創(chuàng)傷性腦損傷動物模型的新進展

杜安妮綜述，石京山審校

（遵義醫(yī)學院藥理學教研室暨基礎藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州遵義563000）

創(chuàng)傷性腦損傷動物模型的新進展

杜安妮綜述，石京山審校

（遵義醫(yī)學院藥理學教研室暨基礎藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州遵義563000）

腦損傷；疾病模型，動物；實驗研究

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是指由外部機械力造成腦組織損傷，導致暫時或永久性認知、身體和心理功能障礙[1]。全球范圍內每年因TBI住院或死亡患者約為1 000萬[2]。TBI不是單一的病理生理機制，而是復雜的疾病過程，其是由初級及次級損傷造成結構破壞和功能障礙。主要的損傷發(fā)生在腦組織暴露于外力時對血管和軸突的破壞，如神經元軸突發(fā)生拉伸和撕裂。原發(fā)性腦損傷后幾分鐘至數(shù)月可演變?yōu)槔^發(fā)性腦損傷，導致腦細胞死亡、腦組織損傷，進而引起代謝紊亂。

在過去的幾十年中動物模型已發(fā)展到模擬人類TBI的各個方面，用于更好地了解TBI相關病理生理機制、探索有效的治療方法。然而，對動物TBI模型起效的神經保護藥物均在Ⅱ期或Ⅲ期臨床試驗中失敗?；谂R床前研究失敗的現(xiàn)況，急需重擬TBI動物模型和治療策略。在此，本文對現(xiàn)有TBI動物模型進行概述，以期進一步改進動物模型并深入認識TBI。

1 TBI動物模型

雖然大型動物更接近于人類生理狀態(tài)，但鼠類由于成本低、體積小、便于標準化測量等優(yōu)點，常用于TBI的研究。其中，5個模型應用廣泛，即液壓沖擊損傷（fluid percussion injury，F(xiàn)PI）、皮質撞擊損傷（cortical impact injury，CCI）、重物墜落損傷、爆炸傷及輕度TBI等。

1.1 FPI TBI模型在FPI模型中損傷是由擺錘的儲層流體活塞通過開顱產生流體壓力脈沖完整的硬膜，損傷集中在中線或橫向頂骨的前囟和人字縫間。敲擊產生微小位移并使腦組織變形，損傷嚴重程度取決于脈沖壓力強度。根據(jù)開顱位置，F(xiàn)PI模型可分為中線（集中在矢狀縫）、矢狀竇旁（中線小于3.5 mm處）和橫向模式（lateral fluid percussion injury，LFPI，中線大于3.5 mm處）。中線FPI最初是為貓和兔子使用而研制的TBI模型，也適用于大鼠，后改為嚙齒動物LFPI模型。FPI還用于貓、兔子、狗、羊、大鼠、小鼠[3]和豬等動物的TBI病理生理學和藥理學研究。LFPI模型是最廣泛使用的TBI動物模型之一，在大鼠中LFPI產生皮質挫裂傷和彌漫性皮層下（如海馬、丘腦）神經元損傷，其損傷12 h后發(fā)展為神經元缺失，損傷部位下方皮質挫傷數(shù)周后擴大至神經膠質細胞，并在傷后1年繼續(xù)擴大直至細胞死亡。LFPI產生的認知和神經行為缺陷常見于TBI患者，如運動、記憶困難等。而認知功能障礙和神經系統(tǒng)損傷見于持續(xù)1年多的重癥LFPI。

通過大鼠的開顱手術部位確定組織損傷程度和位置，以增加該模型的可靠性和可重復性。LFPI模型主要造成單邊皮質損傷，很少累及對側皮層和腦干，而中線、矢狀竇旁FPI模型導致雙側皮質與下腦干改變，其與直接軸向運動相關聯(lián)。FPI模型復制的臨床腦損傷無顱骨骨折。中、重度TBI患者往往與跨多個腦回的顱骨骨折和腦挫傷相關，該模型并不能反映這一特點。但FPI可復制顱內出血、腦腫脹和進行性灰質損傷，符合人類腦損傷的病理生理特點。為提高FPI模型的可重復性，有學者研發(fā)了一種微處理器控制的氣動工具。在這個新的裝置中沖擊壓力和停留時間可精確控制，從而減少了實驗誤差。雖然LFPI模型已經流行于研究TBI的神經細胞死亡機制，但在最近的FPI模型中更應值得注意的是彌漫性腦損傷[4]。

1.2 控制性CCI TBI模型CCI模型使用氣動或電磁沖擊裝置驅動剛性沖擊頭，破壞完整的硬腦膜，并模仿皮質組織損傷、急性硬膜下水腫、彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）、腦震蕩、血腦脊液屏障（bloodbrain barrier，BBB）功能障礙，甚至昏迷。其已應用在雪貂、大鼠、小鼠、豬和猴子等動物中。該模型的損傷是通過單側開顱沖擊傳遞到完整的硬腦膜最底層皮質，往往在前囟和人字縫間引起變形。有學者對CCI模型進行了全面的神經病理學評估認為，相關的損傷包括海馬和丘腦變性。與其他TBI模型比較，該模型的優(yōu)點在于改善了機械因素，如可以控制時間、速度和沖擊深度。因此，其比FPI模型的生物力學研究更為有效。CCI模型與涉及重力驅動設備的模型比較，減少了反彈傷害的風險。該模型的病理嚴重程度隨著皮質變形和沖擊速度增大，其損傷程度可根據(jù)具體實驗要求而調整。CCI產生的認知缺陷持續(xù)長達1年，可能與腦萎縮和腦血流量逐漸下降相關。其中，豬CCI模型可重現(xiàn)的損傷類似于人類腦損傷的病理特征。

1.3 重物墜落損傷TBI模型在重物墜落損傷模型中實驗動物暴露顱骨，重錘以重力為引導自由下落。創(chuàng)傷程度由重錘質量和高度調節(jié)，簡單實用，可行性強，但重復性較差。在Feeney′s（自由落體撞擊法）的重物下落實驗中重錘以自由落體方式撞擊完好的硬膜導致皮質挫傷。有學者采用校準的重物落體裝置致嚙齒動物閉合性顱腦損傷（closed head injury，CHI），實驗中大鼠頭放置于堅硬的平面上，重錘落下，沖擊傳遞到未受保護的顱骨正面，由此產生神經功能障礙和BBB破壞。該神經損傷與腦損傷嚴重程度密切相關。最近，在小鼠模型中通過磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）評估形態(tài)學變化的研究表明，神經元變性及小膠質細胞和星形膠質細胞激活可引發(fā)神經行為缺陷[5]，說明該模型與人類CHI的臨床情況相似[6]。

有學者研發(fā)了沖擊加速度模型（Marmarou模型），模仿人類DAI。在該模型中將麻醉大鼠平放在泡沫平臺上，由中線切口致顱骨外露，放置不銹鋼金屬片于前囟和人字縫間的頭骨中線，創(chuàng)傷裝置從指定高度通過有機玻璃的黃銅套管自由落下至金屬片產生沖擊。Marmarou模型引起雙向神經元軸突、樹突損傷及廣泛DAI，特別是在胼胝體、內囊、視束、大腦和小腦，并通過傳導束傳遞至腦干。這也導致運動和認知缺陷，如行走和記憶困難，類似于FPI和CCI。該模型易于操作，并能制造出由輕至重不同程度的損傷，廣泛應用于彌漫性腦損傷的研究。而DAI模型的缺點是重物下降可能導致可變性損傷。

以前可用的嚙齒動物CHI模型不能復制在交通意外和運動事故中的額葉損傷。由Marmarou沖擊加速度模型修改并研究出新的CHI動物模型，以重現(xiàn)這些損傷，稱之為Maryland模型。沖擊力施加到顱骨前部，并產生顱骨內大腦矢狀旋轉加速度。該動物模型的特征是不產生皮質挫傷、顱骨骨折和長時間的呼吸暫停，從而降低了實驗動物致死率，但可表現(xiàn)為點狀出血和DAI。其神經行為功能障礙表現(xiàn)為自發(fā)性空間探索能力降低，可持續(xù)超過1周，故該模型還需進一步研究。

1.4 爆炸傷TBI模型爆炸傷多由爆炸沖擊波造成，為闡明沖擊波對中樞神經系統(tǒng)的損傷，爆炸傷TBI的各種動物模型已建立，主要應用于嚙齒類動物[7-8]和豬[9]。使用壓縮氣體驅動激波管模擬爆炸效果，評估生理、病理及神經行為，同時，計算模型動物急性致死率。結果表明，激波管生成的爆炸傷導致部分TBI大鼠發(fā)生低血壓或低氧血癥，這可能與爆炸引起的肺損傷及出血有關。Reneer等[10]模擬了輕微爆炸傷TBI大鼠模型。非打擊式爆炸傷，其特征是彌漫性腦水腫和延遲性腦血管痙攣，DAI出現(xiàn)于最初2周[11]。Kuehn等[12]發(fā)現(xiàn)，頭部暴露于嚴重爆炸沖擊波容易使人產生顯著神經功能障礙，并導致認知缺陷。有研究表明，爆炸傷導致小鼠腦內TAU蛋白磷酸化、髓鞘軸突病變、微血管病變、慢性神經炎癥和組織損傷。但應注意的是，動物距離激波管的放置（即內、外側或出口附近）決定了損傷嚴重程度和致死率[13]。大多數(shù)可用的爆炸傷模型側重于組織的破壞而非功能缺損[14]。即使是輕微的爆炸致腦損傷也會引起小鼠長期的行為和運動異常，其中包括空間記憶障礙、運動協(xié)調受損和行為缺陷[15]。因此，進一步設計相關標準的爆炸傷TBI模型是闡明爆炸致腦損傷機制的重點。

1.5 輕度TBI模型美國每年有170多萬例輕度TBI[16]，其通常發(fā)生于接觸性運動，如拳擊、曲棍球、足球等。有研究表明，反復腦震蕩會造成累積性長期行為障礙和神經病理學改變[16-17]。Kane等[18]修改了Marmarou沖擊加速度模型，重復沖擊輕度麻醉的小鼠頭部。該法無需頭皮切口，小鼠幾乎不會出現(xiàn)癲癇和癱瘓癥狀，而出現(xiàn)顱骨骨折和顱內出血也十分罕見；運動協(xié)調和功能輕微缺陷，一段時間后可自行恢復。小部分星形膠質細胞活化和磷酸化TAU蛋白水平增加不會破壞BBB、誘發(fā)水腫和激活小膠質細胞。這種新的動物模型適用于輕度腦震蕩的新藥篩選治療。大鼠單一的LFPI誘導其產生短期的行為和病理變化[19]，而反復的輕度LFPI導致長期累積的行為障礙、神經炎癥和皮質神經元缺損[20]。在沒有行為障礙的TBI大鼠模型中輕度腦震蕩會引起急性神經炎癥[21]。對動物模型的研究表明，輕度TBI短期內具有致命性，且與反復腦震蕩患者的研究結果一致。這些模型為進一步觀察輕度TBI提供了依據(jù)。

2 動物模型的局限性

2.1 生理差異的局限性在大腦結構和功能上非人類哺乳動物（特別是嚙齒動物）與人類大腦存在顯著差異，包括大腦幾何形狀、腦脊髓組成、腦回復雜性及白灰質比等。這些結構特點可能會導致創(chuàng)傷在不同物種間所造成的反應、嚴重程度或類型各不相同。

TBI后的動物和人類均在性別上存在較大差異，女性較男性腦損傷后并發(fā)癥發(fā)生率較低。動物實驗研究表明，雌性激素可能具有神經保護作用[22]。目前的臨床治療也證明雌、孕激素可促進TBI患者神經功能的恢復。除性激素外，男、女之間存在諸多差別，如對腦功能和代謝產生的影響。由于大多數(shù)TBI模型均使用雄性動物進行研究，并不涉及雌性動物，因此，針對TBI及其治療的性別差異研究顯得尤為重要。許多研究TBI模型者不嚴格計算包括二氧化碳分壓、氧分壓、pH值、血壓和大腦溫度等生理參數(shù)，而這些參數(shù)對確定病理生理反應、損傷和治療是非常重要的。事實上，這正是TBI研究領域的缺陷之一，故應加強對這些參數(shù)在急性和長期實驗中的檢測。

2.2 長期與短期實驗的局限性迄今為止，大多數(shù)TBI動物模型的研究主要集中于短期存活時間上，很少延伸超過1個月。在早期損傷后組織學和行為學結果無法為長期實驗提供有效支撐，不能用于評價臨床治療的長期療效。要驗證早期變化是否可預測長期結果，研究長期（傷后3個月至1年）損傷的反應和功能障礙是必要的。一些研究表明，長期功能和結構變化發(fā)生在傷后1年，治療窗不限于TBI后的前幾個小時，并可能遠遠超過該時期。延誤治療可能會錯過TBI患者早期的神經保護治療窗，如在TBI發(fā)生24 h后[23]，神經修復的延遲治療也可改善其功能恢復。

在TBI的嚙齒類動物模型中檢測長期行為缺陷，認知缺陷較感覺缺陷更為明顯和持久，大鼠認知缺陷觀察結果與人類TBI后遺癥基本一致。由于新穎的治療方法可限于特定類型的損傷，甚至特定的行為缺陷，所以，利用不同種類TBI的嚙齒動物模型和長期的行為測試結果可為未來臨床前研究提供可靠依據(jù)。

2.3 評估損傷程度的局限性損傷嚴重程度評估是TBI診斷、治療和預后的關鍵。目前，在腦損傷的臨床治療中格拉斯哥昏迷評分（glasgow coma scale，GCS）和格拉斯哥預后評分（glasgow outcome scale，GOS）是評估患者損傷程度的主要方法[24]。雖可通過在CHI 1 h后測定小鼠和大鼠神經系統(tǒng)評分（neurological severity score，NSS）來判斷其損傷嚴重程度，但現(xiàn)有的動物實驗中一直缺乏對損傷嚴重性的通用評分系統(tǒng)。然而，機械性損傷參數(shù)、組織學變化和功能測試是實驗性TBI分為輕、中、重度水平的可靠測量依據(jù)。此外，開顱手術位置的微小移動會產生認知功能的差異、海馬細胞損傷和活化星形膠質細胞增生。輕度TBI與重度TBI比較，創(chuàng)傷后遺癥無明顯形態(tài)學改變且致死率較低，但仍缺乏全面研究的動物模型。

先進的MRI檢查可檢測TBI動物模型和輕度TBI患者大腦活動和形態(tài)學的微妙變化[25]。盡管影像學診斷快速發(fā)展，但TBI的早期評估、長期結果預測和嚴重程度判斷仍有困難。需要更多學者致力于尋找敏感、可靠的TBI生物學標志物，并使TBI動物模型中的生物學標志物能真實、準確地反映在人類腦損傷中。

3 結論

臨床上缺乏有效的TBI治療藥物是神經學研究領域與制藥業(yè)的一個重大難題。加深對TBI模型的認知、深入了解創(chuàng)傷后遺反應、研究各種動物模型和體外實驗是當前的首要任務。動物模型可用于探索復雜的病理生理機制，測試新的治療藥物，并確保臨床試驗的安全性。已研制的各種TBI嚙齒類動物模型與人類腦損傷機制相似。小動物模型已用于TBI基本機制和病理結果的研究，但由于道德倫理和花費巨大等原因，研究人員很少使用TBI大動物模型監(jiān)測其臨床相關的生理參數(shù)、長期功能、認知結果和測試新的治療方法的功效。因此，在臨床試驗時應在嚙齒類動物中首先進行測試，證實其功效，再在高度模仿腦損傷的大動物模型中研究其復雜的發(fā)病機制。落體打擊模型可用于彌漫性和局灶性腦損傷的研究，LFPI和CCI是最廣泛使用的嚙齒類動物腦損傷模型?，F(xiàn)今，越來越多的研究集中在爆炸傷和輕度TBI模型方面。

臨床研究設計無法復制腦損傷治療過程中的每個環(huán)節(jié)，如早期低溫治療有益于許多腦損傷的實驗模型，只有在TBI患者開顱手術1.5 h內應用低溫治療才可改善其血腫清除，但不能改善患者的彌漫性腦損傷病變[26]。這意味著對特定TBI患者聯(lián)合治療的最佳時機把握至關重要。

總之，目前的動物模型不能模仿所有類型的人類腦損傷。為實現(xiàn)TBI治療上的突破仍需采取多種辦法。首先，在臨床試驗設計上結合臨床，開發(fā)相關的創(chuàng)新模型，對已建立的模型進行改進和功能測試；并尋找高特異性和高敏感度的生物學標志物，優(yōu)化聯(lián)合治療劑量和給藥時間。其次，研究TBI不同年齡、性別和品種對結果的影響。最后，大多數(shù)藥物在測試期限內不能透過BBB，有效地治療腦損傷。因此，在研究過程中更應關注藥物釋放系統(tǒng)、監(jiān)控目標藥物濃度及藥物相互作用。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.04.016

：A

：1009-5519（2015）04-0526-04

2014-10-29）

貴州省科技廳資助項目（[2006]5041）。

杜安妮（1990-），女，山東莒縣人，碩士研究生，主要從事神經藥理學的研究；E-mail：57568358@qq.com。

石京山（E-mail：shijs@zmc.edu.cn）。