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    4種東北食用菌內生菌的分離和純化

    2015-02-27 01:46:12范冬茹張德巖高智濤王丹麗
    中國林副特產(chǎn) 2015年5期
    關鍵詞:猴頭菇黑木耳研磨

    范冬茹,張德巖,高智濤,王丹麗

    (伊春林業(yè)科學院,黑龍江伊春153000)

    4種東北食用菌內生菌的分離和純化

    范冬茹,張德巖,高智濤,王丹麗

    (伊春林業(yè)科學院,黑龍江伊春153000)

    從黑木耳、猴頭菇、元蘑、榛蘑中分離內生菌,共得到內生真菌7株,內生細菌13株,其中革蘭氏陰性菌7株,革蘭氏陽性菌6株。猴頭菇未分離出內生菌。研磨法為最適分離方法。NB培養(yǎng)基上分離出的內生菌較多,而用來分離內生真菌的PDA培養(yǎng)基僅分離出2株內生真菌,表明其營養(yǎng)成分不適于內生真菌的生長。

    食用菌;內生菌;研磨法

    從植物中分離內生菌是獲得新的天然產(chǎn)物及開發(fā)新藥的潛在資源,對植物內生菌的研究,具有重大的意義和開發(fā)價值。近年來,從蔬菜、花卉、藥用植物等多種植物中分離到了大量內生菌,但在現(xiàn)有的報道中,對食用菌內生菌的研究較少。本實驗以元蘑、榛蘑、猴頭菇和伊春地區(qū)產(chǎn)量豐富的黑木耳為研究對象,分離和培養(yǎng)內生菌,開發(fā)新的微生物資源。

    1 實驗材料與方法

    1.1 材料

    黑木耳、猴頭菇采摘于烏馬河區(qū)為人工栽培種。元蘑、榛蘑采摘于紅星區(qū)為野生生長菌株。實驗對象要求為無霉爛、蟲蛀、新鮮的子實體,其中黑木耳應選取背部無筋脈的厚實耳片。

    1.2 培養(yǎng)基

    用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NB)分離、培養(yǎng)內生細菌;用葡萄糖馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)分離、培養(yǎng)內生真菌。培養(yǎng)基采用濕熱滅菌法滅菌,高壓蒸汽滅菌器121℃,維持20min。

    1.3 方法

    本實驗將子實體滅菌之后采用組織分離法、研磨法、印跡法3種方法分離內分菌。在內生菌分離過程中,同時設置超凈工作臺無菌狀態(tài)檢測、漂洗液檢驗法、組織印跡法3種對照處理,以確保準確分離食用菌內生菌。具體操作方法如下:

    1.3.1 子實體滅菌。在內生菌分離之前,在超凈工作臺內不同位置放置5個敞開蓋子的PDA培養(yǎng)基,做超凈工作臺無菌狀態(tài)檢測。取新鮮的食用菌,無菌水沖洗5min,濾紙吸干表面水分后,用無菌水沖洗2次,75%乙醇浸泡3min,用無菌水沖洗3次,再用3%NaClO浸泡3min,用無菌水沖洗4次。將處理過的子實體壓入PDA培養(yǎng)基中,使子實體與PDA培養(yǎng)基接觸20min,移去子實體,做組織印跡法對照。把最后一遍漂洗子實體的無菌水,涂布于PDA培養(yǎng)基上,做漂洗液檢驗法對照。所有對照平板經(jīng)28℃培養(yǎng)7天后,不得檢出任何雜菌。

    1.3.2 內生菌分離

    1.3.2.1 印跡法:用無菌解剖刀將滅菌后的食用菌表皮去掉,將內部組織切割成0.5cm的小塊,接于NB和PDA培養(yǎng)基上,并用鑷子稍稍用力按壓,然后將組織塊取出。

    1.3.2.2 組織分離法:將取出的組織快接于NB和PDA培養(yǎng)基上。

    1.3.3.3 研磨法:另取組織塊轉入研缽中,加入適量滅菌過的石英砂和無菌水進行研磨,靜止一段時間后,取上清液在NB和PDA上涂布。

    每種方法3個平行。NB培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)24h,PDA培養(yǎng)基于28℃恒溫培養(yǎng)72h。純化,斜面保存菌種。

    1.4 統(tǒng)計與鑒別

    比較不同分離方法對食用菌內生菌的分離效果。觀察內生菌的菌落形態(tài),通過革蘭氏染色對分離到的內生細菌形態(tài)進行觀察、鑒別。

    2 結果與分析

    2.1 不同分離方法對食用菌內生菌的分離情況

    本實驗用3種方法對黑木耳、猴頭菇、元磨、榛蘑4種食用菌的內生菌進行分離。具體內生菌的分離數(shù)量見表1。

    表1 不同分離方法對4種食用菌內生菌的分離結果

    注:“-”表示未分離到食用菌內生菌

    由表1可以看出,研磨法分離得到15株內生菌,組織分離法得到4株內生菌,印跡法分離得到1株內生菌,研磨法的分離效果最好。同時可以看出從榛蘑中分離出的內生菌數(shù)量最多,元磨、黑木耳次之。而猴頭中并未得到內生菌,可能因其子實體被菌刺覆蓋,消毒液沿菌刺進入子實體內部,而影響內生菌的分離。

    2.2 不同培養(yǎng)基對食用菌內生菌的分離情況

    NB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基分離內生細菌和內生真菌的情況見表2。

    表2 不同培養(yǎng)基對4種食用菌內生菌的分離結果

    由表2可以看出,NB培養(yǎng)基對內生菌的分離效果較好,分離出內生真菌5株,內生細菌9株。PDA培養(yǎng)基分離得到2株內生真菌,4株內生細菌。本次實驗中共分離得到7株內生真菌,13株內

    生細菌。

    2.3 內生細菌的菌落特征及細胞形態(tài)

    本次實驗對內生細菌的菌落特征進行描述,并通過革蘭氏染色在顯微鏡下進行觀察,詳見表3。

    表3 內生細菌菌落特征和細胞形態(tài)

    3 結論

    植物內生菌能產(chǎn)生許多生物活性物質,往往具有抑制病原菌、協(xié)助宿主抵抗病原菌和促進宿主植物生長的作用。本實驗對黑木耳、猴頭菇、元蘑、榛蘑的內生菌進行初步分離,共得到內生真菌7株,內生細菌13株,其中革蘭氏陰性菌7株,革蘭氏陽性菌6株。猴頭菇未分離出內生菌,可能是培養(yǎng)基不適或消毒液濃度過高的原因。3種分離內生菌的方法中,研磨法能使內生菌最大可能地釋放出來,分離出的內生菌數(shù)量最多,為最適分離方法。NB培養(yǎng)基上分離出的內生菌較多,而用來分離內生真菌的PDA培養(yǎng)基僅分離出2株內生真菌,可能是其營養(yǎng)成分不適于內生真菌的生長。

    內生細菌菌數(shù)顯微鏡下觀察圖

    [1]劉麗娟,郝芳芳.白鮮內生菌分離與培養(yǎng)[J].廣西農(nóng)業(yè)科學,2012(20):149-150.

    [2]張敏星,張靈枝,周游,等. 茶樹內生菌的分離和純化[J].中國茶業(yè),2011(12):12-13.

    [3]劉麗娟,賈金如,王洪偉. 紫丁香內生菌分離與培養(yǎng)[J].農(nóng)村經(jīng)濟與科技,2014(10):39-40.

    2015-08-03

    范冬茹(1987-),女,助理工程師,主要從事食用菌研究工作,E-mail:124950629@qq.com。

    S759.81

    A

    DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.05.013

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