補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞周期影響的實(shí)驗(yàn)研究*

?

實(shí)驗(yàn)研究

補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞周期影響的實(shí)驗(yàn)研究*

河北省中醫(yī)院口腔科(石家莊 050011)

高毅刁志虹△李敏王彥敏△△穆春暉△△△何源王雙雙李立芳

提要目的：觀察補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1細(xì)胞)增殖活性及細(xì)胞周期變化的影響，探討該方劑治療牙周炎的作用機(jī)理。方法：MC3T3-E1 細(xì)胞分別于5%、10%、15%、20%補(bǔ)腎活血固齒方含藥血清，10%無(wú)藥血清，10%胎牛血清中培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h，MTT法檢測(cè)補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的影響。另外MC3T3-E1 細(xì)胞分別于10%補(bǔ)腎活血固齒方含藥血清、無(wú)藥血清、胎牛血清中培養(yǎng)24、48、72 h，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)該方劑對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。結(jié)果：含藥血清與胎牛血清、無(wú)藥血清組相比，MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞周期差異無(wú)顯著性(P>0.05)。結(jié)論：補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞周期無(wú)影響，其可能是通過(guò)促進(jìn)該細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化、促進(jìn)牙槽骨的再生而發(fā)揮藥物作用。

關(guān)鍵詞補(bǔ)腎活血固齒方；牙周炎；小鼠顱頂前成骨細(xì)胞；MTT；增殖活性；作用機(jī)理；細(xì)胞周期

Empirical Study on effect of Kidney-tonifying Blood-activating and

Tooth-astringing Formula on Multiplication Activity and Cell

Cycle of Mice Calvaria Preosteoblasts

Stomatological Department of Hebei TCM Hospital (Shijiazhuang 050011)

GAOYiDIAOZhi-hongLIMinWANGYan-minMUChun-huiHEYuanWANGShuang-shuangLILi-fang

Abstract Objective: to observe the effect of Kidney-tonifying Blood-activating and Tooth-astringing Formula on MC3T3-E1 multiplication activity and the cell cycle, and to explore the functional mechanism of the formula in treating periodontitis. Methods: MC3T3-E1 were cultured respectively in formula serum of 5%, 10%, 15% and 20%, 10% pure serum, and 10% fetal bovine serum for 12, 24, 36, 48, 60 and 72 hours. MIT method was used to detect the effect of the formula on MC3T3-E1 multiplication activity. Besides, MC3T3-E1 were cultured respectively in 10% formula serum, pure serum and fetal bovine serum for 24, 48 and 72 hours, and the flow cytometer was used to detect the effect of the formula on the MC3T3-E1 cycle. Results: compared to pure serum and fetal bovine serum, there was no significant difference between MC3T3-E1 multiplication activities and the cell cycles in the formula serum (P>0.05). Conclusion: Kidney-tonifying Blood-activating and Tooth-astringing Formula has no effect on MC3T3-E1 multiplication activity and the cell cycle, but it may work by facilitating its osteoblast differentiation and promoting the alveolar bone regeneration.

Key words Kidney-tonifying Blood-activating and Tooth-astringing Formula; periodontitis; mouse calvaria preosteoblasts; MIT; multiplication activity; functional mechanism; cell cycle

牙周炎是口腔科的常見病，多發(fā)病，是導(dǎo)致成年人牙齒喪失的主要原因，不僅危害口腔健康，并可導(dǎo)致和誘發(fā)各種全身性疾病，嚴(yán)重影響人類的健康。我科多年來(lái)應(yīng)用補(bǔ)腎活血固齒方治療牙周炎，療效顯著，但其作用機(jī)理不明了。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用補(bǔ)腎活血固齒方含藥血清作用于小鼠顱頂前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1細(xì)胞)，觀察該方劑對(duì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，探討補(bǔ)腎活血固齒方治療牙周炎的作用機(jī)理。

*河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目：No.13277730D；河北省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目：No.2014028

△河北省石家莊市第一醫(yī)院口腔科

△△河北省石家莊市第三醫(yī)院口腔科

△△△北京市東城區(qū)第一人民醫(yī)院

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1試劑與儀器α-MEM培養(yǎng)基(GIBCO)，胎牛血清(PAA Laboraties GmbH)， 胰酶(Amresco)，EDTA(天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)公司)，葉酸(Amresco)， β-疏基乙醇(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，肌醇(北京索萊寶科技股份有限公司)，戊巴比妥(華北制藥有限公司股份)，Triton x-100(Solarbio)， MTT(BIOSHARP)，DMSO(Dimethyl Sulphoxide)，碘化丙錠(Sigma公司)。

HF240二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)，BSC-1100ⅡA2生物安全柜(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，TE2000-U熒光倒置顯微鏡(日本NiKon公司)，B40型醫(yī)用低速離心機(jī)(安新縣白洋離心機(jī)廠)，D-37520高速離心機(jī)(Thermo ELECTRON CORPORATION)，HKA-A2450-230精密電子天平(意大利BEL Engineering公司)Type354酶標(biāo)儀(Thermo ELECTRON CORPORATION )，SHAL水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市江南儀器)，EPICS XL 流式細(xì)胞儀(BECKMAN COULTER)

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康雄性SD系大鼠，280～300 g 20只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2008-1-033。飼養(yǎng)條件室溫保持在18℃～25℃，空氣流通，12 h維持光照，動(dòng)物在籠中自由攝食飲水。飼料由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3小鼠顱頂前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1細(xì)胞)的培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，吸去原培養(yǎng)液，PBS溶液清洗 2 遍，加入 0.25%胰酶 1 mL，37℃消化 1 min，加α-MEM培養(yǎng)基1.5 mL終止消化，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其懸浮，移至15 mL離心管，1 000 r/min離心5 min，吸去上清液，加入培養(yǎng)基4.5 mL，輕輕吹打，使管底細(xì)胞懸浮，均勻分散。取3個(gè)培養(yǎng)瓶，向每個(gè)培養(yǎng)瓶中滴入細(xì)胞懸液1.5 mL，3個(gè)培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，每3 d換液1次。培養(yǎng)5～6 d，細(xì)胞鋪滿瓶底 70%～80%時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4中藥成分及藥劑制備藥物組成：淫羊藿、補(bǔ)骨脂各15 g，熟地黃、當(dāng)歸、丹參、知母各10 g，甘草3 g。藥劑制備：藥物加10倍量蒸餾水煎煮1.5 h，過(guò)濾；加同量蒸餾水重煎1.5 h，過(guò)濾。合并濾液濃縮至150 mL，裝袋備用。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為3組：含藥血清組、無(wú)藥血清組、胎牛血清組。(1)含藥血清組血清來(lái)自10只280～300 g SD大鼠，按體表面積的方法折算人體等效計(jì)量，按4.875 g生藥/kg體質(zhì)量計(jì)算用藥量，每日灌胃2次，連續(xù)灌胃7 d，最后1 d第2次灌胃后間隔2 h再次灌胃，于末次給藥后1 h，1.2%戊巴比妥麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血。每只大鼠的血液置于不同離心管中，冷置1 h后，3 000 r/min離心20 min，將同組各只大鼠離心管中的上清液置于同一離心管中混合以減少不同大鼠的個(gè)體差異， 56℃滅活30 min，濾菌器抽濾除菌后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?2)無(wú)藥血清組大鼠等劑量生理鹽水灌胃，血清制備方法同前。(3)胎牛血清組的血清是直接購(gòu)買于PAA Laboraties GmbH。

2.2MTT法檢測(cè)補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的影響取一部分細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中48 h后，換用含藥血清組(分別含有5%、10%、15%、20%含藥血清)、胎牛血清組(含10%胎牛血清)、無(wú)藥血清組(含10%無(wú)藥血清)，每種血清設(shè)9個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h，分別于不同時(shí)間點(diǎn)的各孔中加入5 mg/mL MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸凈上清，每孔中加入75 μL DMSO，搖床震蕩15 min。酶聯(lián)免疫測(cè)試儀上測(cè)定492 nm波長(zhǎng)的每孔細(xì)胞OD值。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞細(xì)胞周期的影響將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，接種于50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每組接種15瓶，37℃ ，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。2 d后將原培養(yǎng)液吸出，PBS清洗2次，分別加入10%含藥血清、無(wú)藥血清、胎牛血清的培基培養(yǎng)細(xì)胞。收集培養(yǎng)24、48、72 h的細(xì)胞，PBS溶液清洗2遍。用0.25%的胰酶消化，離心沉淀，棄上清。緩慢加入預(yù)冷(保存于4°C)的70%乙醇固定細(xì)胞，充分混勻，4°C靜置30 min。上機(jī)前離心去除固定液，加入含1%RNA酶的碘化丙啶染色液1 mL，4℃避光染色30 min，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)。采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞各增殖周期時(shí)相的DNA百分含量，打印DNA含量分布組方圖，自動(dòng)擬合出細(xì)胞周期各時(shí)相比例,以增殖系數(shù)(PI)表示細(xì)胞分裂增殖情況。I=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。

3結(jié)果

3組細(xì)胞增值活性均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，含藥血清與胎牛血清、無(wú)藥血清組相比，MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性差異無(wú)顯著性(P>0.05)，詳見表1；含藥血清組、無(wú)藥血清組、胎牛血清組的PI值差異無(wú)顯著性(P>0.05)，詳見表2。表明補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞周期無(wú)影響。

表1　　不同血清組細(xì)胞活性　

表2　　補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞增殖指數(shù) (PI值)影響

4討論

牙周炎是侵犯牙齦和牙周支持組織的慢性破壞性疾病,在世界范圍內(nèi)有較高患病率,在我國(guó)更為突出,高達(dá)95%，[1]是致使成年人牙齒喪失的主要原因,并可導(dǎo)致或誘發(fā)全身性疾病,嚴(yán)重危害人類健康。牙周炎是一種病因及發(fā)病機(jī)理不明的感染性疾病，主要是致病菌和肌體反應(yīng)性。[2 ]本病相當(dāng)于中醫(yī)的“齒豁”，中醫(yī)認(rèn)為其病因病機(jī)可歸為脾胃濕熱、腎陰虧損或氣血不足。中醫(yī)辨證施治慢性牙周炎在臨床上療效確切，彌補(bǔ)了西醫(yī)主要針對(duì)細(xì)菌及局部因素治療的局限性。[3]李敏等將慢性牙周炎患者180例，隨機(jī)分為2組，治療組120例，對(duì)照組60例。對(duì)照組行牙周基礎(chǔ)治療，治療組在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上進(jìn)行辨證為脾胃濕熱型、腎陰虧損型、氣血不足型3型分別進(jìn)行治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱型占25.83%，腎陰虧損型占57.5%，氣血不足型占16.67%。治療組的總有效率為97%，對(duì)照組的總有效率為60%，治療組療效明顯優(yōu)于對(duì)照組，中西醫(yī)結(jié)合，辨證施治牙周炎，即改善消除局部病損，又調(diào)節(jié)全身狀況、標(biāo)本兼治，療效滿意。[4]

根治牙周炎的關(guān)鍵是能否阻止牙槽骨吸收或促進(jìn)牙槽骨再生。牙槽骨是人體骨骼中代謝最活躍的組織，[5]牙槽骨代謝的穩(wěn)定依賴于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡。因此治療牙周炎的藥物,無(wú)論治療機(jī)制如何,最終必須通過(guò)骨的微環(huán)境、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞而起調(diào)節(jié)作用。

細(xì)胞增殖是細(xì)胞的基本屬性，研究藥物對(duì)細(xì)胞的作用首先觀察其對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。成骨細(xì)胞的增殖表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量增加，形成多層細(xì)胞。典型的成骨細(xì)胞周期時(shí)間為20～24 h。[6]目前有關(guān)補(bǔ)腎中藥對(duì)成骨細(xì)胞增殖影響的研究結(jié)論不一。邵敏通過(guò)MTT法研究中藥骨康及其補(bǔ)腎、健脾、活血各成分的含藥血清對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)骨康血清能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,補(bǔ)腎成分血清也能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，健脾、活血各成分血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。[7]朱曉峰發(fā)現(xiàn)不同濃度(1 μmol/L、0.1 μmol/L和0.01 μmol/L)的淫羊藿素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖均無(wú)影響。[8]本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度補(bǔ)腎固齒方含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增值均無(wú)明顯影響；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖能力有所增加，但和胎牛血清、無(wú)藥血清相比差異無(wú)顯著性。

對(duì)成骨細(xì)胞增殖的調(diào)控即是對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控，細(xì)胞周期就是從細(xì)胞分裂產(chǎn)生的新細(xì)胞生長(zhǎng)開始到下一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞結(jié)束為止所經(jīng)歷的過(guò)程，主要分為G0、G1、S、G2及M期。處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞，DNA含量不同，處于G0和G1期的細(xì)胞含有二倍體量的DNA,處于S期的細(xì)胞含有從二倍體量至四倍體量的DNA,處于G2及M期的細(xì)胞含有四倍體量的DNA。利用熒光染料與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，通過(guò)流式檢測(cè)就能反映細(xì)胞內(nèi)DNA含量，區(qū)分細(xì)胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期，并由此得出可用來(lái)反映細(xì)胞增殖情況的增殖指數(shù)PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M) 。[9]PI值是指處于S期和G2/M期細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例，PI值越高，表明細(xì)胞增殖越活躍。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示含藥血清組的PI值與無(wú)藥血清組及胎牛血清組相比無(wú)明顯差異，提示我們補(bǔ)腎活血固齒方不是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖來(lái)促進(jìn)骨形成的，其可能是通過(guò)促進(jìn)該細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化、促進(jìn)牙槽骨的再生而發(fā)揮治療牙周炎藥物作用。

參考文獻(xiàn)

[1]曹采方.牙周病學(xué)[M]. 2版.北京:人民衛(wèi)生出版社, 2003.115

[2]李元聰.中西醫(yī)結(jié)合口腔科學(xué)[M] .北京 ：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2005.98

[3]李立芳，張勇. 中藥對(duì)牙周致病厭氧菌體外抑菌活性的研究[J]. 河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2008,23(4):30-31

[4]李敏 ，高毅，王競(jìng)超，等. 慢性牙周炎的中醫(yī)辨證施治臨床研究[J]. 河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2015,30(2):25-27

[5]曹采方.牙周病學(xué)[M]. 2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,

2003.35-83

[6]童安莉，陳璐璐，丁桂芝.成骨細(xì)胞骨形成機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，1999,5(3)：60-64

[7]邵敏，趙靜，王斌. 不同中藥含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2006，14(5):19-21

[8]朱曉峰，張榮華，孫升云.淫羊藿素通過(guò)雌激素受體和骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)誘導(dǎo)MC3T3-subclone14分化[J].中國(guó)病理生理雜志，2011,27(12):2 351-2 356

[9]陳朱波，曹雪濤.流式細(xì)胞術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2010.142-146

(2015-09-15收稿)

通訊作者：李敏，女，碩士。

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5615(2015)04-0001-04