 510 nm 處有最大吸收值，故檢測(cè)波長(zhǎng)為 510 nm。精密稱取 120 ℃干燥蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 18 mg，加70%乙醇于水浴上微熱，冷卻后，定容至 100 ml 容量瓶中，搖勻，制成濃度為 0.18 mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0 ml于25 ml容量瓶中，加亞硝酸鈉(5%)1.0 ml，放置 6 min 后，加硝酸鋁(10%)1.0 ml，放置 6 min，再加 4%的氫氧化鈉 10 ml，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以空白作對(duì)照于 510 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定。制備蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2總黃酮含量的測(cè)定。將新鮮花瓣的花蕊去掉，放入恒溫鼓風(fēng)式干燥箱中，現(xiàn)在30～35 ℃下烘干大概2 h后將溫度升高至40～50 ℃下烘干大約10 h，隨后將溫度升高至55～60 ℃下烘干至全干。待完全干燥后，將其取出，研碎待用。

將金銀花不同花期干燥的樣品研磨至粉末狀，精密稱取粉末各 1.0 g，放于索氏提取器中，加入 60.0 ml 乙醇，在 80～85 ℃回流提取3 h，將乙醇提取液轉(zhuǎn)移至 100 ml 容量瓶中，用乙醇定容至刻度，作為供試品溶液，待測(cè)。試驗(yàn)設(shè) 3 次重復(fù)。精密吸取供試品溶液 5.0 ml，置于 25.0 ml 容量瓶中，加亞硝酸鈉(5%)1 ml，放置 6 min 后，加硝酸鋁(10%)1 ml，放置 6 min，再加 4%的氫氧化鈉 10 ml，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以空白作對(duì)照于 510 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定，記錄數(shù)據(jù)，以吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件中單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石油醚、鹽酸和氨水測(cè)試表1顯示，從石油醚反應(yīng)可以看出，6個(gè)花期均表現(xiàn)出了無色，說明類胡蘿卜素的含量少[8]；鹽酸測(cè)試表現(xiàn)了程度不同的黃色，說明含有黃酮類化合物且含量有差異[9]；氨水測(cè)試中，米蕾期、大白期、銀花期、金花期表現(xiàn)了黃色，意味著含有黃酮色素[9]，三青期、二白期黃綠色，說明不僅含有黃銅類化合物，還含有葉綠素。

表1 金銀花花色素類型測(cè)試的顏色反應(yīng)

2.2 金銀花花色色素的特征顏色反應(yīng)

2.2.1醋酸鉛反應(yīng) 。從表2可見，金銀花不同花期均出現(xiàn)不同程度黃色沉淀，說明類黃酮具備酚羥基且不含耳酮和橙酮，可能具有鄰二酚羥基或兼有4-酮基、3-OH 或4-酮基、5-OH 結(jié)構(gòu)[8]。

2.2.2三氯化鐵反應(yīng)。金銀花不同花期表現(xiàn)不同程度的黃綠色(表2)，意味著色素分子中含有酚羥基[10]。

2.2.3三氯化鋁反應(yīng)。在三氯化鋁反應(yīng)中表現(xiàn)極淡黃色的品種意味著有黃酮(表2)。

2.2.4濃硫酸反應(yīng)。金銀花不同花期均出現(xiàn)不同程度的棕色(表2)，意味著含有黃酮或黃酮醇化合物[11-12]。

2.2.5碳酸鈉反應(yīng)。由表2可見，各花期花瓣碳酸鈉反應(yīng)后呈現(xiàn)淡黃色，且通空氣后顏色不變，說明不含二氫黃酮醇、噢哢、查爾酮、黃酮醇[8]。

2.2.6氨性氯化鍶反應(yīng)。金銀花各花期花瓣產(chǎn)生黃色沉淀(表2)，證明色素具備鄰二酚羥基，意味著色素分子中有 3’，4’- 二羥基[11-12]。

2.2.7硼酸反應(yīng)。各花期在硼酸反應(yīng)中均無色(表2)，說明金銀花花色色素中的黃酮可能不含C5-OH[11-12]。

表2 金銀花各花期類黃酮的顯色反應(yīng)

2.3 花色色素成分的紫外-可見光譜分析

2.3.1金銀花花朵中葉綠素的鑒定。金銀花各花期的丙酮乙醇溶液在663 nm處均有吸收峰(圖1)，意味著金銀花花瓣中含葉綠素[12]。

2.3.2金銀花花朵中類胡蘿卜素的鑒定。金銀花各花期花瓣的提取液在類胡蘿卜素的特征吸收峰441和471 nm 附近均有吸收(圖1)，說明花瓣中含有類胡蘿卜素[12]。

2.3.3金銀花花朵中類黃酮的鑒定。各花期花瓣類黃酮提取液定容至100 ml后觀察顏色。各花期紫外光區(qū)吸收光譜的3個(gè)主要吸收峰位置相似，均集中在221 nm(帶I)、235 nm(帶Ⅱ)、310～330 nm(帶Ⅲ)(圖1)。由帶Ⅱ、帶Ⅲ的位置可以鑒別該類化合物類型是黃酮[13]。310～330 nm(帶Ⅲ)吸收峰說明色素可能含有異黃酮[13]；帶I可能是未分離的雜質(zhì)引起的。

2.4 金銀花各花期花色素含量分析由表3可知，金銀花由米蕾期至金花期各花期葉綠素含量呈下降趨勢(shì)，且由米蕾期至銀花期各花期差異達(dá)極顯著；金花期和銀花期葉綠素含量雖然有差異，但差異不顯著。這可能是由于隨著花期的推進(jìn)，葉綠素逐漸分解所致。類胡蘿卜素含量總體上較低，其中從米蕾期至銀花期逐漸下降，從銀花期至金花期含量上升且達(dá)最高，除銀花期差異不顯著外，其他各花期差異均達(dá)極顯著，說明在從米蕾期至銀花期的花期推進(jìn)中類胡蘿卜素有所降解，金花期又逐漸積累所致。黃酮類色素含量總體上呈增加趨勢(shì)，其中從米蕾期至銀花期逐漸上升，至金花期含量又有所下降，各花期差異均達(dá)極顯著。

表3 金銀花各花期花色素含量 mg/100 g

注：**表示同一列數(shù)據(jù)差異性極顯著(P<0.01)。

3 討論

(1)植物花色色素是一種很復(fù)雜的性狀，主要包括類黃酮、類胡蘿卜素和生物堿(alkaloids)[14-15]。 安田齊根據(jù)顏色將花色色素分為類胡蘿卜素、類黃酮和花青素，類黃酮包括黃酮、黃酮醇和查爾酮[16]。但類黃酮與黃酮類(化合物)應(yīng)是同一概念。類胡蘿卜素使花產(chǎn)生黃色和橙色，類黃酮使花產(chǎn)生黃色[14-15]。不同色素種類及其含量的時(shí)空組合最終決定花色，不同色素又以不同的形式和含量存在于花瓣上，且哪種色素含量越高，花瓣顏色越向該色偏移，其他色素起調(diào)節(jié)作用，但花色與花瓣所含色素的顏色并不完全相同[17]。從銀花期的白色到金花期的黃色，主要是由于類胡蘿卜素、類黃酮含量增加，尤其是類黃酮含量增加的結(jié)果。

(2)該研究中，金銀花由米蕾期至金花期各花期其花瓣中均含有葉綠素，且從米蕾期至金花期各花期隨花朵的開放，含量逐漸下降，使得金銀花從蕾期的綠色至銀花期的白色再到金花期的黃色。

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Study on the Categories and Contents of the Flower Color Pigments ofLonicerajaponicaThunb.

REN Yu-feng,MA Yong-ping,WANG Wen-li

(College of Biological Science and Engineering, Beifang University of Nationalities,Yinchuan,Ningxia 750021)

[Objective] The research aimed to study the change of the categories and contents of the flower color pigments in different florescence ofLonicerajaponicaThunb..[Methods]Through investigating such as the specific color reactions,UV-visible spectra scanning and determination of flower pigment contents in different florescence ofLonicerajaponicaThunb., the change of the categories and contents of the flower color pigments in different florescence ofLonicerajaponicaThunb.were analysised.[Results]The flower pigments in different florescence ofLonicerajaponicaThunb. mainly consist of chlorophyll, carotenoid and flavonoid, there was only flavones and the adjacent two phenolic hydroxyl group in the flavonoid. From millay period to golden period, chlorophyll content decreased gradually, but carotenoid, flavonoid pigments content overall upward trend, led to color from white to yellow changing.[Conclusion]The study provides the theoretical basis for the flower color changes ofLonicerajaponicaThunb..

LonicerajaponicaThunb.; Flower color pigment;Category;Content

北方民族大學(xué)2011年自主科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(2011ZMY006)。

任玉鋒(1964- )，女，寧夏平羅人，教授，碩士，從事植物生理生態(tài)學(xué)的教學(xué)與研究工作。

2014-11-28

S 567.7+9

A

0517-6611(2015)02-090-04