紅球菌來源QsdA型N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用潛力分析

張美超楊雅麟宋水山徐 俐姚 斌周志剛

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點試驗室, 北京 100081; 2. 河北省科學(xué)院生物研究所,石家莊 050081)

紅球菌來源QsdA型N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用潛力分析

張美超1楊雅麟1宋水山2徐 俐1姚 斌1周志剛1

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點試驗室, 北京 100081; 2. 河北省科學(xué)院生物研究所,石家莊 050081)

通過研究 QsdA型 N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶酶學(xué)性質(zhì)來評估其飼用潛力。研究通過提取紅球菌(Rhodococcus erythropolis)BLJF-1的基因組, 利用 PCR 技術(shù)克隆得到 N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶基因 qsdA-rh5。構(gòu)建重組表達載體pET28a/qsdA-rh5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3), 篩選得到具有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶活性的轉(zhuǎn)化子即為重組菌株, 隨后經(jīng)Ni-NTA柱純化得到的重組蛋白QsdA-RH5進行補充酶學(xué)性質(zhì)的研究。結(jié)果表明, 克隆得到972 bp的目的基因。構(gòu)建重組載體, 篩選得到重組菌株經(jīng)誘導(dǎo)表達后得到具有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶活性的目的蛋白即 QsdA-RH5, 經(jīng)分析表明, 該蛋白的理論分子量為 36 kD, 屬于金屬依賴性水解酶PET超家族。酶學(xué)性質(zhì)研究表明: 其最適作用 pH 為 8.0, 作用溫度為 35℃, 在 pH 6—11內(nèi)能夠穩(wěn)定的存在, 在10—40℃, 酶活性能夠維持在 80% 以上, 且該酶對多種金屬離子、化合物具有很好的抗性。該融合蛋白具有較為專一的底物特異性, 只對沒有取代基團的底物具有水解作用, 以 C7-HSL 為底物時的Km值為0. 0125 mmol/L。實驗經(jīng)酶學(xué)性質(zhì)研究表明, 該酶具有較為專一的底物特異性, 因此可具有針對性的控制外源性病原菌毒性效應(yīng)對維護畜禽 ( 水產(chǎn)) 消化道健康方面具有一定的應(yīng)用前景。

紅球菌; N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶; 重組表達; 酶學(xué)性質(zhì)

細菌根據(jù)特定信號分子的濃度可以檢測周圍環(huán)境中自身或其他細菌的數(shù)量變化: 當信號達到一定的濃度閾值時, 能啟動菌體中相關(guān)基因的表達來適應(yīng)環(huán)境中的變化, 這一調(diào)控系統(tǒng)被稱為細菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum sensing, 簡稱QS)[1,2]。在革蘭氏陰性細菌中群體感應(yīng)的種內(nèi)信號分子是 N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯(AHLs), 當 AHLs濃度達到一個閾值即可調(diào)控下游靶基因的表達, 并產(chǎn)生表型效應(yīng), 包括生物熒光、Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、涌(泳)動現(xiàn)象、抗生素和色素的生物合成及生物膜形成[3—7]。在眾多的表型效應(yīng)中, 我們最關(guān)注的是群體感應(yīng)與調(diào)控病原菌的致病性有著密切的聯(lián)系?，F(xiàn)已證實包括嗜水氣單胞菌 (Aeromonashydrophila)、 遲 緩 愛 德 華 氏 菌(Edwardsiellatarda)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)及霍亂弧菌(Vibrio cholera)等多種水產(chǎn)養(yǎng)殖主要細菌性病原菌的致病性與群體感應(yīng)的調(diào)控有關(guān), 其中包括調(diào)控誘導(dǎo)蛋白酶、裂解酶、毒素、鐵載體、黏附因子等多種毒力因子的表達[2,8—13]。在過去的十幾年中研究發(fā)現(xiàn)一些方法可以阻斷群體感應(yīng)的發(fā)生,這一阻斷途徑統(tǒng)稱為群體淬滅, 在眾多的阻斷過程中, 利用N-?；呓z氨酸降解酶淬滅病原菌群體感應(yīng)通路中的信號分子[14], 具有既可以通過阻斷策略達到防治水產(chǎn)養(yǎng)殖細菌性病害的目的, 又可以使毒性淬滅后的病原細菌成為天然的減毒活疫苗的雙重功效。

N-?；呓z氨酸降解酶廣泛存在于自然界, 目前已在來源于細菌、真菌、哺乳動物細胞及環(huán)境土壤樣品的宏基因組中克隆得到編碼 N-?；呓z氨酸降解酶的基因[7]。N-酰基高絲氨酸降解酶按照降解AHLs位點的不同分為兩大類, 一類是N-?；呓z氨酸?；D(zhuǎn)移酶(AHL acylase), 如AiiD、AhlM、QuiP、PvdQ、HacB、Aac 和AiiO等[15—21]。另一類是N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶(AHLase)[22]。如QsdH[2]、AidC[7]、AhlD、AhlK[8]、AiiA[23]、AiiB、AttM[24,25]、QlcA[26]、AiiM[27]、AidH[28]和QsdA[29]等。

Uroz等[30]篩選得到一株具有AHLs降解活性的紅球菌(Rhodococcus erythropolis)W2, 經(jīng)研究表明,該紅球菌具有廣譜的底物特異性及快速降解 AHLs的能力, 并發(fā)現(xiàn)其可以通過降解 AHLs來干擾色桿菌屬(Chromobacterium)中紫色桿菌素的產(chǎn)生, 農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)中致病因子的調(diào)控及明顯的降低果膠桿菌(Pectobacterium carotovorum)的致病性,這表明該紅球菌是一個潛在的生物防控制劑。2008年Uroz等[29]經(jīng)過進一步研究從紅球菌(Rhodococcus erythropolis W2)中克隆得到N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶基因 qsdA并將其表達的目的蛋白命名為 QsdA, QsdA 屬于Phosphotriesterase (PTE)超家族, 是一個金屬依賴性的水解酶, 其中含有兩個 Zn2+離子參與催化作用, 隨后Uroz等又從其他的紅球菌及其親緣關(guān)系相近的菌種中篩選得到15株具有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶活性的菌株。然而與其他的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶相比[2,7,27,31—34], 還沒有見到系統(tǒng)深入的評估QsdA型N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶是否適合作為飼用酶制劑的文獻報道。因此本研究的目的是確定QsdA型N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶酶學(xué)性質(zhì)并進一步評估其作為水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用酶制劑的應(yīng)用潛力。我們從紅球菌(R. erythropolis)BFXJ-1中克隆得到一個具有 N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶活性的基因命名為qsdA-rh5, 并將其在大腸桿菌中表達, 經(jīng)純化后得到重組蛋白QsdA-RH5并通過酶學(xué)性質(zhì)的研究對其應(yīng)用前景進行全面評估。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種、質(zhì)粒、載體 紅平紅球菌(R. erythropolis)BFXJ-1(ACCC02579)來源于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心, 用于克隆N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶。報告菌株 Agrobacterium tumefaciens KYC55 (pJZ372) (pJZ384) (pJZ410)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)朱軍教授饋贈[35], 大腸桿菌感受態(tài)細胞 Trans-Ⅰ和克隆載體 pEASY-T3購自北京全式金生物公司, 大腸桿菌感受態(tài)細胞 BL21 (DE3)和表達載體pET-28a(+)購自德國Novagen公司。

主要的培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基用于活化菌株, ATmm培養(yǎng)基用于N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶活性測定。

主要的化學(xué)試劑及儀器 C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL、3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C10-HSL、3-oxo-C12-HSL、3-oxo-C14-HSL、3-hydroxy-C12- HSL和3-hydroxy-C14-HSL購自美國Sigma公司, IPTG和X-gal購自美國Promega公司, 內(nèi)切酶都購自日本TaKaRa公司, 連接酶購自 Invitrogen公司, 其他試劑均系進口分裝或國產(chǎn)分析純。本研究使用的主要儀器有: PCR儀(Techne公司)、SDS-PAG系統(tǒng)( Aamersham Pharmacia Biotech)。

1.2 N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶活性測定方法

N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶活性測定方法參考文獻[36]的方法。反應(yīng)體系: 包括179 μL PBS (pH 8.0), 20 μL QsdA-RH5及1 μL C7-HSL (10 mmol/L)混合,在35℃下?lián)嵊?5min后用終濃度2% SDS終止反應(yīng)。制備 1.5% (w/v)瓊脂條: 將 ATmm混合 20 μg/mL X-gal的培養(yǎng)基倒入平板內(nèi), 用小刀將凝固的瓊脂培養(yǎng)基割成0.8 cm × 6.0 cm的測試條, 在瓊脂條的一端打一個小孔, 在小孔后用牙簽每隔 4 mm接種一個指示菌KYC55。將上述反應(yīng)液10 μL 加到打好的小孔內(nèi), 30℃培養(yǎng)24h觀察指示菌顏色變化。根據(jù)指示菌顏色變化推算 C7-HSL擴散的距離。根據(jù)C7-HSL擴散的距離與已知標品濃度的關(guān)系制作標準曲線[y (nmol) =0.0005×e0.2984x, R2= 0.980], 酶活的定義為1 nmol/min C7-HSL所用到的酶量為一個酶活單位(U)。其他AHLs信號分子依照此方法做標準曲線, 用來測定AHLs的濃度。

1.3 N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶基因克隆及序列分析

設(shè)計引物: QsdA-F (5′-AGTTCAGTACAAACC GTTCGTG-3′)和QsdA-R (5′- TCAGCTCTCGAAGT ACCG-3′), 從紅球菌BFXJ-1基因組中擴增N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶基因qsdA-rh5。PCR 采用50 μL反應(yīng)體系, 擴增條件: 95℃5min; 94℃30s, 55℃ 30s, 72℃ 1min, 30 個循環(huán); 72℃ 10min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接pEASY-T3載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transe-Ⅰ感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆送測序, 將測序得到的結(jié)果用Vector NTI 7軟件和NCBI分析。用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 軟件分析信號肽序列。

1.4 QsdA-RH5的表達與純化

設(shè)計引物 QsdA-EF: 5′-CGGAATTCAGTTC AGTACAAACCGTTCGTG-3′ (上游引入EcoRⅠ酶切位點)和QsdA-ER 5′-AAGCGGCCGCTCAGCTCTC GAAGTACCG-3′ (下游引入NotⅠ酶切位點)。95℃5min; 94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 1min, 30個循環(huán); 72℃ 10min。 PCR產(chǎn)物及pET-28a(+)空載體經(jīng)純化后分別用EcoRⅠ 和NotⅠ雙酶切, 隨后用T連接酶進行連接得到重組載體pET-qsdA-rh5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞, 篩選得到陽性克隆即為重組菌株。將重組菌按2%接種到LB液體培養(yǎng)基中, 37℃培養(yǎng), 當菌液的OD值為0.6—0.8時加入終濃度1 mmol/L的IPTG于20℃誘導(dǎo)12h收集菌體。將經(jīng)誘導(dǎo)后收集得到的菌體超聲破碎后離心收集上清液即為目的蛋白液QsdA-RH5。

QsdA-RH5目的蛋白的純化 將細胞破碎后收集的上清液過Ni-NTA柱純化蛋白, Ni-NTA柱洗脫 液 分 別 為 [20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6), 500 mmol/L NaCl, 10% (w/v) 甘油]緩沖液中添加終濃度為20—200 mmol/L的咪唑。經(jīng)梯度洗脫后分別收集洗脫液, 用12% SDS-PAGE驗證后將得到的純蛋白進行質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)測序。用考馬斯亮藍的方法檢測蛋白的濃度[37]。

1.5 QsdA-RH5的酶學(xué)性質(zhì)測定

除底物特異性外, 其他的酶學(xué)性質(zhì)都是以信號分子 C7-HSL為底物進行測定的。

最適pH 在30℃, 撫育45min條件下分別將酶液混合在 pH 4.0—11的緩沖液中測定 QsdARH5在不同pH條件下的穩(wěn)定性。所用的pH緩沖液分別為: pH 4.0—5. 0、0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液; pH 6.0—8.0、0.1 mol/L的 PBS緩沖液; pH 8.0—9.0、0.1 mol/L 的 Tris-HCl緩沖液; pH 9.0—11.0、0.1 mol/L的 Gly-NaOH 緩沖液。以最高酶活力為100%, 各個 pH下的酶活力與最高活力的比值作為相對酶活力。

最適溫度 在最適pH、撫育 45min條件下,分別在0℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃和65℃下測定QsdA-RH5酶活。以最高酶活力為 100%, 各個溫度下的酶活力與最高活力的比值作為相對酶活力。

pH穩(wěn)定性 將QsdA-RH5酶液與不同pH的緩沖液(pH 4.0—12.0)按1∶9的比例混合后在30℃保溫1h后作為待測液, 以在最適pH條件下保溫1h為對照。在最適條件下, 撫育45min測定QsdA-RH5的酶活。以對照測定的酶活為100% , 各個pH下的酶活力與對照酶活力的比值作為相對酶活力。

溫度穩(wěn)定性 在 70℃下, 在最適 pH緩沖液中將酶液分別保溫 2min、5min、10min、15min、20min、30min、60min后, 以在最適溫度條件下保溫1h為對照, 再將保溫后的溶液作為待測溶液, 在最適條件下?lián)嵊?5min測定QsdA-RH5的酶活。以對照測定的酶活為 100%, 不同時間撫育后溶液的酶活力與對照酶活力的比值作為相對酶活。

金屬離子抗性 在最適的反應(yīng)體系中, 分別加入不同的金屬離子或化學(xué)試劑 (K+、Na+、Ca2+、Li+、Co2+、Cr3+、Ni2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Ag+、Hg2+、Pb+、EDTA、β-mercaptoethanol和SDS, 終濃度為1 mmol/L或10 mmol/L) 。以未加金屬離子或化學(xué)試劑的反應(yīng)體系為對照, 在最適條件下?lián)嵊?5min測定QsdA-RH5的酶活。以對照測定的酶活為 100%, 其他各個處理的酶活力與對照酶活力的比值作為該體系的相對酶活力。

動力學(xué)測定 在最適條件下, 依次在酶促反應(yīng)1min、2min、3min、5min、10min、15min、20min、30min時終止反應(yīng), 測定QsdA-RH5的酶活, 計算出酶促反應(yīng)的一級反應(yīng)時間。再根據(jù)測定的一級反應(yīng)時間, 確定測定Km值及 Vmax的反應(yīng)時間為 15min。用不同濃度的信號分子C7-HSL (10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005 mg/mL)為底物, 在最適條件下測定酶活力, 計算相應(yīng)的反應(yīng)速度, 利用米氏方程雙倒數(shù)法求得 Km值及 Vmax。

底物特異性 在最適條件下, 分別以0.25 mmol/mL的C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL、3-oxo-C12-HSL、3-oxo-C14-HSL、3-hydroxy-C14-HSL、0.05 mmol/mL 的C8-HSL、3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C10-HSL、3-hydroxy-C12-HSL作為底物, 測定 QsdARH5的酶活。

比活力測定 比活力單位為(U/mg)。通過考馬斯亮藍法G-250試劑測定樣品酶液中的蛋白含量, 同時在最適溫度下測得重組酶的酶活, 由此得到酶的比活。

2 結(jié)果

2.1 QsdA-RH5目的基因的獲得及序列分析

從紅球菌BFXJ-1中克隆得到一個小于1000 bp的目的條帶, 經(jīng)過Vector NTI 7和NCBI軟件分析,該目的基因全長972 bp, 編碼一個由323氨基酸殘基及一個終止密碼子組成的蛋白質(zhì), 其理論分子量為35.73 kD, 推測的等電點為4.71, 用SignalP軟件預(yù)測該蛋白沒有信號肽序列。序列分析表明, QsdA-RH5屬于 PTE 超家族, 并與紅球菌(R. erythropolis) SK121 (ZP_04385486.1)的同源性最高,序列相似性為 100%, 與其他來源于紅球菌的 N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶相比同源性在80%以上。

2.2 QsdA-RH5的表達與純化

QsdA-RH5經(jīng)誘導(dǎo)表達后測定的酶活力8.50 U/mL, 略高于紅球菌活化后經(jīng)超聲破碎液測定的酶活力6.43 U/mL。由圖1所示, 經(jīng)過Ni-NTA柱純化后在SDS-PAGE中可以看到在35 kD (其中包括重組的His標簽)處得到一條純度大于90%的目的蛋白, 與預(yù)測的理論分子量一致。將目的條帶進行質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)分析后得到與推測蛋白序列一致的10個肽段(VLMHEHVFVLGEELRQNYPDY PEPWDEEVR, GISTIVDPTVIGLGR, EGIAGTGVR, CAIEEPGLTPGVER, FGLEPFLSFEDRVNTVVEMAR, MVLAHDASCFIDYFPSAARE, VALPNWNYTHISD DVIPALLER和 AMLVDNPR)。以C7-HSL為信號分子測定純化后的QsdA-RH5的比活力為292.83 U/mg。

圖1 SDS-PAGE驗證QsdA-RH5在大腸桿菌中的表達Fig. 1 SDS-PAGE gel of recombinant QsdA-RH5 from E. coli BL21 (DE3)

2.3 QsdA-RH5的酶學(xué)性質(zhì)研究

pH及溫度的測定 QsdA-RH5的最適pH為8.0, 在 pH 7.0—8.0內(nèi)保持 80%以上的酶活力(圖2A)。QsdA-RH5在pH 4.0—12.0間都很穩(wěn)定, 可以保持80%以上的酶活(圖2B); QsdA-RH5的最適溫度為35℃, 在20—35℃內(nèi)酶活力保持80%以上(圖2C); QsdA-RH5在70℃保溫20min后剩余酶活力為60%左右。(圖2D)。

金屬離子及相關(guān)化學(xué)試劑的抗性 在添加1 mmol/L的金屬離子時 Co2+、Mg2+、Ni2+、Zn2+和Mn2+可增強QsdA-RH5酶的活力, 在添加10 mmol/L的金屬離子時 Mg2+、Ni2+、Na+和 Mn2+可增強QsdA-RH5酶的活力, 而 Cr3+、Cu2+、Zn2+、Fe3+可抑制酶的活力, 其中 Ag+、β-巰基乙醇和SDS在添加不同的金屬離子濃度下都對酶活力具有抑制作用(表1) 。

QsdA-RH5的動力學(xué)測定 QsdA-RH5動力學(xué)的測定結(jié)果為 Vmax= 0.25 nmol/(mg·min), Km= 0.0125 mnom/L。

QsdA-RH5的底物特異性測定 QsdA-RH5底物特異性測定結(jié)果(表 2)。QsdA-RH5能夠降解C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL和C12-HSL。而對C14-HSL、3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C10-HSL、3-oxo-C12-HSL、3-oxo-C14-HSL、3-H-C12-HSL和3-H-C14-HSL的降解效果不明顯。與紅球菌(R. erythropolis)W2具有廣譜的底物特異性不同[29], QsdA-RH5 具有較為專一的降解底物譜, 只對沒有取代基團的底物具有水解作用, 這與文獻報道的另一株紅球菌PI33相似[38]。

3 討論

水產(chǎn)養(yǎng)殖細菌性病害(G–細菌病原占致病病因90%以上, 其中嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila占 60%以上)嚴重制約著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)化發(fā)展與無公害水產(chǎn)品輸出。針對水產(chǎn)養(yǎng)殖細菌性病害無抗防治的技術(shù)瓶頸, 立足于飼用阻斷策略, 挖掘具有飼用潛力的N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶制劑, 對于構(gòu)建基于群體感應(yīng)調(diào)控機制的水產(chǎn)養(yǎng)殖細菌性病害無抗防治體系具有重要意義。

圖2 QsdA-RH5溫度與pH的測定Fig. 2 Physical parameters that affected QsdA-RH5 activity

表1 金屬離子及相關(guān)化學(xué)試劑的抗性Tab. 1 Effects of metal ions and chemicals on QsdA-RH5 activity

表2 QsdA-RH5降解AHLs的活力Tab. 2 The hydrolytic ability of QsdA-RH5 to AHLs

本研究報道的QsdA-RH5經(jīng)氨基酸序列比對結(jié)果表明與Livnat Afriat等[39]報道的紅球菌來源的磷脂酶AhlA氨基酸序列一致, 都屬于PTE超家族, 該超家族最早被認為是對各種有機磷化合物具有催化水解作用的一類酶[29,40], 近年來越來越多的文獻報道 PTE超家族的酶具有?；饷富蛘呤?N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶活性[29,41]。文本報道的QsdA-RH5在Livnat Afriat等報道的AhlA基礎(chǔ)上, 完善了酶學(xué)性質(zhì)的研究。例如Livnat Afriat等只對Mn2+、Zn2+、Co2+三種金屬離子進行了研究, 而本文分析了17種飼料及養(yǎng)殖環(huán)境中存在的金屬離子; 在底物特異性分析中本文重點分析了14種AHLs類信號分子, 而Livnat Afriat等只是選取了其中4種AHL類信號分子; 本文還分析了QsdA-RH5的pH、溫度、比活力等相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì), 這些在 Livnat Afriat報道的文章中未作深入的研究。因此本文更全面的研究了該酶的酶學(xué)性質(zhì), 為深入、全面評估該酶作為水產(chǎn)飼用酶制劑的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。同時 Livnat Afriat等[39]報道, AhlA在添加二價金屬離子的時可以促進其內(nèi)酯酶活力, 尤其添加 Zn2+后效果尤為顯著。但本文報道的N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶QsdA-RH5卻是添加Mn2+后對酶活力具有最明顯的促進效果。以及Livnat Afriat等[39]報道對oxo-C8-HSL具有降解效果,而本文報道的QsdA-RH5卻對oxo-C8-HSL降解效果不明顯。對此研究結(jié)果存在的差異, 我們推測是因為采用的表達載體不同或者測定時樣品的處理方法不同造成的差異, 需進一步深入研究。

此外本研究報道的QsdA-RH5與其他來源于PTE超家族的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶相比具有相似的最適溫度及最適pH, 同時二價陽離子是決定酶活力的關(guān)鍵因素。但與其他來源于PTE超家族的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶相比 QsdA-RH5表現(xiàn)出了更為專一的底物降解能力, 其專一的水解在3位碳原子上沒有取代基團的信號分子。

近年來隨著群體感應(yīng)研究的深入, N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的研究也越來越多, 越來越細致。這其中也有許多文獻報道了來源不同細菌的 N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶酶學(xué)性質(zhì)評估情況, 其中包括AidC、AiiM、QsdH、AiiA-AI96、AiiA SS10、AiiAB546與AiiA 240B1等[31—34,2,7,27]。

不同細菌來源的 N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶其酶學(xué)性質(zhì)上也存在一些異同。我們將本研究中報道的QsdA-RH5與其他的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的酶學(xué)性質(zhì)對比發(fā)現(xiàn), 這些N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的最適溫度一般在20—40℃內(nèi)。最適pH為8.0, QsdA-RH5的熱穩(wěn)定性好于AidC、AiiA SS10及AiiA 240B1[7,41,31],但與AiiA-AI96在80°C保溫30min后酶活力70%以上相比要較差一些[33]。此外QsdA-RH5對金屬離子 Mg2+、Mn2+、Ni2+與Zn2+的抗性要好于AidC和AiiA-AI96[7,33], 添加Mn2+可以顯著的提高酶活力。與其他的所有 N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶相比QsdA-RH5最大的特點是具有較為專一的降解底物譜。綜上所述, QsdA-RH5具有適宜水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境作用的 pH (pH7.0—8.0)及溫度(20—40℃); 具有良好的 pH穩(wěn)定性及溫度穩(wěn)定性, 可減少其在飼料生產(chǎn)中對酶活力效價的損失; 對多種水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境及飼料中存在的金屬離子具有良好的抗性, 尤其是對Cu2+等環(huán)境中存在較多的金屬離子具有較強的抗性,即為其作為潛在的水產(chǎn)飼用酶制劑提供基礎(chǔ)保障;對底物具有較為專一的降解譜, 可用于預(yù)防特定的細菌性病原菌的致病性而不會對微生態(tài)環(huán)境造成太大的影響; 綜合以上酶學(xué)性質(zhì)評估表明, QsdA-RH5具有飼用酶制劑的應(yīng)用潛力, 是一個極具潛力的生防制劑。

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AN ANALYSIS OF THE POTENTIAL FOR AQUACULTURE OF N-ACYL HOMOSERINE LACTONASE FROM RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS BFXJ-1

ZHANG Mei-Chao1, YANG Ya-Lin1, SONG Shui-Shan2, XU Li1, YAO Bin1and ZHOU Zhi-Gang1
(1. Key Laboratory for Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture, Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2. Institute of Biology, Hehei Academy of Sciences, Shijiazhuan 050081, China)

The objective of this study was supplement to determine the enzymatic properties of QsdA-like AHLases and evaluate their application potentials. The gene qsda-rh5 was amplified from the Rhodococcus erythropolis BLJF-1genomevia PCR technique. After the recombinant vector pET28a/qsda-rh5 was transformed into E. coli BL21 (DE3), transformants with N-acyl-homoserine lactonase activity were screened. The purified QsdA-RH5 was obtained with Ni-NTA column. Both N-acyl-homoserine lactonase activities of QsdA-RH5 were additional characterized. The results showed that an AHL lactonase gene, qsda-rh5, of 972 base pairs, was identified from Rhodococcus erythropolis BFXJ-1. Deduced QsdA-RH5 was a metallo dependent hydrolase belonging to Phosphotriesterase (PTE) superfamily. Recombinant QsdA-RH5 was successfully expressed in Escherichia coli BL21 and purified to electrophoretic homogeneity. The enzyme maintained≥80% of its activity at 10–40℃, pH 8.0. QsdA-RH5 had significant resistance toproteolytic digestion. Interestingly the enzyme conferred the ability to inactivate AHLs with an acyl chain lengths ranging from six to twelve carbon atoms, without substitution at carbon three. We were the expression and characteristics of the QsdA-RH5, indicate the QsdA-RH5 has specificity of substrate. These properties make QsdA-RH5 an outstanding quorum-quenching tool for environment.

Rhodococcus erythropolis; N-acyl homoserine lactonase; Recombinant expression; Enzymatic characteristics

S963.7

A

1000-3207(2015)03-0540-09

10.7541/2015.71

2014-02-28;

2014-12-01

“十二五”國家科技支撐計劃項目 (2012 BAD2 5 B02、2013BAD10B01-2); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市鱘魚鱒魚創(chuàng)新團隊(SCGWZJ 20141104-4)資助

張美超(1985—), 女, 吉林德惠人; 碩士; 研究方向為水產(chǎn)生物安全酶制劑。E-mail: mei_chao_zhang@163.com

周志剛(1974—), 男, 研究員, 博士生導(dǎo)師; 研究方向為魚類消化微生物。Fax: +86-010-82106073; E-mail: zhou_zg@msn.com