地刷子石松提取物對免疫抑制小鼠血清中NO含量及NOS活性的影響*

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地刷子石松提取物對免疫抑制小鼠血清中NO含量及NOS活性的影響*

**通訊作者，E-mail:biner70@sina.com

王嬌，張涵淇，崔圓圓,胡鑫，王德彬**

(中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430074)

摘要：目的 研究地刷子石松乙酸乙酯提取物對免疫抑制小鼠血清中一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合酶(NOS)活性的影響。方法以環(huán)磷酰胺腹腔注射小鼠建立免疫抑制模型，以香菇菌多糖為陽性組，以50、100、200mg/kg的石松乙酸乙酯提取物為實(shí)驗(yàn)組，1次/d，連續(xù)給藥10d，末次給藥2h后檢測血清中NO含量及TNOS活性。結(jié)果地刷子石松乙酸乙酯提取物能顯著降低小鼠血清中TNOS活性及NO含量。結(jié)論地刷子石松乙酸乙酯提取物可能通過抑制小鼠TNOS活力來抑制NO的細(xì)胞毒作用，從而增強(qiáng)小鼠的免疫功能。

關(guān)鍵詞：地刷子石松；免疫抑制小鼠；一氧化氮；一氧化氮合酶

地刷子石松為含地刷子堿、石松堿及多種三萜類化合物的石松科石松屬植物，其主要用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、舒筋活絡(luò)，此外，它對肺熱咳嗽、肌肉痙攣、跌打損傷、瘡癰腫毒等也有一定的治療作用。關(guān)于石松屬植物的免疫調(diào)節(jié)功能少見文獻(xiàn)報(bào)道。大量實(shí)驗(yàn)表明，環(huán)磷酰胺可通過抑制小鼠的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答來抑制小鼠的免疫功能。故本實(shí)驗(yàn)以環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠建立免疫抑制模型，探討地刷子石松乙酸乙酯提取物對免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，從而為該類植物的應(yīng)用和開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種雌、雄小鼠各30只，體質(zhì)量18～22g，購于武漢生物制品研究所，動(dòng)物許可證號：SCXK(鄂)2012-0003。

1.1.2藥品及儀器環(huán)磷酰胺(阿拉丁試劑有限公司)，香菇菌多糖片(湖北廣仁藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：131003)，NO試劑盒(碧云天試劑有限公司)，NOS試劑盒(南京建成生物工程研究所)，M200型酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)，UV-1800PC紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜儀器有限公司，生產(chǎn)批號：20141230)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理將60只小鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為正常組、模型組、陽性給藥組和藥物低、中、高濃度實(shí)驗(yàn)組。除正常組外，其余各組均在實(shí)驗(yàn)的第1、2、3d腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液(80mg/kg)，正常組在實(shí)驗(yàn)第1、2、3d腹腔注射相同體積的生理鹽水。從實(shí)驗(yàn)第1d起各實(shí)驗(yàn)組灌胃不同濃度(50、100和200mg/kg)的地刷子石松乙酸乙酯提取物，陽性藥組灌胃100mg/kg香菇菌多糖溶液，正常組和模型組灌胃相同體積的生理鹽水。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取血連續(xù)灌胃10d，末次給藥2h后所有小鼠眼眶摘眼球血于無抗凝劑的EP管中，所有血樣于4℃傾斜靜止放置1～2h至血液自然凝固，收集上層分離出的澄清透明的黃色血清。

1.2.3小鼠脾臟指數(shù)的測定采取脫臼法處死小鼠，解剖后稱量脾臟重量。計(jì)算臟器指數(shù)：脾臟指數(shù)(mg/g)=脾臟重量/實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重量。

1.2.4血清中NO含量測定制作NO標(biāo)準(zhǔn)曲線,以NaNO2為標(biāo)準(zhǔn)品，將NaNO2標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0、1、2、5、10、20、50、100、150、200μmol/L梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取96孔板，吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液50μl,先后加入Griess試劑一、試劑二各50μl，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔，用酶標(biāo)儀測定在550nm波長處的吸光度，并讀取OD值，做回歸曲線，計(jì)算回歸方程。再另取一96孔板，孔中加入50μl待測血清，每個(gè)血清樣品設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，用與前述相同的方法測定OD值。利用回歸方程，計(jì)算NaNO2的濃度，換算成血清中NO含量。

1.2.5血清中總NOS活力的測定 根據(jù)總NOS試劑盒說明書操作，完成總NOS活力的測定，記錄OD值，計(jì)算總NOS活力。

2結(jié)果

不同濃度地刷子石松乙酸乙酯提取物對小鼠脾臟指數(shù)及血清中NO含量、總NOS活力的影響。如表1所示，地刷子石松乙酸乙酯提取物高濃度組脾臟指數(shù)接近于正常組和陽性給藥組，且高、中、低濃度組均與模型組差異顯著，呈劑量依賴關(guān)系；地刷子石松乙酸乙酯提取物對小鼠血清中NO含量、NOS活力的影響也與濃度呈正相關(guān)，中、高濃度組與正常組相差不大，高劑量組更接近于正常組。

與正常組相比，#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001；與模型組相比,*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001

3討論

脂溶性小分子NO是機(jī)體重要的化合物,能激活靶細(xì)胞中的鳥苷酸環(huán)化酶，發(fā)揮生物學(xué)作用。有文獻(xiàn)表明，NO是一種自由基，在動(dòng)物體內(nèi)不僅可以發(fā)揮抗感染和免疫防疫的生理學(xué)作用，還可損傷正常組織或細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，發(fā)揮病理學(xué)作用。NO由NOS催化L-精氨酸合成，NOS包括內(nèi)皮型(eNOS)、神經(jīng)型(nNOS)、誘生型(iNOS)三種同功酶，降低NOS活力可以抑制NO過量產(chǎn)生。研究表明NO能在免疫系統(tǒng)細(xì)胞之間起著信號傳遞的作用[10]。已有實(shí)驗(yàn)[11]表明，在炎癥或免疫抑制的動(dòng)物模型中，NO濃度顯著高于正常組，產(chǎn)生大量誘導(dǎo)性NO的細(xì)胞毒性，在細(xì)胞炎癥的病理反應(yīng)過程中起著主要作用，特征性炎癥癥狀的緩解與NO含量的降低密切相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，模型組血清NO含量及NOS活力與正常組相比，均存在顯著性差異，說明造模成功；陽性給藥組血清NO含量及NOS活力接近正常組，說明陽性藥香菇菌多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠表現(xiàn)出明顯的恢復(fù)作用[12]；地刷子石松乙酸乙酯提取物低、中、高濃度組NOS活力均接近正常組，中、高濃度組NO含量及NOS活力與正常組相比無顯著性差異，且低、中、高濃度組脾臟指數(shù)與模型組相比均存在顯著性差異，且高濃度組明顯接近于正常組，說明地刷子石松乙酸乙酯提取物可明顯提高免疫抑制小鼠的免疫功能。另有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺可使小鼠脾臟萎縮[13]，但本研究結(jié)果中環(huán)磷酰胺組的脾臟指數(shù)明顯高于正常組，這可能與環(huán)磷酰胺濃度較高，小鼠脾臟發(fā)生代償性增生有關(guān)。

綜上所述，地刷子石松乙酸乙酯提取物可能通過抑制血清總NOS活力并最終抑制NO過量產(chǎn)生，降低其對正常組織細(xì)胞的細(xì)胞毒作用而發(fā)揮保護(hù)作用，從而提高免疫抑制小鼠的免疫功能，提示地刷子石松乙酸乙酯提取物具有免疫增強(qiáng)作用，且在一定濃度范圍內(nèi)，其免疫增強(qiáng)作用與濃度呈正相關(guān)。

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可能已經(jīng)受到抑制，造模成功；DEM高劑量組的NO含量、NOS活力雖有升高，但小于DEM中劑量組，說明100 mg/kg的DEM不是建模的最佳給藥量；DEM低劑量組、CY低、中劑量組的NO含量及NOS活力均低于正常組，說明造模不成功。

Effects of the Extract from Lycopodium Japonicum on Serum NO Content and NOS Activity in Immunosuppressed Mice

WANG Jiao,ZHANG Han-qi,WANG De-bin,et al

(CollegeofPharmacy，South-CentralUniversityforNationalities,WuhanHubei430074,China)

ABSTRACT：Objective To explore the effect of the extract from Lycopodium japonicum on serum content of nitric oxide (NO) and the activity of total nitric oxide synthase (NOS) in immunosuppressed mice. Methods The immunosuppressed model was built by intraperitoneal injection with cyclophosphamide.With lentinan as a positive control，the ethyl acetate extract from Lycopodium japonicum was administrated daily for 10 days by gavage at the doses of 50,100 and 200mg/kg，respectively.2 hours later after the last administration，the serum was collected and the NO content and NOS activity were determined.Results The serum content of NO and the activity of NOS in immunosuppressive mice of test groups were significantly reduced as compared to control group.Conclusion The ethyl acetate extract from Lycopodium japonicum can enhance the immunity of mice by inhibiting the activity of NOS and the content of NO.

KEY WORDS：Lycopodium japonicum；Immunosuppressed mice；Nitric oxide；Nitric oxide synthase

(收稿日期：2015-07-10)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2015.06.0463

中圖分類號：R967

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：2095-4646(2015)06-0463-03

*基金項(xiàng)目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(CZY15019)；中南民族大學(xué)十二五“民族藥學(xué)”國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心項(xiàng)目