電針對(duì)腦缺血再灌注的Bax基因敲除小鼠的JNK線粒體通路的調(diào)控作用研究思路※

趙建新　田元祥　冉清智

(北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院針灸科，北京　100029)

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學(xué) 術(shù) 探 討

電針對(duì)腦缺血再灌注的Bax基因敲除小鼠的JNK線粒體通路的調(diào)控作用研究思路※

趙建新田元祥△冉清智1

(北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院針灸科，北京100029)

【摘要】目的探討電針對(duì)腦缺血再灌注(I/R)的Bax基因敲除小鼠的JNK線粒體通路的調(diào)控作用研究思路。方法參考相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)，以研究假說的方式對(duì)電針對(duì)腦I/R的Bax基因敲除小鼠的JNK線粒體通路的調(diào)控作用進(jìn)行論證闡述。 結(jié)果腦I/R損傷可誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，在這個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程涉及多個(gè)基因的表達(dá)及相互作用，JNK信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在腦I/R損傷中起重要作用，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素8(IL-8)是腦I/R形成的標(biāo)志物，電針治療可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕腦I/R損傷，保護(hù)神經(jīng)元，應(yīng)用Bax基因敲除小鼠使研究得以深化。結(jié)論研究以Bax基因敲除小鼠為基礎(chǔ)，從JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)線粒體通路的不同環(huán)節(jié)—I/R模型、I/R特征、JNK活化、Bcl-2與Bax平衡、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)釋放、細(xì)胞凋亡結(jié)果的多個(gè)層次，可以闡明電針調(diào)控腦I/R損傷海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)caspase非依賴的線粒體通路機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】腦缺血；再灌注損傷；疾病模型，動(dòng)物；小鼠；針刺療法；線粒體；細(xì)胞凋亡；白細(xì)胞介素類

我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，電針百會(huì)、腎俞、膈俞穴組穴的益腎醒腦針法可以通過上調(diào)海馬熱休克蛋白70(HSP70)、c-fos、Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，降低凋亡率，抑制海馬細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)元[1-7]。Bax基因是腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷過程中JNK/MAPK信號(hào)通路中的線粒體途徑的主要介導(dǎo)者，在誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用，但也只是其中的一個(gè)鏈條。電針是如何由刺激通過JNK/MAPK信號(hào)通路中的線粒體途徑的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮上述作用尚不清楚。因此，本研究擬探討電針對(duì)腦I/R的Bax基因敲除小鼠的JNK線粒體通路的調(diào)控作用研究思路。

1腦I/R損傷可以誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡

腦I/R損傷是腦I/R期繼發(fā)性損傷，是腦血管疾病、腦腫瘤等引發(fā)的腦缺血及腦組織損傷的主要病理機(jī)制，可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[8-11]，導(dǎo)致海馬損傷[12-20]和皮層損傷[13，21-25]。

短暫性缺血后，缺血中心區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞很快出現(xiàn)細(xì)胞壞死。但在缺血中心區(qū)域周邊的神經(jīng)細(xì)胞，一般經(jīng)過1～2 d，才出現(xiàn)延遲性神經(jīng)細(xì)胞退化。已證明這種延遲性細(xì)胞退化就是細(xì)胞凋亡[26]。對(duì)大鼠腦I/R后大腦皮質(zhì)和紋狀體神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，腦I/R 1 h，紋狀體水腫區(qū)可見少量凋亡細(xì)胞，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞逐漸增多，散見于紋狀體、大腦皮質(zhì)，再灌注24～48 h凋亡細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰；再灌注24 h時(shí)，可見凋亡細(xì)胞的各種形態(tài)[26-27]。也有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡的神經(jīng)元數(shù)目在急性腦I/R 24 h明顯增加，在48、72 h進(jìn)一步增加，存活神經(jīng)元數(shù)目隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降[8]。顯示在腦I/R 損傷時(shí)神經(jīng)細(xì)胞凋亡起著重要作用。

腦I/R過程中模型大鼠形成大腦皮層損傷[21]，大鼠海馬區(qū)凋亡細(xì)胞也可見增多[18，27-28]，腦I/R 7 d 模型小鼠大腦皮質(zhì)變薄，部分神經(jīng)細(xì)胞核固縮，局限性神經(jīng)元數(shù)目減少，出現(xiàn)篩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，膠質(zhì)細(xì)胞增生，15、30 d 鏡下與7 d 基本相同。海馬CA1 區(qū)細(xì)胞脫失，隨時(shí)間推移逐漸加重，至術(shù)后30 d，海馬CA1 區(qū)細(xì)胞幾乎完全脫失，膠質(zhì)細(xì)胞大量增生，形成結(jié)節(jié)，CA2、CA3 區(qū)細(xì)胞也嚴(yán)重脫失，呈現(xiàn)海馬錐體細(xì)胞的遲發(fā)性壞死[12,29]。腦I/R 損傷大鼠海馬區(qū)c-fos蛋白、caspase-3和Bax的陽性細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞表達(dá)增多[9,28]。說明腦I/R 確實(shí)可誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。但是，電針是如何由刺激通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用尚不夠明確。

2腦I/R損傷誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程涉及多個(gè)基因的表達(dá)及相互作用

研究表明，細(xì)胞凋亡在腦缺血中發(fā)揮著重要作用。無論是急性的局灶性腦缺血，還是短暫性腦缺血后的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，都有細(xì)胞凋亡的參與，在不同刺激信號(hào)的影響下，涉及多個(gè)基因表達(dá)及相互作用的復(fù)雜過程[30]。

細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活在體內(nèi)細(xì)胞中因各種應(yīng)激、刺激強(qiáng)度、作用方式和持續(xù)時(shí)間不同而結(jié)果有差異，細(xì)胞凋亡的多種信號(hào)途徑間也存在互通的交叉部分。在腦缺血中除了經(jīng)典的死亡受體途徑(Fas/FasL 介導(dǎo)的是促凋亡信號(hào)通路)和線粒體途徑外，PI3K/Akt 通路和MAPK 通路是膜受體信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，調(diào)節(jié)著細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)以及一些重要基因的表達(dá)[38]。腦I/R模型小鼠海馬一氧化氮(NO)產(chǎn)生增多[20]，顯著增加硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(TBARS)水平[16]，提高生產(chǎn)活性氧(ROS)，是一個(gè)重要的神經(jīng)損傷[15]。腦I/R導(dǎo)致環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)表達(dá)的增加，以及激活p38和p42/44絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)損傷[14]。LR4介導(dǎo)的MyD88的依賴I/R 激活的信號(hào)通路可能通過上調(diào)NF-κB和腫瘤壞死因子α(TNF-α)參與I/R 損傷[23]。在右側(cè)皮質(zhì)I/R 損傷中細(xì)胞內(nèi)骨橋蛋白(iOPN)的增加，表明再灌注損傷的反應(yīng)為iOPN的作用[25]。全腦I/R能夠促進(jìn)谷氨酸受體6(GluR6)介導(dǎo)的c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號(hào)通路的激活，GluR6的S-亞硝基化促進(jìn)GluR6-PSD95-MLK3信號(hào)模塊的組裝，從而激活MLK3及其下游的信號(hào)通路，呈現(xiàn)缺血性腦損傷[17]。

3JNK信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在I/R損傷中起重要作用

JNK家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated MAP kinase，SAPK)，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)超家族的一員[31]。JNK信號(hào)通路能夠被多種細(xì)胞外刺激因素激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子[TNF-α、白細(xì)胞介素1(IL-1)等]、應(yīng)激(如紫外線照射、高滲透壓、I/R)等[32]，參與了許多細(xì)胞凋亡的發(fā)生[33]，其功能的失調(diào)被認(rèn)為與多種疾病和病理損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、1型糖尿病、I/R損傷等[34-37]。因此，JNK信號(hào)通路可作為臨床上相關(guān)疾病的一個(gè)分子治療靶。但是，電針對(duì)I/R損傷作用的JNK信號(hào)通路的分子機(jī)制尚不清楚。JNK的大體概念圖見圖1。

圖1　JNK的大體概念圖

靜止細(xì)胞的JNK主要定位于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)被刺激因素激活后，部分活化的JNK就轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，通過磷酸化而激活多種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，如活化蛋白1(activator protein 1，AP-1)[38]、ATF2、P53、Elk-1和c-Myc2等[39-42]，促進(jìn)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和新蛋白質(zhì)的合成，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，這是JNK轉(zhuǎn)錄依賴方式的生物學(xué)基礎(chǔ)。近年來研究發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)中的某些成分也可能是JNK的作用底物，如Bcl-2家族(Bcl-2、Bcl-xL、Bim、BAD)等[43-45]。這表明JNK信號(hào)通路不僅可以調(diào)節(jié)核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄，還能夠通過直接調(diào)節(jié)胞質(zhì)底物的結(jié)構(gòu)和功能而快速地發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，這是JNK非轉(zhuǎn)錄依賴方式的生物學(xué)基礎(chǔ)。JNK的定位、轉(zhuǎn)位、激活與功能發(fā)揮見如圖2。

圖2　JNK的定位、轉(zhuǎn)位、激活與功能發(fā)揮

JNK介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑目前認(rèn)為其機(jī)制主要有2個(gè)。一是通過轉(zhuǎn)錄依賴的方式調(diào)節(jié)下游凋亡相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和凋亡蛋白的表達(dá)而介導(dǎo)死亡受體途徑及線粒體途徑的細(xì)胞凋亡；二是通過非轉(zhuǎn)錄依賴的方式直接調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)靶蛋白的活性(如Bim、Bcl-2等)而介導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[46]。但JNK介導(dǎo)的電針調(diào)控轉(zhuǎn)錄依賴方式抑或非轉(zhuǎn)錄依賴方式線粒體途徑的細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚。JNK介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的2條信號(hào)途徑見圖3。

圖3　JNK介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的2條信號(hào)途徑

非轉(zhuǎn)錄因子途徑—線粒體途徑，是基于一部分活化的JNK留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)通過磷酸化作用直接調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員(Bim、Bax、Bcl-2等)的活性而介導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[46-49]，此過程不依賴新基因的表達(dá)。Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)控者，分為3類：促凋亡蛋白，如Bak和Bax；抗凋亡蛋白，如Bcl-2和Bcl-xL，以及Bim、Bid等BH3-only蛋白[46,50]，其中Bax是線粒體途徑的主要介導(dǎo)者[51]?；罨腏NK能夠磷酸化激活Bax[46]，也可以通過磷酸化激活Bim等BH3-only蛋白和接頭蛋白14-3-3、抑制Bcl-2等抗凋亡蛋白而激活Bax[46,48]?；罨腂ax轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，使線粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C、Smac/DIABLO和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)等促凋亡線粒體蛋白[50]。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C通過形成凋亡小體而啟動(dòng)caspase依賴的線粒體途徑的細(xì)胞凋亡；Smac/DIABLO通過阻斷凋亡抑制蛋白IAPs的活性而啟動(dòng)caspase依賴的線粒體途徑的細(xì)胞凋亡；AIF可以進(jìn)入細(xì)胞核直接剪切DNA而誘導(dǎo)caspase非依賴的線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[52]。JNK非轉(zhuǎn)錄因子途徑—線粒體途徑見圖4。

圖4　JNK非轉(zhuǎn)錄因子途徑—線粒體途徑

這與我們的前期研究發(fā)現(xiàn)密切相關(guān)。我們用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)觀察電針對(duì)腦I/R 損傷小鼠海馬神經(jīng)元凋亡及相關(guān)基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)電針可上調(diào)小鼠海馬細(xì)胞Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，降低凋亡率，且療效優(yōu)于甲磺酸雙氫麥角毒堿片，電針可起到抑制凋亡、保護(hù)神經(jīng)元的作用[1]。但是，電針是通過調(diào)控細(xì)胞色素C的釋放，Smac/DIABLO的釋放，還是AIF的釋放，尚不清楚。

在I/R損傷過程中，活性氧等激活的JNK能分別通過死亡受體途徑和線粒體途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)大鼠大腦局部I/R模型的研究發(fā)現(xiàn)，缺血區(qū)JNK活性明顯增加，JNK抑制劑sp600125可以阻斷Bax從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入線粒體，抑制了腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，病理改變減輕[53]。但電針是否和JNK抑制劑sp600125一樣可以阻斷Bax從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入線粒體，以及抑制的程度，尚不清楚。

4炎性因子TNF-α、IL-8是腦I/R形成的標(biāo)志物

炎癥反應(yīng)在腦I/R 損傷機(jī)制中擔(dān)負(fù)著重要角色，大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，腦缺血后強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)是造成腦組織繼發(fā)性損傷的因素之一，在此炎癥反應(yīng)過程中，多種因素相互作用，共同引起再灌注損傷[54]。其中TNF-α、IL-8是腦I/R 形成的標(biāo)志物。

TNF是Canswell EA等在1975年發(fā)現(xiàn)的一種能使腫瘤發(fā)生出血壞死的物質(zhì)，它可分為TNF-α和TNF-β 2種，其中TNF-α主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞分泌，也可由抗原刺激的T細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞和肥大細(xì)胞分泌，屬多肽類激素，是具有廣泛生物學(xué)功能的多效細(xì)胞因子，主要與炎癥及免疫反應(yīng)有關(guān)，在腦缺血早期TNF-α分泌或合成的增加是腦梗死形成的主要原因[55]。有研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了神經(jīng)元保護(hù)及神經(jīng)功能修復(fù)等，其機(jī)制可能與TNF-α的釋放有關(guān)，它的釋放可能參與了血腦屏障保護(hù)機(jī)制[56]。

IL-8是機(jī)體主要的炎癥趨化因子，對(duì)中性粒細(xì)胞有明顯的趨化和功能活化作用，同時(shí)參與了中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附過程的調(diào)節(jié)，在炎癥過程中起重要作用[57]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-8的變化與腦I/R 損傷存在一定的關(guān)系，IL-8在腦I/R 早期明顯升高[58-59]。Yamasaki Y等[60]發(fā)現(xiàn)再灌注后12 h始見中性粒細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，并浸潤(rùn)至腦實(shí)質(zhì)，提示缺血區(qū)IL-8的濃度升高早于中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。

5電針治療可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕腦缺血再灌注損傷，保護(hù)神經(jīng)元

針刺可以抑制腦I/R 損傷[61-68]，電針可以抑制腦I/R 損傷[33]，抑制大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡[69]和皮層海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[1]。

腦I/R 損傷所致海馬神經(jīng)元凋亡，主要是引發(fā)記憶障礙。針刺單穴及復(fù)方治療記憶障礙在古代文獻(xiàn)已有記載，如“遺忘”、“健忘”、“善忘”、“呆病”、“文癡”等。近年臨床報(bào)道顯示，針刺療法對(duì)血管性癡呆患者的智能及社會(huì)活動(dòng)功能康復(fù)療效肯定。根據(jù)中風(fēng)癡呆證患者腎虛者可占80%以上[70]，以腎虛、痰瘀內(nèi)阻為證候基本特征，故以益腎填髓、醒腦啟智佐滌痰化瘀立法選穴。結(jié)合經(jīng)絡(luò)理論，如《難經(jīng)·二十八難》“督脈者……上至風(fēng)府，入屬于腦”，周莉等[71]觀察到針刺百會(huì)可提高人的即時(shí)記憶能力及小鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)和記憶再現(xiàn)能力，故針刺百會(huì)可通督醒腦。腎俞、膈俞均屬膀胱經(jīng)，而“膀胱足太陽之脈，起于目?jī)?nèi)毗，上額交巔。其直者，從巔入絡(luò)腦”(《靈樞·經(jīng)脈》)，腎俞可益腎填髓充腦，膈俞為八會(huì)穴之一，可活血化瘀。因此，選用這組穴位，以百會(huì)通督醒腦，腎俞益腎填髓充腦，膈俞活瘀祛痰。因此，我們的前期研究選用了百會(huì)、腎俞、膈俞穴組成益腎醒腦針法[1-7]。

研究證實(shí)，益腎醒腦針法對(duì)腦I/R 模型動(dòng)物學(xué)習(xí)與記憶能力有良性影響，可以抑制模型小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)與記憶能力的減退[2-3]。糖尿病大鼠腦I/R損傷可導(dǎo)致海馬的損傷[19]，針刺可改善糖尿病合并腦I/R 造成的學(xué)習(xí)記憶障礙，治療后神經(jīng)元缺失有所減輕[62]。

前期實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制反復(fù)腦I/R 小鼠模型，海馬和皮層同時(shí)受損。術(shù)后1 d，模型小鼠海馬CA1區(qū)及皮層神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡，術(shù)后7 d凋亡細(xì)胞進(jìn)一步增多。結(jié)合圖像分析，模型組海馬CA1區(qū)凋亡陽性細(xì)胞的場(chǎng)數(shù)目、面數(shù)密度、面密度均增加，即凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目增加，細(xì)胞核固縮。

益腎醒腦針法抑制腦I/R 導(dǎo)致的大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是多途徑、多方位的。電針通過影響I/R 局灶的神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，改善缺血病灶區(qū)域的能量供應(yīng)及代謝功能，發(fā)揮對(duì)神經(jīng)功能的保護(hù)作用[30]。通過動(dòng)員外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)數(shù)量、降低誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)活性和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的高表達(dá)，促進(jìn)血管新生來改善腦缺血[68]。通過下調(diào)Bax蛋白和上調(diào)Bcl-2，抑制脊髓背根傳入神經(jīng)阻滯貓神經(jīng)細(xì)胞凋亡[69]。頭電針可減輕大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注后白細(xì)胞的浸潤(rùn)，在一定范圍內(nèi)降低血漿及缺血腦組織TNF-α和IL-1β表達(dá)，增強(qiáng)IL-10表達(dá)，降低損傷腦組織中COX-2、NF-κB的表達(dá)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-beta1，TGF-β1)的表達(dá)，減緩免疫炎癥反應(yīng)，減輕腦I/R 損傷，改善模型大鼠腦神經(jīng)功能的恢復(fù)[63,65-66]。經(jīng)電針治療7 d，反復(fù)腦I/R 小鼠的海馬及皮層神經(jīng)元凋亡陽性細(xì)胞的場(chǎng)數(shù)目、面數(shù)密度、面密度均降低，凋亡細(xì)胞明顯減少[6-7]，即顯示電針具有抑制海馬及皮層神經(jīng)元凋亡的作用。電針可通過上調(diào)海馬HSP70、c-fos、Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，降低凋亡率，抑制海馬細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)元[1,4-5]。研究發(fā)現(xiàn)腦I/R 組大鼠大腦皮層細(xì)胞線粒體膜電位水平明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，電針可使線粒體膜電位升高，細(xì)胞凋亡率受到抑制[22]。

總之，目前的研究結(jié)果表明，電針治療可以通過減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕腦I/R 損傷，保護(hù)神經(jīng)元。但是，電針是如何由刺激通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮上述作用的尚不清楚。

6應(yīng)用Bax基因敲除小鼠使研究深化

因Bax 蛋白的抗凋亡效應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞存活, Bax基因敲除對(duì)整體動(dòng)物發(fā)育和生理功能的影響也受到了人們的關(guān)注。Sun W等[72-73]觀察了Bax 基因敲除小鼠中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元對(duì)新生兒坐骨神經(jīng)切斷的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞程序性的死亡被凋亡基因 Bax介導(dǎo)。Kim TW等[74]觀察了Bax 基因缺陷小鼠海馬齒狀回中的自發(fā)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞情況。Suzuki H等[75]觀察了Bax 基因缺陷小鼠的背根神經(jīng)節(jié)中的感覺神經(jīng)元的表征。Shi J等[76]觀察了Bax 基因缺陷小鼠所致神經(jīng)缺血損傷與電壓門控性鉀通道調(diào)節(jié)有關(guān)。應(yīng)用Bax基因敲除小鼠使研究得到了深化。

7研究假說與思路

電針腎俞、膈俞、百會(huì)穴抑制腦I/R損傷小鼠模型的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，可能是通過JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)線粒體通路的不同環(huán)節(jié)，抑制細(xì)胞質(zhì)JNK活化，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，抑制AIF的釋放，抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，并達(dá)到JNK抑制劑sp600125抗海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡高、中、低能力的某個(gè)水平。因此，本研究擬從腦組織、腦功能、腦線粒體形態(tài)和功能等多個(gè)層面，通過電針刺激腦I/R損傷后的Bax基因敲除小鼠，采用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)免疫組化以及流式細(xì)胞術(shù)(FCM)定量檢測(cè)大腦皮層及海馬細(xì)胞的凋亡情況，采用免疫組化方法檢測(cè)皮層及海馬神經(jīng)元細(xì)胞AIF水平，光鏡和電鏡觀察線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，激光共聚焦顯微鏡結(jié)合熒光分子探針技術(shù)檢測(cè)腦線粒體Ca2+以及線粒體代謝功能，同時(shí)采用RT-PCR和western blot檢測(cè)皮層與海馬組織中Bcl-2和Bax的表達(dá)，研究I/R損傷誘導(dǎo)腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)線粒體通路機(jī)制，以及電針組穴的調(diào)控作用。試圖從JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)線粒體通路的不同環(huán)節(jié)—I/R模型、I/R特征、JNK活化、Bcl-2與Bax平衡、AIF釋放、細(xì)胞凋亡結(jié)果的多個(gè)層次，探討電針調(diào)控腦I/R損傷海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)caspase非依賴的線粒體通路機(jī)制。電針抑制凋亡JNK線粒體途徑的研究假說與思路見圖5。

圖5　電針抑制凋亡JNK線粒體途徑的研究假說與思路

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(本文編輯：習(xí)沙)

※項(xiàng)目來源：國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)資助項(xiàng)目(編號(hào)：81373731)

1河北醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)中西醫(yī)結(jié)合本科生，河北石家莊050031

Research design of regulation of electroacupuncture on the mitochondrial JNK signal pathway in cerebral ischemia-reperfusion mice with Bax gene knockoutZHAOJianxin*,TIANYuanxiang，RANQingzhi.*DepartmentofAcupunctureandMoxibustion,ThirdHospitalAffiliatedtoBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029

【Abstract】ObjectiveTo study the research design of regulation of electroacupuncture on the mitochondrial JNK signal pathway in cerebral ischemia-reperfusion (I/R) mice with Bax gene knockout. Methods The research design was proved and explained by mean of research hypothesis with reference literature combined with previous research results. Results Nerve cells apoptosis can be induced by cerebral I/R injury. This signal transduction processes involve more than one gene expression and the interaction. The cell apoptosis mediated by JNK signal pathway play an important role in cerebral I/R injury. The tumor necrosis factor α(TNF-α) and interleukin 8 (IL-8) was the marker for cerebral I/R. Electroacupuncture can inhibit the apoptosis of nerve cells, reduce cerebral I/R injury, protect neurons. The application of Bax gene knockout made deepened the study. Conclusion This study illustrate the mechanism of the regulation and controlling of electroacupuncture on the JNK signal transduction caspase-independent mitochondrial pathways in cerebral I/R hippocampus neuron apoptosis which based on the Bax gene knockout mice, and explained from different aspects level covers the I/R model, I/R feature, JNK activation, the balance of Bcl-2 and Bax, AIF release and cell apoptosis.

【Key words】Cerebral ischemia; Reperfusion injury; Disease model; Animal; Acupuncture; Mitochondrion; Cell apoptosis; Interleukin

(收稿日期：2015-05-06)

作者簡(jiǎn)介：趙建新(1968—)，女，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，博士。從事針灸臨床工作。研究方向：缺血再灌注損傷。

通訊作者：△中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100700

【中圖分類號(hào)】R743.31；R965.1；R-3；R743.31；R78；R245

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-2619(2015)12-1868-08

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2015.12.033