術(shù)后認(rèn)知功能障礙動(dòng)物模型建立及神經(jīng)行為學(xué)研究

錢曉嵐, 王慶端, 張　衛(wèi), 周玉冰,

張晶敏2, 江金花3

(1. 河南省直第三人民醫(yī)院 麻醉科, 河南 鄭州, 450006; 2. 鄭州大學(xué) 藥學(xué)院, 河南 鄭州, 450001;

3. 鄭州大學(xué) 醫(yī)藥科學(xué)研究所, 河南 鄭州, 450052; 4. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 麻醉科, 河南 鄭州, 450052)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙動(dòng)物模型建立及神經(jīng)行為學(xué)研究

錢曉嵐1,2, 王慶端3, 張衛(wèi)4, 周玉冰4,

張晶敏2, 江金花3

(1. 河南省直第三人民醫(yī)院 麻醉科, 河南 鄭州, 450006; 2. 鄭州大學(xué) 藥學(xué)院, 河南 鄭州, 450001;

3. 鄭州大學(xué) 醫(yī)藥科學(xué)研究所, 河南 鄭州, 450052; 4. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 麻醉科, 河南 鄭州, 450052)

摘要:目的建立術(shù)后認(rèn)知功能障礙動(dòng)物模型，分析麻醉藥物、手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)小鼠神經(jīng)行為學(xué)影響。方法健康老齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，麻醉藥物組和手術(shù)組。術(shù)后第1、3、5、7天行Y迷宮試驗(yàn)，觀察神經(jīng)行為學(xué)改變，記錄小鼠迷路分辨學(xué)習(xí)達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需要的訓(xùn)練次數(shù)、潛伏期、主動(dòng)逃避率。結(jié)果麻藥組術(shù)后第1天，手術(shù)組術(shù)后第1、3、5天學(xué)習(xí)記憶能力受損，與對(duì)照組相比，潛伏期延長(zhǎng)，錯(cuò)誤率增加，訓(xùn)練次數(shù)增加，主動(dòng)逃避率減少(P<0.01或P<0.05)。結(jié)論聯(lián)合采用復(fù)合全麻藥物及手術(shù)創(chuàng)傷方法制備的術(shù)后認(rèn)知功能障礙小鼠模型能有效重現(xiàn)術(shù)后認(rèn)知功能障礙患者的發(fā)病特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞:老齡; 麻醉; 手術(shù)創(chuàng)傷; 術(shù)后認(rèn)知功能障礙; 模型

NMDA受體拮抗劑、GABA受體激動(dòng)劑單用都可導(dǎo)致神經(jīng)元毒性。大量文獻(xiàn)顯示麻醉和手術(shù)會(huì)加重隨著年齡增長(zhǎng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性改變，老齡、麻醉藥物、手術(shù)與POCD的發(fā)生有著重要聯(lián)系。本研究模擬臨床復(fù)合老齡、麻醉藥物、手術(shù)創(chuàng)傷多種致病因素，建立了術(shù)后認(rèn)知功能障礙動(dòng)物模型，旨在重現(xiàn)術(shù)后認(rèn)知功能障礙患者的發(fā)病特點(diǎn)，分析麻醉藥物、手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)小鼠神經(jīng)行為學(xué)影響，并將其應(yīng)用于術(shù)后認(rèn)知功能障礙發(fā)病機(jī)制及其藥物預(yù)防方面。

1材料與方法

1.1　材料

36只健康老齡BALB/c小鼠(月齡20～22 m, 體質(zhì)量60～70 g, SPF級(jí))，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(豫)2010-0002，使用許可證號(hào)為SYXK(豫)2011-0010。IVC飼養(yǎng)環(huán)境下溫度都維持在23 ℃, 12 h交替黑白周期,供應(yīng)充足的水和食物，不健康的小鼠排除。

1.2　藥品和儀器

藥品：異氟醚(Nicholas Piramal公司，批號(hào)A01A11A)，氯胺酮(福建古田藥業(yè)有限公司，批號(hào)130223); 儀器：Y型迷宮測(cè)試儀(上海軟隆科技發(fā)展有限公司)

1.3　方法

經(jīng)7～10 d適應(yīng)環(huán)境后，將動(dòng)物隨機(jī)分為3組?？瞻讓?duì)照組(n=12)不給予麻醉藥物和實(shí)施手術(shù)；麻醉藥物組(n=12)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受1.5%～2%異氟醚誘導(dǎo)1～2 min, 然后腹腔注射氯胺酮100 mg/kg, 持續(xù)吸入異氟醚60分達(dá)到相應(yīng)手術(shù)最大刺激無痛，生命體征維持正常麻醉深度。麻醉藥物手術(shù)組(n=12)小鼠給予復(fù)合麻醉藥物后實(shí)施剖腹探查脾切除手術(shù)。具體手術(shù)操作步驟：首先切口處備皮、按無菌操作碘伏消毒,在上腹部正中線偏左做3～4 cm切口，進(jìn)入腹腔后探查肝脾腸管約20 min, 切除脾臟，然后用縫線依次縫合腹膜、皮下組織及皮膚。術(shù)后待老鼠麻醉恢復(fù)后放回籠子里各自飼養(yǎng)。

Y迷宮實(shí)驗(yàn):麻醉組、手術(shù)組分別于麻醉術(shù)后第1、3、5、7天行Y迷宮實(shí)驗(yàn)，記錄各組所需的訓(xùn)練次數(shù)，潛伏期，主動(dòng)逃避率；Y型迷宮裝置由3個(gè)支臂和一個(gè)中間連接區(qū)組成，在每臂底部鋪以與刺激電源相通細(xì)銅棒。信號(hào)燈裝在各臂末端，信號(hào)燈開啟的區(qū)域表示該臂為安全區(qū)，該臂底部不通電。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，讓小鼠在起步區(qū)適應(yīng)5 min左右，在安全區(qū)的信號(hào)燈亮起5 s后，開通刺激電源給起步區(qū)、非安全區(qū)通電，小鼠受電擊后跑至信號(hào)燈亮起的安全區(qū)后結(jié)束一次訓(xùn)練。依次變換安全區(qū)和電擊區(qū)的位置，重復(fù)以上訓(xùn)練過程直到小鼠達(dá)到學(xué)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)10次測(cè)試中有9次正確，結(jié)束實(shí)驗(yàn)。記錄訓(xùn)練次數(shù)，潛伏期，主動(dòng)逃避率。小鼠的潛伏期即反應(yīng)時(shí)間，是指從安全區(qū)信號(hào)燈亮開始到大鼠第1次逃至燈亮區(qū)為止所消耗的時(shí)間；主動(dòng)逃避率指信號(hào)燈亮后起步區(qū)、非安全區(qū)未通電的5 s內(nèi)完成逃避反應(yīng)的次數(shù)占總反應(yīng)次數(shù)的百分率。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0處理。統(tǒng)計(jì)描述以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett T檢驗(yàn)。對(duì)于不符合正態(tài)分布或方差齊的數(shù)據(jù)，做對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

與對(duì)照組相比，麻醉組術(shù)后第1天的空間記憶學(xué)習(xí)能力(P<0.05) 受到破壞，潛伏期延長(zhǎng)，訓(xùn)練次數(shù)增加，主動(dòng)逃避率減少，錯(cuò)誤率增加，在術(shù)后第3天恢復(fù)(P>0.05) 。手術(shù)組小鼠在術(shù)后第1、3和5天尋找安全區(qū)潛伏期時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組小鼠(P<0.01或P<0.05)，主動(dòng)逃避率減少(P<0.01或P<0.05), 總訓(xùn)練次數(shù)與對(duì)照組比較明顯增加(P<0.01或P<0.05)，持續(xù)到術(shù)后第7天各項(xiàng)與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。見表1、2、3。

表1　Y迷宮實(shí)驗(yàn)中各組小鼠達(dá)標(biāo)訓(xùn)練次數(shù)

與對(duì)照組比較, *P<0.05, **P<0.01。

表2　Y迷宮實(shí)驗(yàn)中各組小鼠潛伏期

與對(duì)照組比較, *P<0.05, **P<0.01。

表3　Y迷宮實(shí)驗(yàn)中各組小鼠主動(dòng)逃避率

與對(duì)照組比較, *P<0.05, **P<0.01。

3討論

本研究手術(shù)創(chuàng)傷模型建立選取了剖腹探查脾切除術(shù)，研究結(jié)果證實(shí)手術(shù)創(chuàng)傷會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)鼠術(shù)后空間分辨學(xué)習(xí)能力、防御保護(hù)反射遭到破壞。與單純麻藥組相比，復(fù)合手術(shù)創(chuàng)傷更容易引起老年鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙且持續(xù)的時(shí)間更長(zhǎng)。海馬參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)信息系統(tǒng)功能的整合，是與學(xué)習(xí)記憶等大腦最高級(jí)的認(rèn)知功能密切相關(guān)的重要部位。任何損毀海馬造成損傷的因素均可能導(dǎo)致認(rèn)知學(xué)習(xí)記憶功能下降。全麻藥物通過調(diào)控特定的配基門控離子通道，主要是γ-氨基丁酸型A受體和N-甲基D-天門冬氨酸受體亞型-谷氨酸受體，從而改變突觸的功能，改變神經(jīng)突觸可塑性[1]。全麻藥物作用于大腦引起中樞神經(jīng)遞質(zhì)生成、釋放、儲(chǔ)存和滅活過程異常和受體系統(tǒng)敏感度發(fā)生改變，這些均可導(dǎo)致術(shù)后學(xué)習(xí)、記憶力等認(rèn)知功能的變化[2]。Culley等[3]研究顯示,大鼠吸入異氟醚后，對(duì)老年大鼠的空間分辨記憶損害作用可持續(xù)數(shù)周。異氟烷通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜1，4，5三羥甲基氨基甲烷磷酸鹽受體引起鈣離子過度釋放及減少組織型纖溶酶原激活物釋放而啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡途徑[4]。在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究[5]已證明異氟烷的細(xì)胞毒性作用是引起認(rèn)知功能障礙的危險(xiǎn)因素。氯胺酮可與N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體結(jié)合產(chǎn)生非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，抑制海馬CA1 區(qū)對(duì)各種刺激作用后的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)效應(yīng)，從而干擾學(xué)習(xí)記憶過程, 同時(shí)氯胺酮還可與nAch受體結(jié)合，促使NMDA受體通道亞單位NR2B mRNA 的表達(dá)下調(diào)， NMDA 受體的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而損害認(rèn)知功能[6]。Morgan等[7]給予志愿者小劑量氯胺酮呈現(xiàn)出劑量依賴性的間斷記憶和工作記憶損害，口服氯胺酮在3 d后出現(xiàn)語(yǔ)義記憶等多種記憶功能的損害，注意力不集中和精神分裂樣癥狀。因此本實(shí)驗(yàn)麻醉藥物采用神經(jīng)損傷報(bào)道較多的異氟醚和氯胺酮 。

麻醉組術(shù)后第1天的空間記憶學(xué)習(xí)能力在術(shù)后第1天受到破壞，潛伏期延長(zhǎng)，訓(xùn)練次數(shù)增加，主動(dòng)逃避率減少，錯(cuò)誤率增加，術(shù)后第3天已恢復(fù)至正常提示單純的麻醉因素并不能引起認(rèn)知功能的長(zhǎng)時(shí)間破壞，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單純接受麻醉藥物處理不是一個(gè)很好的POCD模型。大量研究[8]報(bào)道，是手術(shù)因素而非麻醉與精神紊亂、POCD的發(fā)生有密切的關(guān)系。強(qiáng)烈持續(xù)應(yīng)激影響下丘腦垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能改變，引起循環(huán)中糖皮質(zhì)激素濃度增高，中樞Ach、NE和5-HT等遞質(zhì)產(chǎn)生釋放發(fā)生紊亂，影響海馬突觸間聯(lián)系導(dǎo)致記憶和學(xué)習(xí)能力下降。脾切除手術(shù)組的設(shè)立是為了給動(dòng)物造成一定程度的創(chuàng)傷形成，有研究[9]認(rèn)為手術(shù)侵襲程度的大小對(duì)老年人術(shù)后認(rèn)知功能損害的影響不同，創(chuàng)傷程度大的手術(shù)后，患者術(shù)后更容易出現(xiàn)學(xué)習(xí)機(jī)記憶功能障礙。臨床上術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)多見于出血量多、手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)、創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈的病人。手術(shù)創(chuàng)傷激活外周免疫系統(tǒng)釋放各種炎性因子，C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)、膠質(zhì)細(xì)胞等在血液中和大腦組織中高表達(dá)。中樞小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后，釋放類花生酸類物質(zhì)、炎性因子、補(bǔ)體、過氧化物、興奮性氨基酸和NO等可溶的炎性分子。Wan[10]研究顯示脾切除手術(shù)后引起空間辨別、學(xué)習(xí)認(rèn)知能力的下降與膠質(zhì)細(xì)胞激活及海馬區(qū)炎癥介質(zhì)的釋放有關(guān)。Ramlawi等[11]研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)術(shù)后POCD發(fā)生的患者組C反應(yīng)蛋白的表達(dá)水平顯著升高。因此圍術(shù)期手術(shù)創(chuàng)傷和應(yīng)激引起的炎癥反應(yīng)在認(rèn)知功能減退中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)手術(shù)組小鼠在術(shù)后第1、3和5天尋找安全區(qū)潛伏期時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組小鼠，主動(dòng)逃避率減少，總訓(xùn)練次數(shù)明顯增加持續(xù)到術(shù)后第7天同樣證明手術(shù)創(chuàng)傷與認(rèn)知功能有密切關(guān)系。

Y迷宮實(shí)驗(yàn)是測(cè)試動(dòng)物海馬依賴或非海馬依賴空間學(xué)習(xí)記憶能力的較為普遍的方法[12]。訓(xùn)練期所測(cè)試的潛伏期代表實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，潛伏期越長(zhǎng)其學(xué)習(xí)能力越差；主動(dòng)逃避率反映受試動(dòng)物的空間記憶保持能力，受試動(dòng)物在燈亮后起跑時(shí)間越早主動(dòng)逃避次數(shù)越多其記憶能力越強(qiáng)。小鼠能在電刺激尚未開始時(shí)根據(jù)安全區(qū)燈亮主動(dòng)回避電擊逃往安全區(qū)表明小鼠已經(jīng)形成了明暗辨別條件反射。POCD是一個(gè)多因素的綜合征，可能是在腦退行性改變及易感基因的基礎(chǔ)上，在圍術(shù)期的持續(xù)應(yīng)激刺激和藥物作用影響下多種因素共同作用導(dǎo)致的結(jié)果。手術(shù)創(chuàng)傷大、手術(shù)應(yīng)激性高及體外循環(huán)心臟手術(shù)均是老年患者POCD高發(fā)因素。手術(shù)本身干擾人體內(nèi)環(huán)境改變啟動(dòng)免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)，本試驗(yàn)結(jié)果同樣提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變與POCD的發(fā)生可能有著重要聯(lián)系，而麻醉和手術(shù)會(huì)加重隨著年齡增長(zhǎng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)

經(jīng)歷的退行性改變，老齡、麻醉藥物、手術(shù)與P0CD的發(fā)生有著重要聯(lián)系。聯(lián)合采用復(fù)合全麻藥物及手術(shù)創(chuàng)傷方法制備的術(shù)后認(rèn)知功能障礙小鼠模型能有效重現(xiàn)術(shù)后認(rèn)知功能障礙患者的發(fā)病特點(diǎn), 可將其進(jìn)一步應(yīng)用于發(fā)病機(jī)制及其藥物預(yù)防方面的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Franks N P. Molecular targets underlying general anaesthesia[J]. Br J Pharmacol, 2006, 147 (Suppl 1): S72.

[2]Culley D J, Baxter M G, Yukhananov R, et al. Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats[J]. Anesthesiology, 2004, 100(2): 309.

[3]Culley D J, Baxter M, Yukhananov R, et al. The memory effects of general anesthesia persist for weeks in young and aged rats[J]. Anesth Analg, 2003, 96(4): 1004.

[4]Wei H, Liang G, Yang H, et al. The common inhalational anesthetic isoflurane induces apoptosis via activation of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors[J]. Anesthesiology, 2008, 108(2): 251.

[5]Valentim A M, Alves H C, Silva A M, et al. Effects of depth of isoflurane anaesthesia on a cognition task in mice[J]. Br J Anaesth, 2008, 101(3): 434.

[6]Wang J, Zhou M, Wang X, et al. Impact of ketamine on learning and memory function, neuronal apoptosis and its potential association with miR-214 and PTEN in adolescent rats[J]. PLOS ONE, 2014,9(6): e99855.

[7]Morgan C J, Muetzelfeldt L, Curran H V. Consequences of chronic ketamine self-administration upon neurocognitive function and psychological wellbeing: a 1-year longitudinal study[J]. Addiction, 2010, 105(1): 121.

[8]He HJ, Wang Y, Le Y, et al. Surgery upregulates high mobility group box-1 and disrupts the blood-brain barrier causing cognitive dysfunction in aged rats[J]. CNS Neurosci Ther, 2012, 18(12): 994.

[9]Cao X Z, Ma H, Wang J K, et al. Postoperative cognitive deficits and neuroinflammation in the hippocampus triggered by surgical trauma are exacerbated in aged rats[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2010, 34(8): 1426.

[10]Wan Y, Xu J, Ma D, et al. Postoperative impairment of cognitive function in rats: a possible role for cytokine-mediated inflammation in the hippocampus[J]. Anesthesiology, 2007, 106(3): 436.

[11]Ramlawi B, Rudolph J L, Mieno S, et al. C-Reactive protein and inflammatory response associated to neurocognitive decline following cardiac surgery[J]. Surgery, 2006, 140(2): 221.

[12]Havekes R, Timmer M, Van der Zee E A. Regional differences in hippocampal PKA immunoreactivity after training and reversal training in a spatial Y-maze task[J]. Hippocampus, 2007, 17(5): 338.

論著

Establishment of POCD animal model and neurobehavioral study

QIAN Xiaolan1,2, WANG Qingduan3, ZHANG Wei4, ZHOU Yubing4,

ZHANG Jingmin2, JIANG Jinhua3

(1.DepartmentofAnesthesiology,TheThirdPeopleHospitalofHenanProvince,

Zhengzhou,Henan, 450006; 2SchoolofMedicine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,

Henan, 450001; 3.InstituteofMedicalScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,

Henan, 450052; 4.DepartmentofAnesthesiology,TheFirstAffiliatedHospital

ofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan, 450052)

ABSTRACT:ObjectiveTo establish a POCD model and to analyze the effects of anesthetic drugs and surgical trauma on the neurobehaviors. MethodsHealthy aging BALB/c mice were randomly divided into three groups: control group, anesthetic drugs group and surgery group. On the 1st, 3rd, 5th and 7th days after surgery, neurobehavioral changes were observed by Y maze test. Training times, latency time and active escape rate reached the standard for mice in the lost discrimination learning were recorded. ResultsThe impaired learning and memory appeared on 1st day in anesthetic drugs group and on 1st, 3rd and 5th day after surgery in surgery group, in which latency time was prolonged, the error rates increased, the training times increased and active escape rate reduced when compared with control group (P<0.01 orP<0.05). ConclusionThe POCD mice model is established through compound general anesthesia combined with surgical trauma, and this model can effectively reproduce POCD characteristics.

KEYWORDS:senile; anesthesiology; surgery trauma; postoperative cognitive dysfunction; model

基金項(xiàng)目:河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(201304073)

收稿日期:2015-04-25

中圖分類號(hào):R 332

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)21-001-03DOI: 10.7619/jcmp.201521001