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    bcr/abl基因特異性小干擾RNA對K562細(xì)胞增殖凋亡和SH2肌醇磷脂酶基因表達(dá)的影響研究

    2015-02-24 01:58:54劉小軍潘玉夏王興哲尚銀濤楊敬慈羅建民
    中國全科醫(yī)學(xué) 2015年24期
    關(guān)鍵詞:肌醇空白對照特異性

    劉小軍,楊 琳,潘玉夏,王興哲,尚銀濤,王 茜,楊敬慈,羅建民

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    ·論著·

    bcr/abl基因特異性小干擾RNA對K562細(xì)胞增殖凋亡和SH2肌醇磷脂酶基因表達(dá)的影響研究

    劉小軍,楊 琳,潘玉夏,王興哲,尚銀濤,王 茜,楊敬慈,羅建民

    目的 通過小干擾RNA(siRNA)沉默K562細(xì)胞bcr/abl基因使SH2肌醇磷脂酶(SHIP)基因表達(dá)增加,探討SHIP基因缺失對K562細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制。方法 構(gòu)建bcr/abl基因的化學(xué)合成siRNA,并轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞,分為轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組、轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組、空白對照組。Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞p210表達(dá)量,實(shí)時熒光定量PCR(FQ-RT-PCR)檢測各組細(xì)胞中SHIP mRNA表達(dá)量;Western blotting法檢測SHIP、磷酸化蛋白激酶B 308(p-Akt308)和磷酸化蛋白激酶B 473(p-Akt473)的表達(dá)量;MTT比色法檢測K562細(xì)胞增殖率;流式細(xì)胞儀檢測K562細(xì)胞凋亡率;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測核因子(NF)-κB活性。結(jié)果 轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞p210表達(dá)量、p-Akt308表達(dá)量、p-Akt473表達(dá)量較空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組降低,SHIP mRNA表達(dá)量、SHIP表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率較空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組升高(P<0.05);空白對照組與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組K562細(xì)胞p210表達(dá)量、SHIP mRNA表達(dá)量、SHIP表達(dá)量、p-Akt308表達(dá)量、p-Akt473表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。第1天、第3天、第5天轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞增殖率較空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組降低(P<0.05);空白對照組與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組K562細(xì)胞增殖率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。第3天、第5天轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組NF-κB活性較空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組降低(P<0.05);空白對照組與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組NF-κB活性比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 SHIP基因表達(dá)受bcr/abl基因的調(diào)控,SHIP表達(dá)缺失可能是K562細(xì)胞過度增殖和凋亡減少的重要因素。

    白血??;基因,bcr/abl;RNA,小分子干擾;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

    劉小軍,楊琳,潘玉夏,等.bcr/abl基因特異性小干擾RNA對K562細(xì)胞增殖凋亡和SH2肌醇磷脂酶基因表達(dá)的影響研究[J].中國全科醫(yī)學(xué),2015,18(24):2934-2938,2945.[www.chinagp.net]

    Liu XJ,Yang L,Pan YX,et al.Effects of siRNA against bcr/abl on expression of SHIP and the proliferation and apoptosis of K562[J].Chinese General Practice,2015,18(24):2934-2938,2945.

    人類SH2肌醇磷脂酶(SHIP)基因位于染色體2q36-q37.1,屬肌醇5′磷酸酶家族,主要在造血細(xì)胞表達(dá)。其編碼的145 KD蛋白為一種含有SH2結(jié)構(gòu)域的肌醇磷酸酶,能選擇性去除肌醇-1,3,4,5-四磷酸(IP4)和肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)的5′-磷酸,從而負(fù)調(diào)控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。SHIP-/-小鼠會出現(xiàn)外周血白細(xì)胞計數(shù)異常增高、脾臟增大及肺部中性粒細(xì)胞浸潤,與人類慢性粒細(xì)胞性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML) 相似[1]。在一系列bcr/abl轉(zhuǎn)化的小鼠造血細(xì)胞系、Ph陽性細(xì)胞系及來源于CML患者的原代細(xì)胞與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或bcr/abl陰性的CML細(xì)胞系相比,SHIP表達(dá)明顯減少甚至缺失[2];abl特異性抑制劑——CGP57148B(STI571)能很快恢復(fù)SHIP的表達(dá)[3],表明bcr/abl能直接且可逆地抑制SHIP表達(dá)。已證實(shí)abl轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中存在PIP3聚集,abl原癌基因激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不僅通過增加PIP3的合成,還能通過阻斷PIP3降解起作用[4]。本課題組前期研究已證實(shí),在K562細(xì)胞中SHIP表達(dá)缺失,且bcr/abl的表達(dá)抑制SHIP的表達(dá)[5]。本研究旨在利用小干擾RNA(siRNA)特異性封閉bcr/abl的表達(dá),探討SHIP基因功能丟失與白血病發(fā)病的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑 K562細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存;針對bcr/abl基因的siRNA按文獻(xiàn)[6]由武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司合成;Ficoll淋巴細(xì)胞分離液、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑(RNAsin)、dNTP、隨機(jī)六聚體引物均購自Promega公司;標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)購自HyClone公司;Caspase-3熒光底物Z-DEVD-AFC購自Novabiochem-Calbiochem公司;碘化丙啶(PI)、核糖核酸酶A(RNase A)購自Sigma公司;實(shí)時熒光定量PCR(FQ-RT-PCR)試劑盒(針對bcr/abl和SHIP)由達(dá)安基因股份有限公司設(shè)計合成。SHIP引物序列:上游引物:5′-GCATTGCCCTTCGGTTAG-3′,下游引物:5′-TCATCACGCTCCGTCTTC-3′;探針:5′-FAM-ACATCA

    本研究創(chuàng)新點(diǎn):

    慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)是當(dāng)前影響人類健康的一類重大疾病,一旦進(jìn)入加速急變期將很難有挽救的機(jī)會,目前能根治的手段只有骨髓移植,蛋白酪氨酸酶抑制劑可有效控制病情,但難以治愈,且隨時面臨耐藥問題,此兩種手段給患者造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也較大。因而進(jìn)一步明確其發(fā)病機(jī)制,尋找新的靶點(diǎn)是當(dāng)前緊要任務(wù)。bcr/abl是導(dǎo)致CML患者細(xì)胞成熟受阻的主要原因,然而對其下游傳導(dǎo)通路及導(dǎo)致細(xì)胞成熟受阻的概率仍不十分明確,為此有必要進(jìn)一步研究以明確發(fā)病機(jī)制。SH2肌醇磷脂酶(SHIP)是調(diào)控三磷酸肌醇代謝的重要調(diào)控酶,對細(xì)胞的增殖和凋亡有重要影響,已有研究表明其在CML中存在量和質(zhì)的變化,SHIP在CML中是否參與了疾病的形成尚未完全明了。本實(shí)驗(yàn)通過干擾RNA特異性封閉了bcr/abl基因的表達(dá),進(jìn)而觀察其下游信號通路上SHIP的表達(dá),并通過觀察增殖凋亡及核因子(NF)-κB活性,得出SHIP基因表達(dá)受bcr/abl的調(diào)控,SHIP表達(dá)缺失可能是bcr/abl陽性細(xì)胞過度增殖和凋亡減少的重要因素。

    CTCACCGCTTCACGCACC-TAMRA-3′,片段長度166 bp。鼠抗人SHIP單克隆抗體、磷酸化Akt308(p-Akt308)抗體、磷酸化Akt473(p-Akt473)抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染 K562細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,加入青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml),在37 ℃,含5%CO2、飽和濕度條件孵育,每2~3 d換用新鮮培養(yǎng)液。將不超過5代的生長對數(shù)期K562細(xì)胞以1 500 r/min離心5 min(離心半徑16 cm),用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,去除培養(yǎng)液,取約1×107細(xì)胞放入電轉(zhuǎn)杯無菌密封后以250 V、900 μF進(jìn)行電轉(zhuǎn)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)分組 轉(zhuǎn)染成功后重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),分為轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組、轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組、空白對照組。轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染特異性針對bcr/abl基因的siRNA;轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組轉(zhuǎn)染非特異性siRNA序列;空白對照組不轉(zhuǎn)染任何載體的K562細(xì)胞。

    1.4 FQ-RT-PCR和Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染效果 FQ-RT-PCR檢測bcr/abl基因表達(dá):Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計定量。取4 μl mRNA加入試劑盒反轉(zhuǎn)錄,取5 μl mRNA進(jìn)行定量擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下:93 ℃ 2 min;93 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,40個循環(huán)。GENE 5700軟件分析結(jié)果,結(jié)果計算按公式:A(拷貝數(shù)/μg總RNA)=B(拷貝數(shù)/μl cDNA)÷樣本RNA的OD260值×1.05。

    Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞p210表達(dá)量:收集轉(zhuǎn)染后72 h細(xì)胞,提取總蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)膜,室溫封閉,單克隆c-abl一抗4 ℃反應(yīng)過夜,洗膜,二抗室溫孵育,洗膜,化學(xué)發(fā)光法檢測后分析結(jié)果。

    1.5 FQ-RT-PCR和Western blotting法檢測細(xì)胞中SHIP mRNA表達(dá)及SHIP、p-Akt308、p-Akt473表達(dá)量 收集轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞,F(xiàn)Q-RT-PCR檢測各組細(xì)胞中SHIP mRNA表達(dá)量;收集轉(zhuǎn)染后72 h細(xì)胞,Western blotting法檢測各組細(xì)胞中SHIP、p-Akt308和p-Akt473表達(dá)量,β-actin為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.6 MTT比色法檢測K562細(xì)胞增殖率 各組調(diào)整細(xì)胞密度至1×104/ml,接種于96孔無菌培養(yǎng)板中,200 μl/孔。設(shè)6個復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每日取出1板,加入MTT溶液20 μl(10 mg/ml),孵育4 h后應(yīng)用平板離心機(jī)3 000 r/min離心10 min(離心半徑1.35 cm),棄上清液,再加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)終止反應(yīng),應(yīng)用全自動酶標(biāo)儀測570 nm處OD值。以轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組OD值比空白對照組OD值的比值反映細(xì)胞增殖率。分別于第0、1、3、5天收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行檢測,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.7 流式細(xì)胞儀檢測K562細(xì)胞凋亡率 收集轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞,PBS洗滌2次,加無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml,取100 μl細(xì)胞懸液于1.5 ml EP管中,分別加入Annexin V-FITC 5 μl和20 μg/ml PI溶液10 μl,混勻后室溫避光孵育15 min,然后加入PBS 400 μl,采用流式細(xì)胞儀檢測K562細(xì)胞凋亡率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.8 核因子(NF)-κB活性測定 收集細(xì)胞,按照上??党缮锕こ逃邢薰続rrayStarTMNF-κB活性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒說明書操作步驟提取細(xì)胞核蛋白,用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。每孔取樣本20 μg采用ELISA法定量檢測NF-κB活性。在0.5 ml離心管中采用完全DNA結(jié)合緩沖液準(zhǔn)備成總體積為55 μl的反應(yīng)體系,用于檢測。預(yù)先標(biāo)記特定的寡核苷酸κB序列5′-GGGACTTTCC-3′。一抗為NF-κB活性形式的p65亞基抗體(1∶1 000),二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體(1∶1 000)。用分光光度計于450 nm波長測定NF-κB活性。分別于第0、1、3、5天收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行檢測,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2 結(jié)果

    2.1 Western blotting法檢測各組K562細(xì)胞p210表達(dá)量 轉(zhuǎn)染72 h后,Western blotting法檢測各組K562細(xì)胞p210表達(dá)量,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞p210表達(dá)量較空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);空白對照組與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組K562細(xì)胞p210表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表1)。

    表1 各組K562細(xì)胞p210表達(dá)量比較

    注:siRNA=小干擾RNA;與轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組比較,aP<0.05

    2.2 FQ-RT-PCR法檢測各組K562細(xì)胞SHIP mRNA表達(dá)量 轉(zhuǎn)染48 h后,F(xiàn)Q-RT-PCR檢測各組K562細(xì)胞SHIP mRNA表達(dá)量,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞SHIP mRNA表達(dá)量較空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);空白對照組與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組K562細(xì)胞SHIP mRNA表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

    2.3 Western blotting法檢測各組K562細(xì)胞SHIP、p-Akt308和p-Akt473表達(dá)量 轉(zhuǎn)染72 h后,Western blotting法檢測各組K562細(xì)胞SHIP表達(dá)量,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞SHIP表達(dá)量較空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組升高,p-Akt308和p-Akt473表達(dá)量較空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);空白對照組與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組K562細(xì)胞SHIP、p-Akt308和p-Akt473表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表3,圖1~2)。

    2.4 各組不同時間K562細(xì)胞增殖率比較 第1天、第3天、第5天轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞增殖率較空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);空白對照組與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組K562細(xì)胞增殖率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表4)。

    表2 各組K562細(xì)胞SHIP mRNA表達(dá)量比較拷貝,n=3)

    注:SHIP=SH2肌醇磷脂酶;與轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組比較,aP<0.05

    Table 3 Comparison of expression of SHIP,p-Akt308 and p-Akt473 of K562 cells in each group

    組別SHIPp-Akt308p-Akt473空白對照組0.037±0.003a0.086±0.001a0.084±0.003a轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組0.047±0.010a0.099±0.001a0.088±0.003a轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組0.420±0.0090.024±0.0010.018±0.000F值2255.8163538.780987.548P值<0.001<0.001<0.001

    注:p-Akt308=磷酸化蛋白激酶B 308,p-Akt473=磷酸化蛋白激酶B 473;與轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組比較,aP<0.05

    注:siRNA=小干擾RNA,SHIP=SH2肌醇磷脂酶

    圖1 Western blotting法檢測各組K562細(xì)胞SHIP表達(dá)量

    Figure 1 Expression of SHIP in K562 cells shown by the Western blotting method in each group

    注:p-Akt308=磷酸化蛋白激酶B 308,p-Akt473=磷酸化蛋白激酶B 473

    圖2 Western blotting法檢測各組K562細(xì)胞p-Akt308和p-Akt473表達(dá)量

    Figure 2 Expression of p-Akt308 and p-Akt473 in K562 cells shown by the Western blotting method in each group

    Table 4 Comparison of proliferation rates of K562 cells in each group at different time points

    組別第0天第1天第3天第5天空白對照組100.0100.0a100.0a100.0a轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組100.0±4.0102.3±3.3a99.0±2.1a100.0±2.8a轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組100.0±3.593.3±3.670.3±1.682.0±4.4F值0.0688.055370.58937.336P值0.9350.020<0.001<0.001

    注:與轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組比較,aP<0.05

    2.5 各組K562細(xì)胞凋亡率比較 轉(zhuǎn)染48 h后,流式細(xì)胞儀檢測顯示,轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞凋亡率較空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);空白對照組與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組K562細(xì)胞凋亡率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表5、圖3)。

    圖3 流式細(xì)胞儀檢測各組K562細(xì)胞凋亡率

    Figure 3 Apoptosis rate of K562 cells shown by flow cytometry in each group

    2.6 各組不同時間NF-κB活性比較 第0天、第1天3組NF-κB活性比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。第3天、第5天轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組NF-κB活性較空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);空白對照組與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組NF-κB活性比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表6)。

    表5 各組K562細(xì)胞凋亡率比較

    注:與轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組比較,aP<0.05

    Table 6 Comparison of the activity of NF-κB in each group at different time points

    組別第0天第1天第3天第5天空白對照組0.189±0.0090.183±0.0070.188±0.004a0.190±0.003a轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組0.196±0.0110.187±0.0010.186±0.004a0.190±0.004a轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組0.186±0.0150.173±0.0090.135±0.0110.152±0.006F值0.5890.36153.26367.324P值0.5840.711<0.001<0.001

    注:與轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組比較,aP<0.05

    3 討論

    研究顯示,bcr/abl是CML和部分急性淋巴細(xì)胞白血病的致病基因,其編碼的融合蛋白p210具有持續(xù)酪氨酸激酶活性[7],被認(rèn)為是CML發(fā)病的一個重要原因。格列衛(wèi)作為酪氨酸激酶抑制劑,在CML的治療中起重要作用,但格列衛(wèi)耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)迫使學(xué)者尋找新的治療方案。在bcr/abl活化的信號路徑中尋找新的突破點(diǎn)是一個良好的選擇。PI3K/Akt是bcr/abl下游的一條重要通路,在CML發(fā)病中起關(guān)鍵作用。

    人類SHIP基因是繼與張力蛋白同源的10號染色體缺失的磷酸酶基因(PTEN)之后發(fā)現(xiàn)的又一肌醇5′磷酸酶家族成員,僅限于造血細(xì)胞表達(dá),其主要功能是特異性降解PIP3的5′磷酸成PI(3,4)P2,在Akt活化及維持細(xì)胞存活和對抗細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)功能[5]。敲除SHIP基因(SHIP-/-)小鼠出現(xiàn)類似CML樣的髓系細(xì)胞高度增殖、肝脾腫大及肺部髓系細(xì)胞浸潤;2003年,羅建民等[8]報道了,CML患者存在SHIP基因的功能結(jié)構(gòu)域遺傳學(xué)突變。隨后張?zhí)K江等[9]也在急性隨細(xì)胞白血病中發(fā)現(xiàn)了兩種SHIP基因突變(A>T,Q1154L Q1153L),SHIP基因在淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病中的作用尚不完全清楚。本課題前期研究發(fā)現(xiàn),SHIP基因在CML患者中表達(dá)明顯降低,尤其在CML急變期患者表達(dá)減低更為明顯;siRNA封閉bcr/abl能恢復(fù)K562細(xì)胞SHIP表達(dá)[5]。這些研究提示SHIP基因在CML發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。然而,SHIP重新表達(dá)是否參與了p210對細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化尚不清楚。

    NF-κB位于PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游,在CML的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[9]。NF-κB活化后,不僅可以調(diào)節(jié)與細(xì)胞生長和增殖相關(guān)基因的表達(dá),更重要的是,還可上調(diào)凋亡抗性分子bcl-2、bcl-xL等基因的表達(dá),從而使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡,成為腫瘤細(xì)胞生存的關(guān)鍵因素;相反,抑制NF-κB活性,則能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤的生長。Gloire等[10]報道,SHIP能通過抑制NF-κB活性而抑制凋亡。

    本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染特異性siRNA實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞p210表達(dá)量較空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組降低,SHIP表達(dá)量升高,細(xì)胞增殖率顯著受抑,細(xì)胞凋亡率增加;同時,K562細(xì)胞p-Akt308和p-Akt473表達(dá)量下調(diào),其下游的NF-κB活性亦下調(diào)。表明,靶向干擾bcr/abl基因的表達(dá)可使K562細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與SHIP重新表達(dá),下調(diào)p-Akt表達(dá)量和NF-κB活性有關(guān)。提示SHIP基因表達(dá)缺失與K562細(xì)胞p-Akt高表達(dá)密切相關(guān)。雖然目前結(jié)果尚不能完全推斷此變化沒有bcr/abl 功能缺失其他因素的參與,但提示SHIP的表達(dá)變化可能參與了CML的發(fā)生發(fā)展。故構(gòu)建穩(wěn)定的攜帶SHIP基因載體進(jìn)一步研究SHIP基因在CML中的作用,有可能為CML提供潛在的新治療靶點(diǎn)。

    綜上所述,SHIP表達(dá)量減低很可能是CML發(fā)生發(fā)展中的重要一環(huán)。bcr/abl 基因可通過下調(diào)SHIP表達(dá)量,進(jìn)而影響下游Akt的磷酸化以及NF-κB活性等一系列與增殖凋亡相關(guān)的信號蛋白,參與CML形成。本研究不足之處在于僅進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn),今后將進(jìn)一步在實(shí)驗(yàn)動物上進(jìn)行活體實(shí)驗(yàn),以得到更貼切的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

    [1]Yang L,Luo JM,Liu XJ,et al.The mechanism for SHIP gene to induce the apoptosis of human leukemia cell line K562[J].Acta Physiologica Sinica,2009,61(2):146-154.(in Chinese) 楊琳,羅建民,劉小軍,等.SHIP基因誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株K562凋亡及其機(jī)制[J].生理學(xué)報,2009,61(2):146-154.

    [2]Jiang X,Stuible M,Chalandon Y,et al.Evidence for a positive role of SHIP in the BCR-ABL-mediated transformation of primitive murine hematopoietic cells and in human chronic myeloid leukemia[J].Blood,2003,102(8):2976-2984.

    [3]任金海,羅建民,楊敬慈,等.白血病細(xì)胞內(nèi)SHIP基因表達(dá)及其對AKT磷酸化的影響[J].中華血液學(xué)雜志,2007,28(12):844-845.

    [4]Kharas MG,Fruman DA.ABL oncogenes and phosphoinositide 3-kinase:mechanism of activation and downstream effectors[J].Cancer Res,2005,65(6):2047-2053.

    [5]Liu XJ,Luo JM,Yang L,et al.Expression changes of SHIP1 and the possible mechanism in the chronic mylogenous leukemia[J].Med J Chin PLA,2008,33(6):701-703.(in Chinese) 劉小軍,羅建民,楊琳,等.慢性粒細(xì)胞性白血病中SHIP1基因的表達(dá)變化及機(jī)制探討[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2008,33(6):701-703.

    [6]Withey JM,Marley SB,Kaeda J,et al.Targeting primary human leukaemia cells with RNA interference:Bcr-Abl targeting inhibits myeloid progenitor self-renewal in chronic myeloid leukaemia cells[J].Br J Haematol,2005,129(3):377-380.

    [7]Hoy SM.Ponatinib:a review of its use in adults with chronic myeloid leukaemia or Philadelphia chromosome-positiveacute lymphoblastic leukaemia[J].Drugs,2014,74(7):793-806.

    [8]Luo JM,Liu ZL,Hao HL,et al.Mutation analysis of SHIP gene in acute leukemia[J].Chin J Hematol,2004,25(7):385-388.(in Chinese) 羅建民,劉澤林,郝洪嶺,等.急性白血病細(xì)胞SHIP基因的突變分析[J].中華血液學(xué)雜志,2004,25(7):385-388.

    [9]Zhang SJ,Li JY,Shi JY,et al.Study of mutation and single nucleotide polymorphism of PDGFRβ and SHIP gene in acute myeloid leukemia[J].Chin J Hematol,2006,27(6):383-385.(in Chinese) 張?zhí)K江,李建勇,施靜藝,等.急性髓系白血病患者PDGFRβ和SHIP基因突變及其單核苷酸多態(tài)性研究[J].中華血液學(xué)雜志,2006,27(6):383-385.

    [10]Gloire G,Charlier E,Rahmouni S,et al.Restoration of SHIP-1 activity in human leukemic cells modifies NF-kappaB activation pathway and cellular survival upon oxidative stress[J].Oncogene,2006,25(40):5485-5494.

    (本文編輯:陳素芳)

    Effects of siRNA Against bcr/abl on Expression of SHIP and the Proliferation and Apoptosis of K562

    LIUXiao-jun,YANGLin,PANYu-xia,etal.

    DepartmentofHematology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

    Objective Through silence the expression of bcr/abl with siRNA to increase the expression of SHIP so that we can study the influence of SHIP gene expression to the proliferation and apoptosis of K562 together with its possible mechanism. Methods Construct synthetic siRNA specific to bcr/abl fusion gene and tranfect it into cell line K562, non-specific siRNA trasfected group and untreated group were used as control,then Western blotting was employed to detect the expression of p210,SHIP and level of p-Akt(308,437),SHIP mRNA level was detected through FQ-RT-PCR, proliferation of K562 through MTT, and apoptosis of K562 through flow cytometre, NF-κB activity was examined through ELISA. Results fter transfected with siRNA specific to bcr/abl,the expression of p210, p-Akt308,p-Akt473 was dramatically decreased in the bcr-abl-specific siRNA transfected group compare to the non-specific transfected control and untreated group of K562 cells,while the SHIP mRNA, protein expression, apoptosis rate increased in bcr-abl-specific transfected K562 cells compare to the other two control groups(P<0.05). All these changes were not detected between the non-specific transfected group and untreated group of K562 cells(P>0.05). The proliferation decreased in the bcr-abl-specific transfected group compare to the other two controls on day 1,day 3 and day 5 respectively(P<0.05), but no significance was found between the two control groups(P>0.05). NF-κB activity decreased in bcr-abl-specific transfected group compare to the other two control groups on day 3 and day 5(P<0.05),but no significance was found between the two control groups(P>0.05). Conclusion Our results suggested that SHIP expression is controlled by bcr/abl. Reduced expression of SHIP partly responsible for the increased proliferation and decreased apoptosis of bcr/abl positive cells.

    Leukemia;Genes,bcr/abl;RNA,small interfering;Cell proliferation;Apoptosis

    國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30240011);河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2007000858);衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)基金(201202017)

    050000 河北省石家莊市,河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科,河北省血液病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

    羅建民,050000 河北省石家莊市,河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科,河北省血液病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;

    E-mail:luojm315@163.com

    R 733.7

    A

    10.3969/j.issn.1007-9572.2015.24.013

    2015-01-23;

    2015-06-27)

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