反義miR-224對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

駱 萍 石冬梅 邱 楊 鐘曉鳴

MicroRNAs(miRNA)是1種大小約為21～25個(gè)堿基的非編碼單鏈小分子RNA，是一類新的基因調(diào)節(jié)子，其在控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、新生血管形成和凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮著非常重要的作用［1］。研究已經(jīng)證實(shí)miR-224在多種惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)［2-8］，然而miR-224在乳腺癌中的表達(dá)及功能研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用TagMan MGB探針法檢測(cè)miR-224在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，同時(shí)利用反義寡核酸技術(shù)(antisense oligonucleotide，ASO)抑制 miR-224在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，分析miR-224對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2013年10月至2014年06月江西省腫瘤醫(yī)院和南昌市第三醫(yī)院乳腺外科乳腺癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織手術(shù)標(biāo)本120份。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，均為女性，年齡28～62歲，患者術(shù)前均未接受放化療。

1.2 主要試劑和儀器

乳腺癌MCF-7細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存;TaqMan miRNA分析試劑盒(美國(guó)ABI公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)、胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)、脂質(zhì)體Lipfectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司);反義miR-224寡核苷酸(miR-224 ASO)(大連寶生物公司);Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基公司);總蛋白提取試劑盒(碧云天);鼠抗人Bcl-2單克隆抗體(美國(guó)santa cruz公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀(美國(guó)ABI公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-224的表達(dá) 采用Trizol試劑提取腫瘤組織及對(duì)照組織中總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，-80℃保存，運(yùn)用miR-224檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-224的表達(dá)。首先取2 μg總RNA為反應(yīng)模板與3 μl逆轉(zhuǎn)錄酶相互混合，反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件為:16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，收集cDNA，將其稀釋150倍，然后取1 μl稀釋的cDNA與 2 μl TaqMan引物相混合，20 μl反應(yīng)體系:95 ℃ 10 min，隨后95 ℃ 15 s，59℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。相對(duì)miRNA表達(dá)采用ct值精確計(jì)算，將U6 snRNA作為內(nèi)參。

1.3.2 反義miR-224單核苷酸序列設(shè)計(jì) MiRBase提供的miRNA基因序列獲取人miR-224的序列，并設(shè)計(jì)其反義寡核苷酸序列，同時(shí)運(yùn)用核酸序列數(shù)據(jù)庫檢索程序以排除其它的同源序列。另外，同時(shí)設(shè)計(jì)一條隨機(jī)對(duì)照序列，如下所示:miR-224 sense:5＇AGUCACUAGUGGUUCCGUUUA 3＇，反義 miR-224 antisense:5 ＇TAAACGGAACCACTAGTGACT 3＇，隨機(jī)序列 sense:5＇UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3 ＇，antisense:5 ＇ACGUGACACGUUCGGAGAATT 3＇，送 Invitrogen 公司合成，PAGE純化，全硫代修飾。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)和反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染 將MCF-7乳腺癌細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。嚴(yán)格遵照Lipfectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作程序進(jìn)行轉(zhuǎn)染，反義miR-224寡核苷酸終濃度分別為:50 nmol/L、100 nmol/L，150 nmol/L，200 nmol/L，本實(shí)驗(yàn)組前期初步篩選出最佳終干擾濃度為100 nmol/L。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時(shí)間分別為24 h、48 h、72 h，初步篩出最佳作用時(shí)間為48 h。將熒光對(duì)照的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后放置于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，上述操作重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染效率(88.5%±6.4)%。

1.3.4 轉(zhuǎn)染miR-224 ASO后對(duì)miR-224表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染 miR-224 ASO與對(duì)照 ASO 48 h后，提取總RNA，測(cè)定濃度，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA(反應(yīng)條件同1.2.1)，測(cè)定cDNA濃度。運(yùn)用miR-224檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-224的表達(dá)(具體條件同1.2.1)。上述操作重復(fù)3次。

1.3.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞的增殖 乳腺癌MCF-7細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用含3%胰蛋白酶消化細(xì)胞。接種于6孔培養(yǎng)板中，大約500～600個(gè)細(xì)胞/孔，置37 ℃、5%CO2，飽和濕度的條件下，培養(yǎng)2～3周。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆細(xì)胞團(tuán)時(shí)，終止培養(yǎng)。移去上清液，運(yùn)用PBS漂洗2次。加甲醇固定20 min，去除固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染30 min，用ddH2O清洗染色液，經(jīng)干燥后在顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。上述操作重復(fù)3次。

1.3.6 MTT檢測(cè)MCF-7細(xì)胞增殖情況 收集MCF-7細(xì)胞，將各組細(xì)胞懸液在離心管內(nèi)反復(fù)充分打勻，接種于96孔培養(yǎng)板(6×103/孔)，24 h后換液。實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4，每組設(shè)有6個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后1 d～4 d每孔加入 MTT 試劑(濃度為 5 mg/mL)20 μL，在 5%CO2、37℃條件下繼續(xù)孵育4 h。用移液器吸取各孔上清，加入DMSO 150 μL/孔，在室溫條件下?lián)u10 min(置水平搖床)以充分完全溶解MTT結(jié)晶。測(cè)定各孔吸光值(波長(zhǎng)490 nm)。每組重復(fù)3次。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%):細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 =(實(shí)驗(yàn)組平均A490-對(duì)照組平均A490)/對(duì)照組平均A490×100%。上述操作重復(fù)3次。

1.3.7 活體內(nèi)檢測(cè)miR-224 ASO對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響 將20只(4～5周齡)裸鼠(上海斯萊克公司)飼養(yǎng)于SPF無菌環(huán)境下。MCF-7細(xì)胞在濃度為300 μg/ml的G418抗生素條件下，篩選出穩(wěn)定克隆對(duì)照ASO或miR-224 ASO的U2-OS細(xì)胞株，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞(約2～ ×106個(gè))制成150 μl細(xì)胞懸液，運(yùn)用微量注射器接種于裸鼠左側(cè)大腿背部皮下。成瘤后定期測(cè)量腫瘤的大小，并運(yùn)用公式(V=D×d2×π/6)(D，d分別代表腫瘤的最大直徑和最小直徑)計(jì)算腫瘤的體積［6］，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。飼養(yǎng)6周后處死裸鼠，取瘤稱重。經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋、HE染色后，在光鏡下觀察腫瘤組織的病理學(xué)特征。

1.3.8 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞早期凋亡 實(shí)驗(yàn)分組同1.3.4，將細(xì)胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染反義miR-224寡核苷酸。經(jīng)48 h后收集細(xì)胞并制備為單細(xì)胞懸液，采用PBS漂洗2次，離心、棄上清。最后運(yùn)用Annexin V-FITC早期凋亡試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的早期凋亡情況。上述操作重復(fù)3次。

1.3.9 檢測(cè)各組細(xì)胞Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平 各組培養(yǎng)細(xì)胞加入Trizol裂解液，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用SYBR Green Real Time PCR Master Mix通過熒光定量PCR方法檢測(cè)Bcl-2的mRNA表達(dá)。Bcl-2的引物序列為上游:5＇-AACTGGGG GAGGATTGTGGC-3＇;下游:5 ＇-GATCCAGGTGTGCAGGTGCC-3 ＇。反 應(yīng)條件:95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參。在ABI7500反應(yīng)平臺(tái)上進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3.10 檢測(cè)各組細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染miR-224 ASO的MCF-7細(xì)胞，運(yùn)用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，將膜放在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中37℃封閉2 h，加一抗稀釋液1∶500稀釋鼠抗人Bcl-2單克隆抗體在4℃孵育過夜，1×TBST緩沖液洗膜10 min×3次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，置于37℃孵育2 h，1×BST緩沖液洗膜10 min×3次，應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白條帶，以βactin作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中miR-224的表達(dá)情況

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)120例乳腺癌患者的癌組織及癌旁組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn):69.17%(83/120)的乳腺癌組織miR-224表達(dá)水平明顯高于相對(duì)應(yīng)的正常癌旁組織的，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)(圖1)。

圖1 癌組織及癌旁組織中miR-224的表達(dá)

2.2 降低miR-224的表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞存活率的影響

轉(zhuǎn)染miR-224 ASO后，通過熒光定量PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-224的相對(duì)表達(dá)量(0.09±0.01)較對(duì)照組(0.50 ±0.07)明顯降低(P=0.00)(圖 2A)。同時(shí)MTT檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染miR-224 ASO后組細(xì)胞生長(zhǎng)較對(duì)照組明顯降低，其24 h、48 h和96 h的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為:53.57%、59.13%和 70.08%，兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2B)。

2.3 降低miR-224的表達(dá)對(duì)體外MCF-7細(xì)胞增殖的影響

觀察克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):miR-224ASO經(jīng)轉(zhuǎn)染后，MCF-7細(xì)胞克隆形成率［(5.33±0.74)%］較對(duì)照組［(33.33 ±8.38)%］有明顯降低(P=0.00)。

2.4 降低miR-224的表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

乳腺癌細(xì)胞MCF-7轉(zhuǎn)染miR-224 ASO后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示:MCF-7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-224 ASO 后，凋亡指數(shù)(15.68±1.46)增加明顯，而對(duì)照組ASO轉(zhuǎn)染后凋亡指數(shù)(3.36±0.88)無明顯變化(P=0.02)(圖3)。

2.5 降低miR-224的表達(dá)對(duì)Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

miR-224 ASO轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后，應(yīng)用熒光定量PCR和western blot檢查各組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-224 ASO組Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平［(1.05 ±0.04)和(0.21±0.03)］明顯低于對(duì)照 ASO 轉(zhuǎn)染組［(4.87±0.96)和(0.88 ±0.09)］，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00，P=0.00(圖4)。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-224 ASO后MCF-7細(xì)胞miR-224的表達(dá)和生長(zhǎng)情況變化

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-224 ASO轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞凋亡情況

圖4 Bcl-2 mRNA和蛋白在轉(zhuǎn)染miR-224 ASO的MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.6 降低miR-224的表達(dá)對(duì)活體腫瘤增殖的影響

本實(shí)驗(yàn)所有的裸鼠腫瘤成瘤率為100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-224ASO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組的腫瘤生長(zhǎng)速度較對(duì)照組明顯減慢，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)(圖5)。

3 討論

圖5 活體內(nèi)miR-224ASO轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞所形成腫瘤的體積變化

乳腺癌是危害婦女生命健康的主要疾病，近年來在我國(guó)特別是一些大城市和沿海經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，其發(fā)病率呈迅速上升趨勢(shì)，近年來乳腺癌的防治水平取得了較大的進(jìn)步，其主要?dú)w功于早期發(fā)現(xiàn)和診斷的成功及綜合治療的發(fā)展。miRNAs是一類新的基因調(diào)控因子，在控制細(xì)胞的增殖、凋亡等過程中發(fā)揮著十分重要的作用。miRNA通過與靶mRNA的3＇非編碼區(qū)近乎完全互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平使其降解，或者與之不完全互補(bǔ)結(jié)合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。近年隨著miRNAs研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)miRNAs與惡性腫瘤關(guān)系密切，一些miRNA可能通過調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡直接參與腫瘤形成，另一些可能通過靶定癌基因或抑癌基因而對(duì)腫瘤發(fā)生進(jìn)行調(diào)控。因此，miRNAs可能成為診斷腫瘤的新的分子標(biāo)志和判斷腫瘤治療及預(yù)后的分子靶點(diǎn)，而且miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，這更有助于惡性腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療，也為乳腺癌的早期診治提供了新的希望。

最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-224在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Shen等［9］檢測(cè)了miR-224在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，且與分期、組織學(xué)分級(jí)、HPV感染、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征顯著相關(guān)，因此認(rèn)為，miR-224是一個(gè)獨(dú)立的宮頸癌的預(yù)后指標(biāo)。另有研究報(bào)道，miR-224在結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中也表達(dá)失調(diào)，且與腫瘤的臨床分期、病理分級(jí)密切相關(guān)，提示miR-224與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［10-11］。關(guān)于miR-224表達(dá)異常的研究在肝癌中報(bào)道較多。Murakami等［12］首次報(bào)道 miR-224在肝癌呈過表達(dá);向邦德等［13］發(fā)現(xiàn)miR 224的表達(dá)與癌組織表達(dá)量呈正相關(guān)，故血漿miR 224有可能作為1種新的血清學(xué)指標(biāo)用于肝癌診斷。另有報(bào)道，在肝癌細(xì)胞中miR-224是其中一個(gè)最普遍上調(diào)miRNA，且miR-224在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)增加肝癌細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞遷移和侵襲［14-15］。MA 等［16］研究結(jié)果表明，miR-224 作為致癌基因在肝癌細(xì)胞中可能通過PPP2R1B激活A(yù)KT信號(hào)通路，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，因此可能在肝癌發(fā)生和發(fā)展過程中的扮演著致癌作用。但miR-224在乳腺癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制目前還不清楚。本實(shí)驗(yàn)首先利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)臨床乳腺癌標(biāo)本和對(duì)應(yīng)的正常癌旁組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-224在腫瘤組織中相對(duì)于對(duì)應(yīng)的正常癌旁組織呈明顯高表達(dá)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為進(jìn)一步了解miR-224對(duì)乳腺癌細(xì)胞功能的影響，本實(shí)驗(yàn)首先通過轉(zhuǎn)染miR-224 ASO降低乳腺癌細(xì)胞MCF-7中miR-224的表達(dá)，同時(shí)利用MTT方法檢測(cè)降低miR-224的表達(dá)后MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-224 ASO的MCF-7細(xì)胞存活率較轉(zhuǎn)染前明顯降低。同時(shí)運(yùn)用克隆形成實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-224 ASO后，MCF-7細(xì)胞克隆形成率比對(duì)照ASO組明顯減少。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)在活體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-224 ASO組MCF-7細(xì)胞皮下形成腫瘤的體積減小較對(duì)照ASO組顯著減小，兩者差異別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-224在乳腺癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)中起著重要作用。

此外，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-224 ASO組細(xì)胞凋亡較對(duì)照組明顯增加。眾所周知，Bcl-2是細(xì)胞凋亡調(diào)控基因，為了進(jìn)一步找出miR-224表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡情況的調(diào)控機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)miR-224 ASO組和對(duì)照組Bcl-2的mRNA和蛋白變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-224 ASO組Bcl-2 mRNA和蛋白水平較對(duì)照組明顯降低。這表明miR-224可能通過對(duì)Bcl-2表達(dá)的調(diào)節(jié)來調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而達(dá)到對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的調(diào)控。

綜上所述，miR-224不但在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，而且在調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡方面也起著重要作用，很可能成為為乳腺癌診治的一個(gè)新的癌前標(biāo)記物和臨床基因治療的新靶點(diǎn)。但其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

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