青蒿-鱉甲藥對配伍對MRL/lpr狼瘡小鼠IL-6、IFN-γ分泌及狼瘡性腎炎病理改變的影響*

青蒿-鱉甲藥對配伍對MRL/lpr狼瘡小鼠IL-6、IFN-γ分泌及狼瘡性腎炎病理改變的影響*

摘要：目的：觀察青蒿-鱉甲藥對對MRL/lpr狼瘡模型小鼠相關(guān)免疫指標(biāo)及狼瘡性腎炎(lupus nephri-tis,LN)病理改變的影響，探索青蒿-鱉甲藥對對系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)的治療機(jī)理。方法：采用ELISA方法檢測小鼠血清中的IL-6、IFN-γ含量，對腎臟組織進(jìn)行HE常規(guī)染色及PAS、Masson特殊染色。結(jié)果：灌胃青篙-鱉甲藥對水煎液后，低、高劑量組MRL/lpr小鼠血清中的IL-6水平顯著低于正常對照組(P<0.05或P<0.01)；高劑量組血清中的IFN-γ水平與模型組相比，顯著下降(P<0.05)；高劑量組腎臟組織HE、PAS、Masson染色病理改變差異顯著。結(jié)論：青蒿-鱉甲藥對能抑制MRL/lpr小鼠血清中IL-6的生成，減少小鼠血清中IFN-γ的分泌，能明顯改善小鼠狼瘡性腎炎的病理狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：青蒿-鱉甲藥對；MRL/lpr小鼠；IL-6，IFN-γ；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；狼瘡性腎炎

青蒿苦辛而寒，其氣芳香，清中有透散之力，清熱透絡(luò)，引邪外出。歸肝、膽經(jīng)。功善清熱涼血、解暑除蒸，性寒而不傷脾胃，陰中有陽，降中有散。主肝腎三焦血分之病，適宜于SLE之腎精虧虛基礎(chǔ)上的熱毒為病。青蒿對免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用，青蒿素類藥物在低濃度時(shí)能增強(qiáng)免疫應(yīng)答，但在高濃度時(shí)表現(xiàn)出中等程度的免疫抑制作用，并觀察到青蒿素對分裂旺盛細(xì)胞具有抑制作用，用以防治SLE之細(xì)胞及體液免疫異常以及治療過程中易繼發(fā)感染[1-3]。鱉甲咸寒，直入陰分，滋陰退熱，入絡(luò)搜邪。鱉甲提取物能延緩疲勞的發(fā)生，也能加速疲勞的消除；鱉多糖能明顯提高小鼠耐缺氧能力和抗冷凍作用及抗疲勞作用，有助于提高機(jī)體的抗病抗感染能力；鱉甲超微細(xì)粉具有增加骨密度的功能，在提高股骨骨密度及股骨骨鈣含量方面優(yōu)于碳酸鈣[4]。青蒿與鱉甲配伍，滋陰退熱，內(nèi)清外透，使陰分伏熱有外達(dá)之機(jī)。具有透熱不傷陰，滋陰不礙邪作用。目前，對于青蒿、鱉甲各自的藥理研究及藥物成分研究較多，配伍研究較少，而且針對復(fù)方中核心藥對的系統(tǒng)性研究和對其作用規(guī)律的探究能夠更科學(xué)地指導(dǎo)臨床應(yīng)用，基于此，我們設(shè)計(jì)此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，通過觀察青蒿-鱉甲藥對對MRL/lpr狼瘡模型小鼠相關(guān)免疫指標(biāo)及狼瘡性腎炎病理改變的影響，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1動物C57BL/6小鼠12只，MRL/lpr狼瘡鼠36只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2012-0002，試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼料由浙江中醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2藥品青蒿、鱉甲生藥材由浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠提供。青蒿鱉甲配伍水煎液制備：取青蒿藥材200g、鱉甲藥材120g(青蒿-鱉甲配比5∶3)。將鱉甲打碎先煎，倒入砂鍋，加適量冷水，加蓋，先以武火，沸騰后文火煎0.5h；再加入青蒿，煎15min，倒出藥汁放水瓶中，再采用蒸發(fā)濃縮的方法煎至含生藥量0.5 g/mL濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3儀器HERAEUS臺式冷凍高速離心機(jī)，SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，Motic BA210正置生物顯微鏡。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)處理2月齡雄性MRL/lpr小鼠36只及2月齡雄性C57BL/6小鼠12只，隨機(jī)分為正常對照組(C57BL/6小鼠)、模型組及低、高劑量給藥組。正常對照組及模型組每日灌胃生理鹽水1次，0.5mL/只。低、高劑量組以相當(dāng)于正常成人每日用量5、10倍劑量給藥，分別為0.1，0.2mL/10g(水煎液)，每日1次。正常對照組、模型組及2個(gè)用藥組連續(xù)飼養(yǎng)用藥2個(gè)月。

2.2樣品采集采血前小鼠禁食12 h，眼球取血，收集血液3000 r離心15 min，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?；取適量腎臟組織，液氮保存，即刻存入。采血后將小鼠脫臼處死，迅速取出腎臟，固定于4%的甲醛溶液中。

2.3指標(biāo)檢測采用ELISA法測定各組小鼠血清IL-6、IFN-γ水平，檢測步驟按說明書進(jìn)行。

對腎臟石蠟切塊進(jìn)行常規(guī)HE染色和PAS、Masson特殊染色，觀察不同組別腎臟的病理改變。

3結(jié)果

3.1青蒿鱉甲藥對對MRL/lpr狼瘡鼠血中IL-6、IFN-γ水平的影響見表1。與模型組比較，低劑量組、高劑量組血清中IL-6和IFN-γ的含量有顯著性差異(P<0.05)。

表1青蒿鱉甲藥對對MRL/lpr狼瘡鼠血清

pg/mL

注：與正常對照組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與模型組比較，△P<0.05。

3.2青蒿鱉甲藥對對MRL/lpr狼瘡小鼠腎臟病理改變的影響青蒿鱉甲藥對對MRL/lpr狼瘡小鼠腎臟病理改變的影響以HE和PAS、Masson染色觀察小鼠腎組織的改變，光鏡下可見：正常對照組腎組織(見圖1～3)；模型組：腎小球系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞彌漫性重度增生，白細(xì)胞浸潤，系膜區(qū)及內(nèi)皮下大量嗜復(fù)紅蛋白沉積，節(jié)段性白金耳樣結(jié)構(gòu)形成，腎小管上皮細(xì)胞空泡及顆粒狀變性(見圖4～6)；低劑量給藥組：基本同模型組(見圖7～9)；高劑量給藥組：腎小球系膜細(xì)胞輕度增生，少數(shù)白細(xì)胞浸潤，伴少量嗜復(fù)紅蛋白沉積，無白金耳樣結(jié)構(gòu)形成，未見腎小管上皮細(xì)胞空泡及顆粒狀變性(見圖10～12)。

4討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種原因不明的自身免疫性疾病，以淋巴細(xì)胞異?；罨?、免疫調(diào)節(jié)功能紊亂和多種自身抗體過量產(chǎn)生為特征。SLE病情復(fù)雜多變，涉及全身多個(gè)臟器，其中，狼瘡性腎炎引起的腎功能衰竭是其主要死亡原因之一，而細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的改變是影響免疫調(diào)節(jié)的重要因素，包括IL-6和IFN-γ等影響因子。IL-6是一種具有多功能的細(xì)胞因子，它的異常表達(dá)和失調(diào)是某些免疫疾病的典型特征。研究表明，IL-6與IL-6受體結(jié)合后促進(jìn)B細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量的自身抗體，導(dǎo)致SLE的免疫損傷，而且系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中存在IL-6的明顯異常，與疾病活動性及腎損害有明顯相關(guān)性[5]。IFN-γ可促發(fā)SLE并加重SLE病情，IFN-γ除可作為SLE患者的診斷指標(biāo)外，還可以作為SLE患者病情活動程度和療效觀察的指標(biāo)[6-7]。因此，MRL/lpr狼瘡模型小鼠血清中IL-6、IFN-γ水平的檢測，是判定青蒿-鱉甲藥液對于狼瘡鼠病理狀態(tài)改善與否的比較準(zhǔn)確的指標(biāo)。

圖1～12　各組小鼠腎組織病理檢查

注：圖1～3分別為正常MRL/lpr小鼠腎組織(圖1 HE，光鏡×400；圖2 PAS，光鏡×400；圖3 Masson，光鏡×400)；圖4～6分別為模型組MRL/lpr小鼠腎組織的病理改變：腎小球系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞彌漫性重度增生，白細(xì)胞浸潤(圖4 HE，光鏡×400)；腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多(圖5 PAS，光鏡×400)；系膜區(qū)及內(nèi)皮下大量嗜復(fù)紅蛋白沉積，節(jié)段性白金耳樣結(jié)構(gòu)形成，腎小管上皮細(xì)胞空泡及顆粒狀變性(圖6 Masson光鏡×400)；圖7～9為低劑量給藥組MRL/lpr小鼠腎組織的病理改變，基本同模型組(圖7 HE，光鏡×400；圖8 PAS，光鏡×400；圖9 Masson光鏡×400)；圖10～12為高劑量給藥組MRL/lpr小鼠腎組織的病理改變：腎小球系膜細(xì)胞輕度增生，少數(shù)白細(xì)胞浸潤(圖10 HE，光鏡×400)；腎小球基底膜輕度增厚，系膜基質(zhì)輕度增多(圖11 PAS，光鏡×400)；有少量嗜復(fù)紅蛋白沉積，無白金耳樣結(jié)構(gòu)形成，未見腎小管上皮細(xì)胞空泡及顆粒狀變性(圖12 Masson光鏡×400)。

本研究以MRL/lpr小鼠血清中IL-6、IFN-γ水平變化作為藥物療效的指標(biāo)，分別按照低、高兩個(gè)劑量青蒿-鱉甲藥液給MRL/lpr小鼠連續(xù)灌服2個(gè)月，觀察不同劑量青蒿-鱉甲煎劑對狼瘡性腎炎的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中高劑量給藥組可明顯減輕狼瘡性腎炎的活動程度，改善狼瘡性腎炎的病理狀態(tài)。這與報(bào)道的青蒿素類能減低多種細(xì)胞因子，減少免疫損傷的結(jié)論一致[8]。同時(shí)，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IFN-γ在自身免疫性疾病中是造成病理性損害的主要原因之一[9]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低、高兩個(gè)劑量的青蒿-鱉甲藥液均能抑制小鼠血清中炎性因子IL-6的分泌，可明顯降低血清中IFN-γ的水平，從而減少了因自身免疫復(fù)合物的分泌而造成的病理性損害。青蒿-鱉甲藥對，作為復(fù)方中的核心藥對，彌補(bǔ)了單味藥治療疾病的不足，這為青蒿-鱉甲藥對更廣泛更科學(xué)的應(yīng)用于臨床提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of Qinghao-biejia Group on the Production of IL-6、IFN-γ and Pathologic Change of Lupus Nephritis in MRL/lpr Mice

GAN Jing, XIE Zhi-jun, SHAO Tie-juan, YAN Yu-ming, WEN Cheng-ping, CHEN Juan

ZhejiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou310053,China.

Abstract:Objective: To investigate the effect of Qinghao-biejia group on auto-antibody production and pathologic change of lupus nephritis in MRL/lpr mice and the possible mechanism of qinghao-biejia group in treating systemic lupus erythematosus(SLE).Methods: IL-6 and IFN-γ in serum of the MRL/lpr mice were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Renal tissue was stained by HE，PAS and Masson.Results: In the low and hight dose qinghao-biejia groups,as compared with the normal control group,the level of IL-6 was significantly lower(P<0.05,P<0.01);The level of IFN-γ was lower in the hight dose than in the model group(P<0.05);And renal pathological change was milder.Conclusion: qinghao-biejia group could inhibit the production of IL-6 and secretion of IFN-γ and improve the pathologic lesion of lupus nephritis in MRL/lpr mice.

Key words:Qinghao-biejia Group; MRL/lpr mice; IL-6; IFN-γ; Systemic Lupus Erythematosus; Lupus Nephritis

收稿日期：(2014-12-12)編輯：曾文雪

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

基金項(xiàng)目：*浙江省科技廳公益性應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013C37100)；國家自然科學(xué) (81273680、81173249)；2012年博士點(diǎn)基金新教師類項(xiàng)目(20123322120001)。

通信作者：★甘靜謝志軍邵鐵娟嚴(yán)余明溫成平陳娟*陳娟。Tel：18157141586，E-mail：164245882@qq.com。(浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院杭州 310053)