基于GABA A受體評估雙氟沙星對異育銀鯽的安全性

趙依妮孫 琪,胡 鯤楊先樂阮記明周愛玲

(1. 上海海洋大學(xué)國家水生動物病原庫, 上海 201306; 2. 上海黛龍生物科技工程有限公司, 上海 201306)

基于GABA A受體評估雙氟沙星對異育銀鯽的安全性

趙依妮1孫 琪1,2胡 鯤1楊先樂1阮記明1周愛玲1

(1. 上海海洋大學(xué)國家水生動物病原庫, 上海 201306; 2. 上海黛龍生物科技工程有限公司, 上海 201306)

神經(jīng)傳遞的興奮和抑制的相互平衡是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的必要條件, 其中抑制性則是由最重要的神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸 (GABA) 調(diào)節(jié)的, 而GABA則主要通過GABA A受體GABAAR起作用。A型受體是一種跨膜門控氯離子通道, 可介導(dǎo)階段性的抑制突觸傳遞, 也可強(qiáng)直性抑制外周突觸傳遞, 因此在神經(jīng)性疾病如焦慮和癲癇的病理生理學(xué)中起著至關(guān)重要的作用[1]。刺激GABA的分泌, 增加其與GABA A受體的結(jié)合將抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮, 導(dǎo)致抑郁等消極情緒的產(chǎn)生; 相反, 抑制GABA的分泌, 減少其與GABA A受體的結(jié)合可刺激中樞神經(jīng)興奮, 導(dǎo)致癲癇等疾病的產(chǎn)生[2]。喹諾酮類藥物是人工合成的含 4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥物, 其抑菌機(jī)理主要是對細(xì)菌DNA回旋酶 (DNA gyrase) 具有選擇性抑制作用[3]。喹諾酮類藥物分為四代, 目前臨床應(yīng)用較多的為第三代喹諾酮類藥物, 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常用的有雙氟沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星等。其中, 雙氟沙星 (Difloxacin, DIF) 抗菌活性高, 對革蘭氏陽性和陰性菌及多種厭氧菌都有較強(qiáng)的抗菌作用[4], 且雙氟沙星質(zhì)量穩(wěn)定、口服吸收性好、體內(nèi)濃度高、半衰期長且與其他抗菌藥物無交叉耐藥性, 因而在水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的防治中得到廣泛使用[5]。而在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中, 對細(xì)菌、寄生蟲等靶病原用藥時, 藥物給養(yǎng)殖動物帶來副作用是不可避免的。隨著DIF應(yīng)用的越來越廣泛, 導(dǎo)致水產(chǎn)動物不良反應(yīng)的發(fā)生也越來越頻繁[6]。目前在脊椎動物體內(nèi)的研究表明,喹諾酮類藥物產(chǎn)生的不良反應(yīng)主要發(fā)生在消化系統(tǒng), 而神經(jīng)系統(tǒng)是即消化系統(tǒng)后第二大不良反應(yīng)作用部位[7]。研究發(fā)現(xiàn)大部分含有親脂性氟原子的氟喹諾酮類藥物可透過血腦屏障進(jìn)入腦組織, 通過抑制GABA與GABA A受體的結(jié)合, 從而使得中樞神經(jīng)興奮性增加[7]。大鼠 (Rattus norvegicus) 動脈灌注培氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氟羅沙星和司帕沙星等氟喹諾酮類藥物后, 在其大腦組織中可以檢測到相應(yīng)藥物的存在[8]。最近, 阮記明等[9]的研究表明DIF可透過異育銀鯽 (Carassais auratus gibebiol) 腦血屏障, 且 DIF在大腦內(nèi)的消除緩慢, 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成的影響具有持久性。DIF等喹諾酮類藥物所造成的不良反應(yīng)主要包括頭暈、焦慮、恐懼感等, 而魚類、蝦蟹等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過度興奮將導(dǎo)致魚類急游、耗氧量增加, 死亡率也隨之增加。目前, 有關(guān)GABA受體在水產(chǎn)動物領(lǐng)域的研究較少, 其研究仍主要集中在癲癇病治療藥物、抗抑郁等神經(jīng)藥物和農(nóng)用殺蟲劑的創(chuàng)新與研制等方面[10—13]。

國內(nèi)有關(guān)藥物分子毒理學(xué)的研究工作剛剛起步, 且以藥物受體研究藥物安全性具有針對性、特異性的優(yōu)勢,因此本研究以GABA A受體作為檢測指標(biāo), 從分子水平反映 DIF對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的毒性, 從而評估其藥物安全性, 促進(jìn)GABA受體在藥物安全性檢測中的應(yīng)用。GABA A受體由五個亞基組裝而成, 目前已發(fā)現(xiàn)的亞基共有 19種 (α1-6、β1-3、γ1-3、δ、ε、π、θ、ρ1-3 ), 其中, γ2亞基是GABA A受體主要的功能性亞基之一[14], 且84%的GABA A受體包含γ2亞基[15,16]。同時免疫沉淀實驗表明γ2亞基可以同α1、α2、α3、α5、α6、β2、β3、γ3和δ 等亞基共同組裝; 此外, γ2亞基也為氯離子通道正常導(dǎo)電所必需[17]。因此, 我們選取異育銀鯽GABA A受體的γ2亞基作為檢測指標(biāo), 為GABA A受體作為藥物安全性評估指標(biāo)提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

實驗動物及DIF處理 健康的異育銀鯽購買于江蘇省南通某國營農(nóng)場, 體重 (61±5.5) g。用2% NaCl浸泡10min, 然后放置于高錳酸鉀消毒后的水族箱 ( 100 cm × 80 cm × 80 cm ) 內(nèi)暫養(yǎng)2周, 飼喂普通顆粒飼料。試驗期間使用自動控溫系統(tǒng)控制水溫為 (20±2)℃, 24h充氣, 2d換一次水。以4尾未灌藥的異育銀鯽作為空白對照組, 其組織也用于GABA A 受體γ2 亞基mRNA 及蛋白組織特異性表達(dá)分析, 所取組織包括腦、肝、腎、心、肌肉、腸、皮、性腺。按20 mg/Kg 魚體重標(biāo)準(zhǔn)口灌鹽酸雙氟沙星原料藥溶解液, 分別于給藥后 1h、3h、6h、12h、24h、48h、96h 各取異育銀鯽4尾, 分別取腦、肝、腎、肌、性腺。組織樣品用液氮迅速冷卻, 儲存在–70℃條件下, 用于轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的檢測。

主要試劑和儀器 Trizol試劑 (美國Invitrogen 公司), 反轉(zhuǎn)錄酶、Ex Taq DNA聚合酶 (日本TaKara 公司), iQTMSYBR GREEN Supermix (美國 Bio-Rad 公司), 引物、AXYGEN柱式凝膠回收試劑盒、AXYGEN小量質(zhì)粒提取試劑盒 (上海生工生物有限公司), BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA強(qiáng)裂解液、6×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量、考馬斯亮藍(lán)染液、顯影液和定影液購自碧云天生物科技有限公司; 兔抗GABAAR γ2多克隆抗體(一抗)(美國 Sigma-Aldrich公司); 兔抗β-actin多克隆抗體(內(nèi)參一抗)(武漢博士德生物有限公司); ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海威奧生物有限公司); PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)(美國 Bio-Rad 公司), 濾紙(北京索萊寶生物有限公司)。PCR儀為 eppendof Mastercycle Gradient, 核酸測定儀為 eppendof Biophotomter,實時定量PCR儀為BIO-RAD Mini Optica, 165—8001 小型垂直電泳儀 (美國 Bio-Rad 公司); 半干轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad 公司); 溫控?fù)u床、脫色搖床(美國 Thermo公司)。

1.2 實驗方法

總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 分離異育銀鯽腦、肝、腎、心臟、前腸、表皮、肌肉和性腺, 按Trizol法提取總RNA。采用紫外分光光度計與1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度及完整性, –80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肕-MLV反轉(zhuǎn)錄cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)條件按照試劑盒推薦體系進(jìn)行。

引物設(shè)計、基因片段的克隆及測序 應(yīng)用 Primer Premier 5.0軟件, 根據(jù) GeneBank發(fā)表的斑馬魚 (NM_ 001256250.1) GABA A受體的γ2亞基序列設(shè)計一對特異性引物 F1&R1(表 1), 引物由上海生工生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件按照試劑盒推薦體系進(jìn)行。1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴(kuò)增產(chǎn)物, 按瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒操作說明純化回收特異性擴(kuò)增產(chǎn)物, 并連接至pMD19-T vector 載體, 將鏈接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5, 通過藍(lán)白斑篩選和菌落PCR初步鑒定后, 陽性菌落于 37℃震蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒后將鑒定為陽性的克隆送上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測序。

表1 本文所用引物Tab. 1 Sequences of primers used in the study

GABA A受體γ2 亞基mRNA表達(dá)分析 以獲得的基因序列為模板, 利用 Primer Primer 5.0 軟件設(shè)計一對γ2 亞基特異引物F2 & R2 (表 1), 對不同組織(腦、肝、腎、心、肌肉、腸、皮、性腺)及雙氟沙星處理后腦、肝、腎、肌肉和性腺中 γ2 亞基 mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測, 并以β-actin 為內(nèi)參基因, 所用特異性引物F3 & R3見表1。采用iQTMSYBR GREEN Supermix (Bio-Rad) 進(jìn)行實時定量RCR, 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件按照試劑盒推薦體系進(jìn)行。用內(nèi)參 β-actin對各樣品的 Ct值進(jìn)行均一化處理, 采用2–ΔΔCt確定不同樣品mRNA的相對含量[18]。

GABA A受體γ2亞基蛋白表達(dá)分析 采用Western blot法對不同組織(腦、肝、腎、心、肌肉、腸、皮、性腺)及雙氟沙星處理后腦、肝、腎、肌肉和性腺中 γ2 亞基蛋白的表達(dá)量進(jìn)行檢測, 并以β-actin 為內(nèi)參基因。具體方法為: 按照每20 mg組織加入200 μL裂解液的比例加入裂解液。在勻漿機(jī)中研磨, 直至裂解液中組織塊消失。放在4℃靜置30min充分裂解, 并每隔10min強(qiáng)烈振蕩一次。充分裂解后, 4℃、12000 r/min離心20min, 取上清。提取組織總蛋白后, 采用 Brandford法(考馬斯亮藍(lán)結(jié)合顯色法)蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。將上樣液于100℃的PCR儀中煮沸10min, 使蛋白變性, 并制備11% 分離膠和4% 積層膠, 加電泳緩沖液后上樣電泳。電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜上。脫脂奶粉封閉膜后分別加入兔抗GABAAR γ2多克隆抗體 (1∶200)和兔抗 β-actin (1∶2000)孵育 2h,洗膜, 再加入用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2000), 37℃搖床上孵育 2h。洗膜后膜轉(zhuǎn)入ECL 超敏化學(xué)發(fā)光試劑(試劑 A∶試劑 B＝1∶1)顯色液中反應(yīng)2min, 取出膜, 甩去多余的液體, 用保鮮膜包好PVDF膜, 暗室中用X膠片感光、顯影、定影。將Western blot的膠片置于凝膠成像儀中用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測、照相, 顯影結(jié)果用Quantity One V4.6.2軟件(美國Bio-rad公司)對蛋白質(zhì)條帶灰度進(jìn)行半定量分析處理, 結(jié)果用GABAAR γ2蛋白目的條帶與 β-actin條帶的灰度值比值表示GABAAR蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度(GABAAR γ2/β-actin)。

1.3 統(tǒng)計方法

用Excel統(tǒng)計數(shù)據(jù), SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析, 以 P＜0.01 (差異極顯著), 0.01＜P＜0.05 (差異顯著), P＞0.05 (差異不顯著) 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn), 差異顯著時采用LSD法對各組平均樣之間進(jìn)行多重比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (Mean±SD)表示, 當(dāng)P＜0.05時, 差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 GABA A受體γ2亞基mRNA的組織表達(dá)分析

熒光定量PCR結(jié)果顯示, 異育銀鯽GABA A受體γ2亞基和內(nèi)參的實時熒光定量PCR擴(kuò)增曲線指數(shù)增長明顯,溶解曲線均為單一峰, 擴(kuò)增效率 E值均接近 1.0, 分別為97.3和 98.3, 表明此條件下目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率一致, 適合作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。此外, 4個平行加樣孔之間擴(kuò)增結(jié)果偏差不顯著, 說明此條件下擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件良好。熒光定量檢測γ2 亞基在異育銀鯽各組織中的表達(dá)情況, 以β-actin 為內(nèi)參基因, 結(jié)果顯示, GABA A受體γ2 亞基在腦、肝、腎、心、肌肉、腸、皮、性腺中均有表達(dá)。其中尤以腦組織中含量最高, 性腺和肝臟次之,前腸中表達(dá)水平相對較低, 而在腎臟、肌肉、心臟、表皮中的表達(dá)量最低。統(tǒng)計學(xué)分析顯示GABA A受體γ2 亞基mRNA在各組織間表達(dá)量差異顯著 (P＜0.05) (圖 1)。

2.2 GABA A受體γ2亞基蛋白的組織表達(dá)分析

Western blot結(jié)果顯示(圖2), β-actin蛋白在各組織中的表達(dá)無明顯差異; 以β-actin為內(nèi)參分析GABA A受體γ2亞基蛋白的表達(dá), 可見GABA A受體γ2亞基蛋白在各組織中均有表達(dá), 其中尤以腦中的含量最多, 性腺次之,肝臟、腎臟、前腸、肌肉、心臟表達(dá)水平依次降低, 在皮中表達(dá)量最低。統(tǒng)計學(xué)分析顯示GABA A受體γ2亞基蛋白在各組織間表達(dá)量差異顯著 (P＜0.05) (表2 )。

圖1 異育銀鯽GABA A受體γ2亞基基因在各組織中的表達(dá)情況Fig. 1 Expression of GABA A receptor γ2 subunit gene in different Carassais auratus gibebiol tissues

表2 各組織GABA A受體γ2亞基蛋白相對表達(dá)(光密度比值)Tab. 2 The relative protein expression of GABA A receptor γ2 subunit (n=4, x ± s)

圖2 異育銀鯽各組織GABA A受體γ2亞基蛋白表達(dá)情況Fig. 2 The protein expression of GABA A receptor γ2 subunit in different tissues of Carassais auratus gibebiol

2.3 DIF對GABA A 受體γ2 亞基mRNA和蛋白表達(dá)的影響

實時熒光定量PCR結(jié)果 (圖3) 和Western blot結(jié)果(圖5) 顯示, DIF可明顯抑制異育銀鯽GABA A受體γ2亞基 mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá), 與各組織的空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。相比于轉(zhuǎn)錄水平的迅速降低, 蛋白表達(dá)水平的降低具有一定的滯后性, 這主要是因為基因到蛋白表達(dá)需通過一系列復(fù)雜的反應(yīng)才得以實現(xiàn)的緣故。

圖3 異育銀鯽GABA A受體γ2亞基在DIF作用下mRNA表達(dá)情況Fig. 3 The Expression of GABA A receptor γ2 subunit gene in Carassais auratus gibebiol after DIF challenge

圖4 異育銀鯽GABA A受體γ2亞基在DIF作用下腦組織內(nèi)mRNA表達(dá)情況Fig. 4 The Expression of GABA A receptor γ2 subunit gene in brain of Carassais auratus gibebiol after DIF challenge

3 討論

3.1 GABA A受體γ2亞基的組織表達(dá)特征

運(yùn)用實時定量PCR和Western Blot檢測GABA A受體γ2 亞基mRNA和蛋白在異育銀鯽腦、肝、腎、心臟、肌肉、前腸、表皮和性腺 8個組織中的表達(dá), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)GABA A受體γ2 亞基在各組織中均有表達(dá), 且在腦組織中其基因水平和蛋白水平的表達(dá)量顯著高于其他組織(P＜0.05), 這與GABA A受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)調(diào)節(jié)遞質(zhì)γ-氨基丁酸 (GABA) 的主要受體相符合[13,15]。Pirker等[19], H?rtnagl等[20]的研究發(fā)現(xiàn)GABA A受體γ2 亞基在老鼠和家鼠體內(nèi)也主要分布于腦組織, 且主要集中于海馬區(qū)、皮層和小腦等區(qū)域。此外, GABA A受體γ2 亞基的基因和蛋白在性腺中也具有一個較高表達(dá)水平, Praphaporn Stewart等[21]發(fā)現(xiàn)GABA A受體在耳鮑幼體發(fā)育過程中的含量明顯增加, 因此, 我們推測GABA A受體除了神經(jīng)調(diào)節(jié)功能外, 還將參與異育銀鯽生殖及幼體發(fā)育過程。

圖5 異育銀鯽GABA A受體γ2亞基在DIF作用下蛋白表達(dá)情況Fig. 5 The protein expression of GABA A receptor γ2 subunit in Carassais auratus gibebiol after DIF challenge

3.2 DIF對異育銀鯽GABA A受體表達(dá)量的影響

與各組織空白對照相比, DIF可明顯抑制 GABA A受體 mRNA和蛋白的表達(dá), 對異育銀鯽各組織存在一定的神經(jīng)毒性 (圖3、圖5)。另外, 在DIF用藥組實驗中, 我們選取了7個時間點, 分析藥物代謝過程中GABA A受體在各組織中的變化情況, 結(jié)果表明藥物在體內(nèi)濃度越高GABA A 受體的含量越低, 隨著 DIF被魚體不斷代謝, GABA A 受體的含量逐漸回升趨于正常值 (圖3、圖5),這說明GABA A受體表達(dá)量與DIF在魚體內(nèi)的含量成負(fù)相關(guān), 可利用GABA A受體在組織中的表達(dá)量來推測DIF在魚體不同組織中的含量。

腎臟中GABA A受體mRNA含量在第12h出現(xiàn)二次回落, 肝臟在第24h出現(xiàn)二次回落, 說明DIF在腎臟、肝臟中的含量出現(xiàn)再次回升, 可能是因為 DIF在異育銀鯽體內(nèi)存在肝腸循環(huán)所致。這與章海鑫等[5]、阮記明等[22]的研究結(jié)果DIF在異育銀鯽體內(nèi)的藥時曲線均形成“多峰現(xiàn)象”相一致。

圖3中腦組織受DIF影響后GABA A受體表達(dá)模式的變化同其他組織基本一致, 然由于 GABA A受體mRNA在腦組織中的初始表達(dá)量是肝臟、腎臟等外周組織的 2萬 至 20萬倍, 因此我們以腦組織空白對照組GABA A受體原始表達(dá)量為基準(zhǔn), 單獨構(gòu)建了腦組織用藥后mRNA表達(dá)量變化圖 (圖4), 結(jié)果表明用DIF處理后, 腦組織中GABA A受體mRNA表達(dá)量降低程度相對更大, 因此DIF對腦組織中GABA A受體含量的抑制效果最顯著, 說明 DIF對水產(chǎn)動物所造成的神經(jīng)毒性作用在腦組織中最顯著, 與前人研究結(jié)果相符[3,6,7]。同時, 相關(guān)研究顯示, γ2亞基表達(dá)量的降低將導(dǎo)致生物體神經(jīng)性死亡[23,24], 因此 DIF對水產(chǎn)動物所造成的神經(jīng)毒性是不可忽視的。

本研究還發(fā)現(xiàn), DIF對腦組織中GABA A受體含量的影響具有持久性, 恢復(fù)到原有水平需經(jīng)過一段較長的代謝周期 (圖3、圖4), 阮記明等[9]的研究表明DIF可透過異育銀鯽腦血屏障, 且正是由于血腦屏障的存在, 導(dǎo)致DIF在腦中的消除半衰期最長, 到試驗第 960h, 大腦組織中DIF 含量較肝臟、腎臟和肌肉中最高。

4 展望

異育銀鯽經(jīng)DIF處理后, 所有檢測組織中GABA A受體 mRNA和蛋白表達(dá)量的影響均有明顯降低, 表明DIF對異育銀鯽各組織器官均有一定的神經(jīng)毒性作用,然尤以腦組織中含量變化最明顯即神經(jīng)毒性最顯著。同時,進(jìn)一步的實驗表明, 隨著DIF被魚體不斷代謝, GABA A受體的含量逐漸回升, 并趨于正常值, 即魚體內(nèi)DIF含量與GABA A 受體含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本實驗說明GABA A受體作為雙氟沙星神經(jīng)毒性的評估指標(biāo)是可行的, 并為后期GABA A受體在氟-喹諾酮類藥物對水產(chǎn)動物神經(jīng)毒性的評估提供理論及實驗基礎(chǔ), 從而在分子水平上體現(xiàn)藥物對水生動物神經(jīng)系統(tǒng)的影響。

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SAFETY EVALUATION OF DIFLOXACIN ON CARASSAIS AURATUS GIBEBIOL BASED ON GABA A RECEPTOR

ZHAO Yi-Ni1, SUN Qi1,2, HU Kun1, YANG Xian-Le1, RUAN Ji-Ming1and ZHOU Ai-Ling1
(1. State Collection Center of Aquatic Pathogen, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Shanghai Delon Biological Technology Engineering Co., LTD, Shanghai 201306, China)

異育銀鯽; GABA A受體γ2亞基; 克隆; 組織分布; 雙氟沙星; 安全性

Carassais auratus gibebiol; GABA A receptor γ2 subunit; Clone; Tissue distribution; Difloxacin; Safety

S948

A

1000-3207(2015)03-0598-06

10.7541/2015.78

2014-05-06;

2014-10-05

國家科學(xué)自然基金“魚類GABA受體與漁藥安全性評價的研究”(31172430); 公益性農(nóng)業(yè)行業(yè)專項項目“漁藥使用風(fēng)險評估及其控制技術(shù)研究與示范”(201203085); 863項目“魚蝦用疫苗與藥物研究開發(fā)”(2011AA10A216)資助

趙依妮(1992—), 女, 安徽合肥人; 在讀碩士研究生; 主要研究方向為魚類藥物受體, 藥物代謝動力學(xué)。E-mail: zhaoyini21@126.com

楊先樂, E-mail: xlyang@shou.edu.cn