迷迭香酸干預(yù)下HBX基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞凋亡的影響*

蘇杰 姚楊 朱星枚 成碧萍

(西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710077)

迷迭香酸干預(yù)下HBX基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞凋亡的影響*

蘇杰 姚楊 朱星枚 成碧萍

(西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710077)

目的 研究迷迭香酸(Rosmarinic acid)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因的HepG2細(xì)胞(HepG2-X)增殖、侵襲力的影響，并探討其可能的機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)HepG2及HepG2-X細(xì)胞，加入不同濃度用迷迭香酸處理后，用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，用細(xì)胞劃痕和Transwell小室法測(cè)定對(duì)細(xì)胞遷移力的影響。結(jié)果 不同濃度迷迭香酸均能夠抑制HepG2、HepG2-X細(xì)胞的增殖，且呈時(shí)間和劑量依賴性，各HepG2-X組細(xì)胞A值均明顯高于HepG2細(xì)胞(P<0.05)，顯示HBX對(duì)HepG2細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞劃痕愈合減緩(P<0.05)，Transwell穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。且呈濃度依賴性。結(jié)論 迷迭香酸能夠抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲力，HBx在迷迭香酸的干預(yù)下能促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡的作用。

肝癌細(xì)胞； HBx； 迷迭香酸； 增殖； 侵襲； 遷移

流行病學(xué)和分子生物學(xué)研究認(rèn)為HBV是HBV相關(guān)性HCC發(fā)生的高危因素，HBx是HBV四個(gè)開放讀碼框架中X編碼的一種病毒多功能蛋白，研究發(fā)現(xiàn)X基因表達(dá)產(chǎn)物(HBx)在肝癌形成過程中參與肝癌血管生成[1]，可能通過多種復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)到途徑參與細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，與HCC的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系[2，3]。因此以HBx作為肝癌基因治療靶點(diǎn)具有一定的臨床應(yīng)用前景。迷迭香酸(Rosmarinic acid,RosA)是一種水溶性的酚酸類化合物，在植物中廣泛分布，尤以唇形科和紫草科含量最高。且具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腎小球細(xì)胞增殖、抗抑郁等多種藥理作用[4,5]。在保肝、抗腫瘤等方面起著重要的作用，研究表明，其能顯著抑制H2O2引起的大鼠紅細(xì)胞溶血和脂質(zhì)過氧化作用[6]，有效抑制金黃色葡萄球菌以及人體計(jì)生真菌活性[7]。但目前迷迭香酸對(duì)肝癌細(xì)胞的影響未見報(bào)道。因此，本文就迷迭香酸對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因的HepG2-X的侵襲、遷移及增殖的影響進(jìn)行了探究，進(jìn)一步探討迷迭香酸的功能及其可能機(jī)制，另外，本文研究HBx在迷迭香酸干預(yù)下對(duì)HepG2細(xì)胞的影響，探討HBx致肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝癌HepG2及HepG2-X細(xì)胞株由西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，迷迭香酸購自美國(guó)SIGMA公司，用二甲基亞砜(DMSO)溶解后-20℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋。MTT和DMSO購自美國(guó)GIBCO公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存管，40℃水浴融化，1500r/min離心3min后棄上清；沉淀物用PRMI1640完全培養(yǎng)液混懸后適量培養(yǎng)液稀釋，轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)瓶；在37℃、50Mm/L CO2、飽和濕度條件下的孵箱中培養(yǎng)；次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每2d換液1次，待細(xì)胞鋪滿70%～80%培養(yǎng)瓶時(shí)，用2.5g/L的胰酶消化，完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，滴管吹打?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞，1∶4分瓶傳代。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞收集，在收集前1d換液1次，用胰酶消化為單個(gè)細(xì)胞懸液，離心，棄上清，加入凍存液，以1×106/mL的密度混懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至凍存管，標(biāo)記好后置于4℃冰箱30min，轉(zhuǎn)至-20℃冰箱2-3h，然后放入-80℃冰箱暫存，最后置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。

1.3 MTT法觀察細(xì)胞增殖并測(cè)定迷迭香酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)分為迷迭香酸處理組和DMSO對(duì)照組(含0.02%的DMSO)將傳代的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)板中的原培養(yǎng)基吸出，分別加入溶于DMEM培養(yǎng)基中的迷迭香酸，其濃度為0(空白對(duì)照組)、10、20、40、80umol/L，終體積濃度為200μl。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72h后，吸去孔內(nèi)上清液，每孔加入150μl的二甲亞砜，振搖溶解結(jié)晶后酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于595nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定各孔吸光度(A)值，取其均數(shù)作為本次A值計(jì)數(shù)值。以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸繪制各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖，同樣采用MTT法測(cè)定并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.4 細(xì)胞體外侵襲試驗(yàn) Matrigel膠4℃過夜融化，與無血清RPMI 1640培養(yǎng)基按1∶1比例稀釋，以60μl/孔在Transwell上室進(jìn)行鋪膠，37℃放置于通風(fēng)櫥3h使其成膠。經(jīng)不同濃度的迷迭香酸有處理細(xì)胞，胰蛋白酶消化，使細(xì)胞懸浮，經(jīng)離心收集后用無血清RPMI 1640稀釋成5×105個(gè)/ml，取200μl細(xì)胞懸液加入Transwell上室中，下室加入500μl含血清RPMI 1640培養(yǎng)液。常規(guī)條件下培養(yǎng)48h，取出Transwell小室，用棉棒擦凈未穿透微孔濾膜的上室細(xì)胞，PBS漂洗1次，4%的多聚甲醛固定30min,PBS漂洗再次漂洗2次，Giemsa染色30min,雙蒸水沖洗。取下微孔濾膜，置于倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算基底膜下細(xì)胞，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)4次。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液接種到6孔板，6孔板底部劃好直線，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，搖勻后與37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后用1%血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24h,然后用滅菌的200ul微量移液槍槍頭以直尺參照沿培養(yǎng)板底部呈I字形垂直劃痕，劃痕用PBS沖洗3次，以沖走劃痕后的懸浮細(xì)胞，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)組中分別加入用1.5%血清培養(yǎng)基配置的終濃度為100μmol/L的SFLLRN,對(duì)照組只加1.5%血清培養(yǎng)基。鏡下記錄劃痕寬度并拍照。37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合程度并拍照。

細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，離心棄培養(yǎng)液， PBS洗1～2遍，用含0.1%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至于5。取200μl細(xì)胞懸液加入六孔板，36h后，用甲醛固定10min.0.1%結(jié)晶紫室溫孵育10min,清水漂洗3遍以上，顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度迷迭香酸對(duì)細(xì)胞增殖作用 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞A值發(fā)現(xiàn)，HepG2-X細(xì)胞在24h、 48 和72h各時(shí)間點(diǎn)的A值均明顯高于HepG2細(xì)胞(P<0.05)，表明HepG2-X細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加快，顯示HBx對(duì)HepG2細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用。各組隨迷迭香酸濃度的增加，所測(cè)得的A值逐漸降低，與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，迷迭香酸處理組作用各組細(xì)胞后，細(xì)胞增殖被明顯抑制，隨濃度的增加其抑制作用逐漸增強(qiáng)，迷迭香酸在濃度80umol/L時(shí)細(xì)胞增值抑制最為明顯；不同濃度的迷迭香酸處理組作用后IR隨著時(shí)間的增加而升高，各組較前時(shí)間點(diǎn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、表2，其抑制作用與時(shí)間及濃度呈明顯正相關(guān)。

表1 迷迭香酸對(duì)HepG2-X細(xì)胞作用不同時(shí)間的A值

2.2 迷迭香酸可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力 通過Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲能力，迷迭香酸處理36h后，其侵襲能力明顯減弱，與對(duì)照組相比，10、20、40、80umol/L迷迭香酸處理組與空白對(duì)照組相比穿過濾膜的HepG2細(xì)胞明顯減少(P<0.05)；各處理組中不同濃度迷迭香酸作用后穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)量隨迷迭香酸濃度增加而減少，見圖1。

表2 迷迭香酸對(duì)HepG2細(xì)胞作用不同時(shí)間的A值

2.3 迷迭香酸對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響 各組細(xì)胞劃線后在鏡下視野均可見一條細(xì)長(zhǎng)等寬的無細(xì)胞劃痕區(qū)，36h后未經(jīng)迷迭香酸處理過的對(duì)照組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移基本覆蓋了大部分劃痕區(qū)，隨著迷迭香酸濃度的提高，細(xì)胞間劃痕距離縮短趨勢(shì)減緩，迷迭香酸對(duì)HepG2細(xì)胞遷移有明顯的抑制作用，見圖2。

圖1 迷迭香酸對(duì)其侵襲能力的抑制

Figure 1 Inhibition of rosmarinic acid on invation

A:對(duì)照組；B:10μmol/L迷迭香酸組；C:20 μmol/L迷迭香酸組;D:40 μmol/L迷迭香酸組;E: 80μmol/L迷迭香酸組

圖2 迷迭香酸對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響

Figure 2 Influence of rosmarinic acid on cell migration

A :0h 對(duì)照組；B:36h 對(duì)照組；C:36h 10μmol/L迷迭香酸組；D: 36h 20 μmol/L迷迭香酸組E: 36h 40 μmol/L迷迭香酸組F: 36h 80μmol/L迷迭香酸組

3 討論

我國(guó)每年約有11～13萬人死于原發(fā)性肝癌，占全球肝癌死亡數(shù)的半數(shù)之多。在誘發(fā)肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的眾多因素中，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染占到50%以上[8]。因此迫切需要尋找一種有效地臨床治療方法。迷迭香酸具有廣泛的生物活性，近年來發(fā)現(xiàn)其對(duì)消化系統(tǒng)疾病有治療和預(yù)防作用[9,11]。其通過何種環(huán)節(jié)發(fā)揮其作用目前還不清楚。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討迷迭香酸對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的影響，及HBx干預(yù)下對(duì)其影響，旨在為迷迭香酸應(yīng)用于肝癌的臨床治療提供依據(jù)，以及將HBx作為肝癌基因治療提供理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)通過Transwell侵襲小室模型在體外進(jìn)行腫瘤細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)，觀察到HepG2細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲能力，加入迷迭香酸后，其侵襲能力明顯減弱，呈濃度依賴性，說明迷迭香酸可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力。劃痕實(shí)驗(yàn)表明迷迭香酸能顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞的遷移能力，且呈濃度依賴性。此外采用MTT檢測(cè)HepG2-X細(xì)胞與HepG2細(xì)胞的增殖情況表明，迷迭香酸對(duì)兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)活性具有抑制作用，其增殖抑制率與作用時(shí)間和劑量呈明顯的相關(guān)性，隨藥物濃度增大作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率明顯升高，且HBx具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的作用。

4 結(jié)論

迷迭香酸能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖。HBx在凋亡因子迷迭香酸的干預(yù)下能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡作用，但HBx與細(xì)胞凋亡的關(guān)系極其復(fù)雜。其對(duì)細(xì)胞凋亡具有雙向調(diào)節(jié)作用，既可促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡同時(shí)可抑制肝細(xì)胞凋亡[12,13]。因此推測(cè)，HBx是促進(jìn)還是抑制肝細(xì)胞凋亡可能與機(jī)體所處得環(huán)境因素有關(guān)。

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Effect of HBx gene on human HepG2 cell after rosmarinic acid intervention

SU Jie, YAO Yang, ZHU Xing-mei, et al

(TheFirstAffiliatedHospitalofXi′anMedicalUniversity,Xi'an710077,China)

Objective To study the effect of rosmarinic acid on the proliferation and invasion on HepG2 and HepG2-X cell, and investigate the probable molecular mechanisms.Methods Different concentrations of rosmarinic acid were used to treat HepG2 and HepG2-X cell in vitro. The inhibition of proliferation of HepG2 and HepG2-X Cells were studied by methyl thiazolyl teerzolium(MTT) assay. The abilities of cell migration and invation were evaluated by wound healing adday and Transwell chambers. Results After Qucercetin treatment, the proliferation and invasion ability of HepG2 and HepG2-X cell were obviously decreased,which showed a dose-and time-dependent manner(P<0.05)，Absorbance in the HepG2- X group was obviously higher than that of HepG2 cells (P<0.05), showing HBx can promote the proliferation of HepG2.Conclusion Rosmarinic acid can inhibits the proliferation migration and invation of HepG2Cells in vitro. With the intervention of rosmarinic acid, The apoptosis of HepG2 Cells can be promoted by HBx.

Carcinoma; HBx; Rosmarinic acid; Proliferation ; Invasion; Migration

陜西省衛(wèi)生廳科研資助項(xiàng)目(2012D17)

姚楊，E- mail:yaoyang1220@sina.com

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.02.006

2014-06-06； 編輯： 張文秀)