• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用

    2015-02-24 01:57:29黃嘯元代林志徐偉華王業(yè)忠
    中國(guó)全科醫(yī)學(xué) 2015年24期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛛網(wǎng)膜下腔

    黃嘯元,趙 冬,劉 祺,許 暉,戴 晶,代林志,徐偉華,王業(yè)忠

    ?

    ·論著·

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用

    黃嘯元,趙 冬,劉 祺,許 暉,戴 晶,代林志,徐偉華,王業(yè)忠

    目的 探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)的表達(dá)及其在蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后早期腦損傷(EBI)中的作用。方法 選取健康雄性SD大鼠78只,采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白對(duì)照組(6只)、假手術(shù)組(36只)與SAH組(36只)。將假手術(shù)組和SAH組分別于1、6、12、24、48、72 h,采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法選取6只大鼠處死。比較各組不同時(shí)間點(diǎn)光鏡及電鏡下大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)改變、CHOP相對(duì)表達(dá)水平、海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。結(jié)果 3組大鼠6、12、24、48 h時(shí)CHOP相對(duì)表達(dá)水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)CHOP相對(duì)表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.05)。空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)CHOP相對(duì)表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)??瞻讓?duì)照組與假手術(shù)組僅有極少數(shù)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞;SAH組1 h海馬神經(jīng)元未見(jiàn)明顯凋亡改變;SAH組6、12 h海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞較前增多,部分散在的海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色;SAH組24 h海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞明顯增多;SAH組48 h海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞逐漸減少,72 h可見(jiàn)少量海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞。3組大鼠6、12、24、48 h時(shí)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平均高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.01)??瞻讓?duì)照組和假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。空白對(duì)照組、假手術(shù)組及SAH組大鼠實(shí)驗(yàn)前神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組大鼠6、12、24、48 h時(shí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均低于空白對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.01)??瞻讓?duì)照組和假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SAH組CHOP相對(duì)表達(dá)水平與海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平呈正相關(guān)(r=0.933,P<0.01)。結(jié)論 SAH后早期CHOP表達(dá)增高,海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞增多,神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低,提示CHOP在SAH后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

    蛛網(wǎng)膜下腔出血;腦損傷;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白類;血管痙攣,顱內(nèi);細(xì)胞凋亡

    黃嘯元,趙冬,劉祺,等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2015,18(24):2911-2916,2921.[www.chinagp.net]

    Huang XY,Zhao D,Liu Q,et al.Effects of endoplasmic reticulum stress-induced transcriptional factor CHOP on early brain injury after subarachnoid hemorrhage[J].Chinese General Practice,2015,18(24):2911-2916,2921.

    自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是一種臨床常見(jiàn)的急性腦血管疾病,該病致殘率和病死率較高。盡管目前診斷技術(shù)、顯微外科技術(shù)以及介入治療技術(shù)發(fā)展迅速,但其預(yù)后并未明顯改善。近期研究表明,造成SAH患者預(yù)后差的主要原因可能為早期腦損傷( early brain injury,EBI)[1]。EBI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,包括:神經(jīng)血管炎癥、血-腦脊液屏障破壞、腦損傷和腦水腫、急性腦血管痙攣(CVS)、微循環(huán)功能障礙和細(xì)胞凋亡等[2],其中細(xì)胞凋亡則是EBI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的主要病理生理機(jī)制。Mehmet[3]研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能是細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)凋亡的一個(gè)新場(chǎng)所,因此提出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS) 反應(yīng)性凋亡途徑,而CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白 (C/EBP-homologous protein,CHOP)是ERS介導(dǎo)的凋亡通路中最重要的凋亡信號(hào)分子之一。已有文獻(xiàn)報(bào)道,CHOP在缺血再灌注后細(xì)胞凋亡中起著重要作用[4]。本研究擬通過(guò)觀察SAH后CHOP的表達(dá)水平和SAH后EBI的變化來(lái)探討CHOP在SAH后EBI過(guò)程中所發(fā)揮的作用。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康雄性SD大鼠78只,3~4月齡,體質(zhì)量(290±40)g,由新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白對(duì)照組6只、假手術(shù)組36只與SAH組36只。

    1.2 主要試劑 CHOP單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)abcam公司,內(nèi)參β-actin購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,TUNEL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司,DAB顯色試劑盒購(gòu)自丹麥Dako公司。

    本研究要點(diǎn):

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后早期腦損傷(EBI)發(fā)病機(jī)制的重要組成部分,CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)/GADD153 (生長(zhǎng)停滯因子及DNA損傷基因)是ERS的特異轉(zhuǎn)錄因子,CHOP表達(dá)升高是ERS的標(biāo)志,其在ERS和細(xì)胞凋亡的聯(lián)系中起到重要作用,是一個(gè)舉足輕重的中間信號(hào)分子,目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于ERS相關(guān)因子CHOP在EBI細(xì)胞凋亡中作用的報(bào)道尚少,因此本研究通過(guò)觀察海馬神經(jīng)元內(nèi)CHOP在SAH后海馬組織中表達(dá)的時(shí)相性變化,分析CHOP表達(dá)的變化與海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平之間的關(guān)系,探討CHOP在SAH后EBI過(guò)程中所發(fā)揮的作用,為尋找SAH后EBI的潛在治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 建立大鼠模型 SAH組大鼠每100 g給予35 g/L水合氯醛1 ml腹腔注射麻醉,完全麻醉后分離暴露股動(dòng)脈并穿刺置管,將頭固定于立體定向儀上,取顱頂正中矢狀線切口,逐層分離頭皮,暴露顱骨,于冠狀縫前5 mm,中線旁開3 mm處鉆透露顱骨,顯露額極,挑開硬腦膜,可見(jiàn)清亮腦脊液流出,將PE10導(dǎo)管從額極緊貼前顱窩底向雙耳連線中點(diǎn)送入,進(jìn)入深度約為10 mm,骨蠟封閉骨孔。連接1 ml無(wú)菌注射器,回抽可見(jiàn)清亮腦脊液,取自體動(dòng)脈血0.3 ml,連接導(dǎo)管,在12 s內(nèi)勻速注入大鼠蛛網(wǎng)膜下腔。小心拔出導(dǎo)管,骨蠟封閉骨孔,逐層縫合頭皮,并保持大鼠頭低位30 min。假手術(shù)組除將自體血換為0.3 ml 0.9%氯化鈉溶液注入蛛網(wǎng)膜下腔外,余步驟均與SAH組相同??瞻讓?duì)照組不予任何處理。

    1.3.2 組織固定及處理 造模成功后,將假手術(shù)組和SAH組分別于1、6、12、24、48、72 h,采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法選取6只大鼠處死,斷頭取腦后完整剝離兩側(cè)海馬,一部分迅速放入無(wú)酶EP管中-80 ℃凍存用于免疫印跡法檢測(cè),一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定后常規(guī)HE染色制作切片光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),另一部分放入2.5%戊二醛溶液中固定后由新疆醫(yī)科大學(xué)電鏡室制作切片并觀察大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化??瞻讓?duì)照組大鼠直接處死后,固定及處理方法同上。

    1.3.2.1 免疫印跡法檢測(cè)CHOP相對(duì)表達(dá)水平 各組均稱取30 mg海馬組織,放入不同無(wú)酶EP管中,各加入150 μl裂解液,超聲粉碎組織,4 ℃條件下,13 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm),后取上清液。紫外分光光度計(jì)測(cè)CHOP表達(dá)水平,各組測(cè)3次,取平均值。CHOP變性后,進(jìn)行SDS凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,用5%脫脂奶粉封閉2 h后,加入CHOP抗體(1∶500)及β-actin抗體(1∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜后,加入二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的大鼠抗小鼠二抗IgG)常溫孵育2 h,后TBST洗膜,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色,圖像分析儀測(cè)定各條帶灰度值,將各組CHOP條帶灰度值與相應(yīng)內(nèi)參β-actin條帶灰度值相比,計(jì)算各組CHOP相對(duì)表達(dá)水平。

    1.3.2.2 TUNEL法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平 各組在66 ℃烘片后,常規(guī)脫蠟、水化,20 μg/ml的蛋白酶K消化組織15 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)震洗后,用焦碳酸二乙酯(DEPC)水浸泡45 min,后PBS震洗5 min (3次),滴加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液(酶溶液∶標(biāo)記液=1∶9);37 ℃濕盒中孵育1 h,PBS震洗后滴加過(guò)氧化物酶(POD)轉(zhuǎn)換液,后 37 ℃濕盒中孵育30 min,后PBS震洗5 min(3次),滴加DAB并在鏡下控制顯色程度,清水洗凈后HE復(fù)染,后梯度乙醇溶液脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取不重復(fù)的10個(gè)視野,細(xì)胞核呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞,計(jì)數(shù)視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù),陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%,以陽(yáng)性細(xì)胞率的均值作為海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平。

    1.4 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 各組大鼠均采用加西亞(Garcia)評(píng)分法[5]于實(shí)驗(yàn)前、6、12、24、48、72 h處死前進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,評(píng)分范圍為5~18分,共分6項(xiàng)進(jìn)行評(píng)價(jià):自主活動(dòng)、四肢活動(dòng)對(duì)稱性、前肢伸展活動(dòng)、攀爬能力、本體感覺(jué)、胡須觸碰反射。得分越低表示大鼠神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重。

    2 結(jié)果

    2.1 建立大鼠模型 SAH組中共有2只大鼠因麻醉意外死亡,1只在注血后死亡,及時(shí)補(bǔ)做3只。SAH組大鼠開顱后于大腦willis環(huán)附近蛛網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)大量積血,前循環(huán)處可見(jiàn)血凝塊;假手術(shù)組蛛網(wǎng)膜下腔未見(jiàn)血凝塊(見(jiàn)圖1)。

    注:SAH=蛛網(wǎng)膜下腔出血

    圖1 建立大鼠模型

    Figure 1 Images of the rat models

    2.2 光鏡及電鏡下海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化 光鏡下:空白對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元大小及染色質(zhì)分布均勻;假手術(shù)組海馬神經(jīng)元出現(xiàn)皺縮,細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮明顯;SAH組海馬神經(jīng)元皺縮,出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象。電鏡下:空白對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)飽滿,異染質(zhì)少見(jiàn),細(xì)胞器形態(tài)正常;SAH組1 h可見(jiàn)海馬神經(jīng)元核內(nèi)異染質(zhì)稍增多,細(xì)胞器形態(tài)基本正常;SAH組6 h可見(jiàn)明顯內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒、擴(kuò)張,線粒體腫脹、空泡早期凋亡,廣泛的細(xì)胞水樣變性及腦組織間質(zhì)水腫;SAH組12 h可見(jiàn)細(xì)胞水腫較前消退,但細(xì)胞核內(nèi)異染質(zhì)增多,細(xì)胞膜皺縮明顯,細(xì)胞質(zhì)密度增加;SAH組24 h海馬神經(jīng)元凋亡變化最為明顯,可見(jiàn)細(xì)胞核膜內(nèi)陷、染色質(zhì)固縮邊集、細(xì)胞質(zhì)密度增高、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張;SAH組48 h仍可見(jiàn)細(xì)胞核內(nèi)異染質(zhì)增加,細(xì)胞質(zhì)密度增加;SAH組72 h海馬神經(jīng)元形態(tài)大致正常,與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖2)。

    2.3 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)CHOP相對(duì)表達(dá)水平比較 各組不同時(shí)間點(diǎn)CHOP表達(dá)水平電泳圖見(jiàn)圖3。3組大鼠6、12、24、48 h時(shí)CHOP相對(duì)表達(dá)水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)CHOP相對(duì)表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)??瞻讓?duì)照組和假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)CHOP相對(duì)表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表1)。

    2.4 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平比較 空白對(duì)照組與假手術(shù)組僅有極少數(shù)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞;SAH組1 h海馬神經(jīng)元未見(jiàn)明顯凋亡改變;SAH組6、12 h海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞較前增多,部分散在的海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色;SAH組24 h海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞明顯增多;SAH組48 h海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞逐漸減少,72 h可見(jiàn)少量海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞(見(jiàn)圖4)。3組大鼠6、12、24、48 h時(shí)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平均高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)??瞻讓?duì)照組和假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表2)。

    2.5 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較 空白對(duì)照組、假手術(shù)組及SAH組大鼠實(shí)驗(yàn)前神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組大鼠6、12、24、48 h時(shí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均低于空白對(duì)照組和假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)??瞻讓?duì)照組和假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表3)。

    注:a為空白對(duì)照組神經(jīng)元大小及染色質(zhì)分布均勻(HE染色,×200);b為SAH組海馬神經(jīng)元皺縮,出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象(HE染色,×200);c為空白對(duì)照組海馬神經(jīng)元形態(tài)飽滿,異染質(zhì)少見(jiàn),細(xì)胞器形態(tài)正常(電鏡,×8 000);d為SAH組1 h時(shí)海馬神經(jīng)元核內(nèi)異染質(zhì)稍增多,細(xì)胞器形態(tài)基本正常(電鏡,×8 000);e為SAH組6 h時(shí)明顯內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒、擴(kuò)張,線粒體腫脹、空泡早期凋亡,細(xì)胞質(zhì)密度減低,組織間質(zhì)出現(xiàn)明顯的水樣變性(電鏡,×8 000);f為SAH組12 h時(shí)細(xì)胞核內(nèi)異染質(zhì)增多,細(xì)胞核膜皺縮,細(xì)胞質(zhì)密度較前增高(電鏡,×8 000);g為SAH組24 h時(shí)細(xì)胞核膜內(nèi)陷、染色質(zhì)固縮邊集、細(xì)胞質(zhì)密度增高、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張(電鏡,×8 000);h為SAH組48 h時(shí)仍可見(jiàn)細(xì)胞核內(nèi)異染質(zhì)增加,細(xì)胞質(zhì)密度增加(電鏡,×8 000);i為SAH組72 h時(shí)海馬神經(jīng)元形態(tài)大致正常(電鏡,×8 000);j為假手術(shù)組海馬神經(jīng)元形態(tài)飽滿,異染質(zhì)少見(jiàn),細(xì)胞器形態(tài)正常(電鏡,×8 000)

    圖2 光鏡及電鏡下大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化

    注:與SAH組比較,aP<0.05;SAH=蛛網(wǎng)膜下腔出血

    注:A為空白對(duì)照組,B為1 h SAH組,C為6 h SAH組,D為12 h SAH組,E為24 h SAH組,F(xiàn)為48 h SAH組,G為72 h SAH組,H為假手術(shù)組

    圖4 光鏡下大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞(TUNEL染色,×400)

    注:與SAH組比較,aP<0.05

    表3 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較±s,分,n=6)

    注:與SAH組比較,aP<0.05

    注:1泳道為空白對(duì)照組, 2泳道為1 h,3泳道為6 h,4泳道為 12 h,5泳道為24 h, 6泳道為48 h,7泳道為72 h;CHOP=CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白

    圖3 SAH組和假手術(shù)組不同時(shí)間點(diǎn)CHOP表達(dá)水平電泳圖

    Figure 3 Electrophoretogram of the expression level of CHOP of SAH group and sham operation group at different time points

    2.6 SAH組大鼠CHOP相對(duì)表達(dá)水平與海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平的相關(guān)性分析 SAH組CHOP相對(duì)表達(dá)水平與海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平呈正相關(guān)(r=0.933,P<0.01)。

    3 討論

    影響SAH預(yù)后的原因主要有CVS和EBI兩個(gè)方面[6]。既往學(xué)者在CVS上做了大量研究,但患者的預(yù)后沒(méi)有改善[7]。有學(xué)者認(rèn)為,SAH后EBI是SAH患者死亡的首要原因[8]。因此,目前越來(lái)越多的研究轉(zhuǎn)向EBI。EBI是一個(gè)整體性的概念,其涉及SAH后72 h內(nèi)腦組織發(fā)生的所有病理及生理變化[9],包括顱內(nèi)壓增高、腦血流量減少以及血液流入蛛網(wǎng)膜下腔后對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接毒性反應(yīng)等,這些反應(yīng)促使早期腦水腫、氧化應(yīng)激以及腦梗死的發(fā)展[10],導(dǎo)致廣泛性的細(xì)胞凋亡[11],主要包括血-腦脊液屏障、海馬和血管內(nèi)皮細(xì)胞等,其損傷程度與SAH后導(dǎo)致的神經(jīng)行為功能障礙有關(guān)。深入研究SAH后EBI的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,對(duì)于降低SAH致殘率和病死率具有重要意義[12]。

    筆者既往研究顯示,ERS在SAH后的EBI中發(fā)揮重要作用[13]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞維持正常生理功能的重要亞細(xì)胞器,是分泌蛋白和膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行折疊、修飾和組裝的場(chǎng)所,這些過(guò)程是細(xì)胞成熟所必需的條件。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response,UPR) 以保護(hù)細(xì)胞損傷,過(guò)強(qiáng)、過(guò)久的ERS反應(yīng)則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是最近幾年才被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡途徑。該凋亡途徑共分為3種:CHOP/GADD153通路、Caspase通路、JNK通路。CHOP作為ERS通路中特異性的轉(zhuǎn)錄因子,正常情況下很少表達(dá),但持久、過(guò)度的應(yīng)激則會(huì)通過(guò)UPR引起CHOP的大量激活,調(diào)控下游的促凋亡基因Bcx/Bak、抗凋亡基因Bcl-2等,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

    本研究通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),SAH組6 h可見(jiàn)明顯內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒、擴(kuò)張,線粒體腫脹、空泡早期凋亡,廣泛的細(xì)胞水樣變性及腦組織間質(zhì)水腫,提示此時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的結(jié)構(gòu)與功能受到了一定影響,已存在ERS,神經(jīng)元也開始出現(xiàn)凋亡前期的表現(xiàn)[15];SAH組24 h海馬神經(jīng)元凋亡變化最為明顯,可見(jiàn)細(xì)胞核膜內(nèi)陷、染色質(zhì)固縮邊集、細(xì)胞質(zhì)密度增高、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張,而在72 h海馬神經(jīng)元形態(tài)已趨于正常,與王春梅等[16]研究相似。以上提示SAH早期全腦缺血引發(fā)了細(xì)胞水腫[17-18],隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)與功能的持續(xù)損害,海馬神經(jīng)元逐漸出現(xiàn)凋亡征象,雖未見(jiàn)凋亡小體等凋亡晚期表現(xiàn),但其染色質(zhì)的變化已屬于凋亡改變,結(jié)果與Asher等[19]的研究結(jié)果相符合。本研究發(fā)現(xiàn),SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平均高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組,且6、12、24、48 h時(shí)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均低于空白對(duì)照組和假手術(shù)組,3組兩種指標(biāo)不同時(shí)間點(diǎn)變化一致,說(shuō)明在SAH后早期海馬神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致了神經(jīng)行為功能障礙。

    本研究發(fā)現(xiàn),SAH組大鼠6、12、24、48 h時(shí)CHOP相對(duì)表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組,其余時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)差異,說(shuō)明CHOP在建模后6 h表達(dá)水平開始增加,提示了SAH早期ERS的出現(xiàn);1 h和72 h CHOP相對(duì)表達(dá)水平同空白對(duì)照組無(wú)差別,24 h達(dá)到高峰,這與海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平變化一致。由此筆者認(rèn)為,在SAH后24 h,CHOP的表達(dá)和細(xì)胞凋亡同時(shí)達(dá)到高峰,說(shuō)明了SAH后持續(xù)的應(yīng)激導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙,從而誘導(dǎo)CHOP大量表達(dá),引起細(xì)胞凋亡,但隨著時(shí)間推移,細(xì)胞凋亡情況與行為學(xué)評(píng)分逐漸恢復(fù),這可能與ERS的保護(hù)效應(yīng)有關(guān)。本研究相關(guān)性分析顯示,CHOP相對(duì)表達(dá)水平與海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞水平呈正相關(guān),進(jìn)一步說(shuō)明了ERS在海馬神經(jīng)元凋亡中所發(fā)揮的作用。CHOP的表達(dá)升高是ERS的標(biāo)志,CHOP在ERS和海馬神經(jīng)元凋亡聯(lián)系中發(fā)揮重要作用。

    綜上所述,SAH后早期發(fā)生了ERS,刺激CHOP表達(dá)水平增高,從而進(jìn)一步誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡并造成神經(jīng)功能障礙,說(shuō)明CHOP在SAH后EBI的病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,這將為今后深入研究CHOP的作用以及尋找針對(duì)性的治療提供理論依據(jù)。

    本文鏈接:

    異染質(zhì):在細(xì)胞周期中,間期、早期或中、晚期,某些染色體或染色體的某些部分的固縮常較其他染色質(zhì)早些或晚些,其染色較深或較淺,具有這種固縮特性的染色體稱為異染質(zhì)。細(xì)胞核內(nèi)異染質(zhì)增多可看作為細(xì)胞凋亡早期的表現(xiàn)。

    [1]Sehba FA,Pluta RM,Zhang JH.Metamorphosis of subarachnoid hemorrhage research:from delayed vasospasm to early brain injury[J].Mol Neurobiol,2011,43(1):27-40.

    [2]Cahill J,Calvert JW,Zhang JH.Mechanisms of early brain injury after Subarachnoid hemorrhage[J].J Cereb Blood Flow Metab,2006,26(11):1341-1353.

    [3]Mehmet H.Caspases find a new place to hide[J].Nature,2000,403 (6765 ):29-30.

    [4]Hu YQ,Tang N,Lei LM,et al.Changes of protein kinase-like endoplasmic reficulum kinase and glucose-regulated protein 78 expression in rats after focal ischemic preconditioning[J].Chinese Journal of Neurology,2012,45(1):45-50.(in Chinese) 胡躍強(qiáng),唐農(nóng),雷龍鳴,等.大鼠局灶性腦缺血預(yù)處理后蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78表達(dá)的變化[J].中華神經(jīng)科雜志,2012,45(1):45-50.

    [5]Garcia JH,Wagner S,Liu KF,et al.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats.Statistical validation[J].Stroke,1995,26(4):627-634.

    [6]Ciurea AV,Palade C,Voinescu D,et al.Subarachnoid hemorrhage and cerebral vasospasm-Literature review[J].J Med Life,2013,6(2):120-125.

    [7]Hou J,Zhang JH.Does prevention of vasospasm in subarachnoid hemorrhage improve clinical outcome? No[J].Stroke,2013,44(6 Suppl 1):S34-36.

    [8]Ayer RE,Zhang JH.Oxidative stress in subarachnoid hemorrhage:significance in acute brain injury and vasospasm [J].Acta Neurochir Suppl,2008,104:33-41.

    [9]Kusaka G,Ishikawa M,Nanda A,et al.Signaling pathways for early brain injury after subarachnoid hemorrhage[J].J Cereb Blood Flow Metab,2004,24(8):916-925.

    [10]Ayer R,Chen W,Sugawara T,et al.Role of gap junctions in early brain injury following subarachnoid hemorrhage[J].Brain Res,2010,1315:150-158.

    [11]Sugawara T,Jadhav V,Ayer R,et al.Thrombin inhibition by argatroban ameliorates early brain injury and improves neurological outcomes after experimental subarachnoid hemorrhage in rats[J].Stroke,2009,40(4):1530-1532.

    [12]King MD,Laird MD,Ramesh SS,et al.Elucidating novel mechanisms of brain injury following subarachnoid hemorrhage:an emerging role for neuroproteomics [J].Neurosurg Focus,2010,28(1):E10.

    [13]Yao JL,Zhao D,Dai J,et al.Research of the gene expression levels of Caspase-12 and neuronal apoptosis in the hippocampus after subarachnoid hemorrhage[J].Chinese Journal of Neurosurgery,2012,28(5):466-470.(in Chinese) 姚俊嶺,趙冬,戴晶,等.蛛網(wǎng)膜下腔出血后Caspase-12表達(dá)及海馬細(xì)胞凋亡的研究[J].中華神經(jīng)外科雜志,2012,28(5):466-470.

    [14]Szegezdi E,Logue SE,Gorman AM,et al.Mediators of endoplasmic reticulum Stress induced apoptosis[J].EMBO Rep,2006,7 (9):880.

    [15]Zhu YR,Liu ZM.Progress of research on apoptosis[J].Guizhou Journal of Animal Husbandry And Veterinary Medicine,2008,32(1):25-27.(in Chinese) 朱永仁,劉志明.細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].貴州畜牧獸醫(yī),2008,32(1):25-27.

    [16]王春梅,黃曉峰,楊家驥.細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與超微結(jié)構(gòu)病理基礎(chǔ)[M].西安:第四醫(yī)大學(xué)出版社,2004:142-143.

    [17]Cahill J,Calvert JW,Zhang JH.Mechanisms of early brain injury after subarachnoid hemorrhage[J].J Cereb Blood Flow Metab,2006,26(11):1341-1353.

    [18]Ayer R,Zhang J.Connecting the early brain injury of aneurysmal subarachnoid hemorrhage to clinical practice[J].Turk Neurosurg,2010,20(2):159-166.

    [19]Asher E,Payne CM,Bernstein C.Evaluation of cell death in EBV-transformed lymphocytes using agarose gel electrophoresis,light microscopy and electron microscopy.Ⅱ.Induction of non-classic apoptosis ("para-apoptosis") by tritiated thymidine[J].Leuk Lymphoma,1995,19(1/2):107-119.

    (本文編輯:李婷婷)

    Effects of Endoplasmic Reticulum Stress-induced Transcriptional Factor CHOP on Early Brain Injury After Subarachnoid Hemorrhage

    HUANGXiao-yuan,ZHAODong,LIUQi,etal.

    DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospitaloftheMedicalCollege,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China

    Objective To investigate the effects of endoplasmic reticulum stress factor-induced transcriptional factor CHOP on early brain injury (EBI) after subarachnoid hemorrhage (SAH).Methods A total of 78 healthy male Sprague-Dawley rats were selected and randomly assigned into control group (n=6),sham operation group (n=36) and SAH group (n=36).At 1, 6, 12, 24, 48 and 72 h,we selected 6 rats from both sham operation group and SAH group using simple random sampling method and killed these rats.Comparison was made in the morphological change of hippocampal neurons,the relative expression level of CHOP,the apoptosis level of hippocampal neuron cells and the score of neuroethology observed under light microscope and electron microscope among the three groups at different time points.Results In each group,the relevant expression levels of CHOP at 6,12,24 and 48 h were significantly different (P<0.05).SAH group was higher (P<0.05) than control group and sham operation group in the relative expression level of CHOP at 6,12,24 and 48 h.No significant difference (P>0.05) was noted between control group and sham group in the relevant expression level of CHOP at different time points.In control group and sham operation group,very few apoptotic hippocampal neuron cells were observed;in SAH group,no obvious apoptosis of hippocampal neuron cells was observed at 1 h;in SAH group,the apoptotic hippocampal neuron cells increased at 6 and 12 h than before,and the karyons of some scattered apoptotic hippocampal neuron cells took on the color of sepia;in SAH group,apoptotic hippocampal neuron cells increased notably at 24 h and decreased gradually at 48 h,and a small number of apoptotic hippocampal neuron cells were observed at 72 h.In each group,the apoptosis levels of hippocampal neuron cells at 6,12,24 and 48 h were significantly different (P<0.05).SAH group was higher (P<0.01) than control group and the sham operation group in the apoptosis level of hippocampal neuron cells at 6,12,24 and 48 h.No significant difference (P>0.05) was noted between control group and sham group in the apoptosis level of hippocampal neuron cells at different time points.No significant difference (P>0.05) was noted among the three groups in the score of neuroethology before intervention.In each group,the scores of neuroethology at 6,12,24 and 48 h were significantly different (P<0.05).SAH group was lower (P<0.01) than control group and sham operation group in the score of neuroethology at 6,12,24 and 48 h.No significant difference (P>0.05) was noted between control group and sham group in the score of neuroethology at different time points.In SHA group,the expression level of CHOP was positively correlated with the apoptosis level of hippocampal neuron cells (r=0.933,P<0.01).Conclusion At the early stage following SAH,the expression of CHOP increases,the apoptotic hippocampal neuron cells increase,and the score of neuroethology decreases.It suggests that CHOP plays an important role in cell apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress after SAH.

    Subarachnoid hemorrhage;Brain injuries;Endoplasmic reticulum stress;CCAAT-enhancer-binding proteins;Vasospasm,intracranial;Apoptosis

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360186);石河子大學(xué)“自然科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新”資助項(xiàng)目(ZRKXYB-15)

    832000新疆石河子市,石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

    王業(yè)忠,832000新疆石河子市,石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科;E-mail:Wangyz2008@126.com

    R 651.15

    A

    10.3969/j.issn.1007-9572.2015.24.009

    2015-02-21;

    2015-06-13)

    猜你喜歡
    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛛網(wǎng)膜下腔
    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬及其與疾病的關(guān)系研究進(jìn)展
    憤怒誘導(dǎo)大鼠肝損傷中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)
    改良序貫法測(cè)定蛛網(wǎng)膜下腔注射舒芬太尼用于分娩鎮(zhèn)痛中的半數(shù)有效劑量
    LPS誘導(dǎo)大鼠肺泡上皮細(xì)胞RLE-6 TN內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡研究
    復(fù)合手術(shù)救治重癥動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血的體會(huì)
    蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的觀察與護(hù)理
    16排螺旋 CT 診斷外傷性蛛網(wǎng)膜下腔出血的應(yīng)用分析
    Caspase12在糖尿病大鼠逼尿肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的表達(dá)
    久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲成人久久爱视频| 国产精品永久免费网站| 日本熟妇午夜| 成人三级黄色视频| 久久久久久久午夜电影| 亚洲精品国产av成人精品 | 少妇的逼水好多| 免费无遮挡裸体视频| 91av网一区二区| av在线天堂中文字幕| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 婷婷色综合大香蕉| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲av熟女| 99国产精品一区二区蜜桃av| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 人人妻人人看人人澡| 国产精品电影一区二区三区| 久久久精品大字幕| 丝袜喷水一区| 亚洲av成人精品一区久久| 免费观看精品视频网站| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品电影一区二区三区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 尾随美女入室| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 精品国内亚洲2022精品成人| 免费在线观看影片大全网站| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲国产色片| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 欧美性猛交黑人性爽| 国产人妻一区二区三区在| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 精品熟女少妇av免费看| 麻豆国产97在线/欧美| 久久九九热精品免费| 亚洲天堂国产精品一区在线| 婷婷精品国产亚洲av| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲七黄色美女视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 伦精品一区二区三区| 国产av在哪里看| 日韩强制内射视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 观看美女的网站| 亚洲成a人片在线一区二区| 赤兔流量卡办理| 久久热精品热| 一级毛片久久久久久久久女| 内地一区二区视频在线| 日本黄色视频三级网站网址| 国产精品一区二区三区四区久久| 在现免费观看毛片| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 老司机午夜福利在线观看视频| 伦精品一区二区三区| 美女免费视频网站| 精品久久久久久久末码| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久精品人妻少妇| 一个人免费在线观看电影| 男人狂女人下面高潮的视频| 一个人看的www免费观看视频| 欧美bdsm另类| 99久久精品国产国产毛片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| .国产精品久久| 91麻豆精品激情在线观看国产| 春色校园在线视频观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 成人三级黄色视频| 亚洲欧美清纯卡通| 国产在线男女| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲最大成人av| 国产日本99.免费观看| 亚洲成av人片在线播放无| 2021天堂中文幕一二区在线观| 日本免费a在线| 一级av片app| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 97碰自拍视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美高清性xxxxhd video| 波野结衣二区三区在线| 国产精品三级大全| 午夜激情福利司机影院| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品久久视频播放| 99热这里只有是精品50| 亚洲精品一区av在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 色av中文字幕| 国产午夜福利久久久久久| 国产一区二区激情短视频| 99热6这里只有精品| 国产精品不卡视频一区二区| www.色视频.com| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲人成网站高清观看| 波多野结衣高清无吗| 欧美日韩乱码在线| 日本一本二区三区精品| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 久久久久久久久久久丰满| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 久久久久久伊人网av| 国产亚洲精品久久久com| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 人人妻人人澡欧美一区二区| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 欧美性感艳星| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲国产高清在线一区二区三| 十八禁网站免费在线| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美高清成人免费视频www| 日韩欧美精品v在线| 欧美激情在线99| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美极品一区二区三区四区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 97在线视频观看| 性欧美人与动物交配| 免费av不卡在线播放| 亚洲av免费在线观看| 国产精品一区www在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 成人国产麻豆网| 春色校园在线视频观看| 国产午夜精品论理片| 国产不卡一卡二| 亚洲欧美清纯卡通| 免费看光身美女| 婷婷六月久久综合丁香| 一进一出抽搐动态| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 熟女人妻精品中文字幕| 波野结衣二区三区在线| 中国国产av一级| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产一级毛片七仙女欲春2| a级毛片a级免费在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久鲁丝午夜福利片| 久久精品国产清高在天天线| 国产麻豆成人av免费视频| 国内精品一区二区在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 免费看日本二区| 一级黄色大片毛片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产91av在线免费观看| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲最大成人av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日韩av在线大香蕉| 午夜视频国产福利| 日韩制服骚丝袜av| 色视频www国产| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品精品国产色婷婷| 精品久久久久久成人av| 波多野结衣高清无吗| 男女视频在线观看网站免费| 久久久欧美国产精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久久久性生活片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 男女边吃奶边做爰视频| 九九爱精品视频在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久久久久大精品| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲av中文av极速乱| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲最大成人av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日韩在线高清观看一区二区三区| 不卡一级毛片| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲av熟女| 国产单亲对白刺激| 可以在线观看毛片的网站| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲自偷自拍三级| 午夜福利视频1000在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲国产精品合色在线| 国产一区二区三区av在线 | 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美日韩在线观看h| 99riav亚洲国产免费| 国产亚洲精品av在线| 一进一出好大好爽视频| a级毛色黄片| 全区人妻精品视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久精品人妻少妇| 日韩亚洲欧美综合| av福利片在线观看| 亚洲av熟女| a级一级毛片免费在线观看| 在线免费十八禁| 国产探花极品一区二区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美高清性xxxxhd video| 日韩精品青青久久久久久| 91久久精品国产一区二区成人| 免费人成在线观看视频色| 婷婷色综合大香蕉| 99热全是精品| av在线蜜桃| 欧美在线一区亚洲| 色5月婷婷丁香| 精品乱码久久久久久99久播| 免费黄网站久久成人精品| 22中文网久久字幕| 国产亚洲精品久久久com| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲av免费在线观看| 极品教师在线视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 六月丁香七月| 搞女人的毛片| 长腿黑丝高跟| 午夜久久久久精精品| 国产一区二区三区av在线 | 成人精品一区二区免费| 亚洲av成人av| 日韩欧美国产在线观看| 欧美bdsm另类| 极品教师在线视频| 国产三级中文精品| 成人av在线播放网站| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲精品国产成人久久av| 精品久久久久久久久久久久久| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲va在线va天堂va国产| 欧美日韩国产亚洲二区| a级毛片a级免费在线| 日本一本二区三区精品| 免费av毛片视频| 成人二区视频| av在线观看视频网站免费| 老司机影院成人| 亚洲专区国产一区二区| 夜夜爽天天搞| 伦理电影大哥的女人| 激情 狠狠 欧美| 国产精品一区二区免费欧美| 丰满的人妻完整版| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久国产乱子免费精品| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲四区av| 少妇高潮的动态图| 69人妻影院| 赤兔流量卡办理| 五月玫瑰六月丁香| 精品久久久久久久久久免费视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 在线观看午夜福利视频| 成年版毛片免费区| 免费人成视频x8x8入口观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 久99久视频精品免费| 九九在线视频观看精品| 性色avwww在线观看| 国内精品一区二区在线观看| av在线播放精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 麻豆国产97在线/欧美| 男女那种视频在线观看| 国产老妇女一区| 欧美又色又爽又黄视频| 久久精品夜色国产| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精华一区二区三区| 小说图片视频综合网站| 国产精品久久久久久av不卡| 看十八女毛片水多多多| 六月丁香七月| 国产高清不卡午夜福利| 一级毛片我不卡| 免费看光身美女| 国产精品人妻久久久影院| 国产真实乱freesex| 乱人视频在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 中文在线观看免费www的网站| 欧美区成人在线视频| 九色成人免费人妻av| 桃色一区二区三区在线观看| 三级经典国产精品| 99在线人妻在线中文字幕| 最新在线观看一区二区三区| 日本成人三级电影网站| 亚洲熟妇熟女久久| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产熟女欧美一区二区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 真实男女啪啪啪动态图| 日韩欧美精品v在线| 日本一二三区视频观看| 99久久成人亚洲精品观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品久久视频播放| 久久亚洲国产成人精品v| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 欧美日韩乱码在线| 中出人妻视频一区二区| 成年版毛片免费区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 精品久久国产蜜桃| 亚洲av.av天堂| 99热这里只有精品一区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 毛片女人毛片| 久久久精品大字幕| 国产v大片淫在线免费观看| 国产成人一区二区在线| 精华霜和精华液先用哪个| 免费观看人在逋| 国产乱人偷精品视频| 日本黄大片高清| 一个人免费在线观看电影| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 亚洲熟妇熟女久久| 国产亚洲欧美98| 精品不卡国产一区二区三区| 91久久精品国产一区二区三区| 国产单亲对白刺激| 熟女电影av网| 亚洲最大成人av| 亚洲图色成人| 久久热精品热| 日韩欧美免费精品| aaaaa片日本免费| 国产探花极品一区二区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 欧美色视频一区免费| 久久精品91蜜桃| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产真实乱freesex| 日韩欧美 国产精品| 日韩亚洲欧美综合| 久久久久久九九精品二区国产| 国产真实乱freesex| 亚洲第一区二区三区不卡| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产日本99.免费观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 97碰自拍视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲av电影不卡..在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 免费观看人在逋| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美zozozo另类| 又黄又爽又免费观看的视频| av卡一久久| 亚洲经典国产精华液单| 春色校园在线视频观看| 91久久精品电影网| 在线免费观看不下载黄p国产| 婷婷精品国产亚洲av在线| 日本黄色片子视频| 国产一区二区在线观看日韩| av黄色大香蕉| 久久久久久久久大av| 十八禁国产超污无遮挡网站| 麻豆国产97在线/欧美| 久久久久久久久中文| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美高清成人免费视频www| 欧美一区二区亚洲| 欧美激情久久久久久爽电影| 一级毛片我不卡| 亚洲电影在线观看av| 精品一区二区三区视频在线| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久久国产成人精品二区| 黄片wwwwww| 日本在线视频免费播放| 国产黄片美女视频| 露出奶头的视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品熟女少妇av免费看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产三级在线视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 日本在线视频免费播放| 国产精品一区二区三区四区久久| 少妇的逼水好多| 亚洲av一区综合| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久久久九九精品影院| 国内精品美女久久久久久| 三级毛片av免费| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 久久久久久久久大av| 中文字幕久久专区| 成人漫画全彩无遮挡| 日韩国内少妇激情av| 亚洲高清免费不卡视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 久久久久久久久久成人| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲七黄色美女视频| 白带黄色成豆腐渣| 午夜精品在线福利| 男人舔奶头视频| 极品教师在线视频| 日韩欧美三级三区| 欧美高清成人免费视频www| 69人妻影院| 国产精品亚洲一级av第二区| 一进一出抽搐动态| 婷婷色综合大香蕉| 99热这里只有是精品50| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲最大成人中文| 久久国内精品自在自线图片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 成人亚洲精品av一区二区| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲中文日韩欧美视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产不卡一卡二| 国产精品一区二区免费欧美| a级毛片a级免费在线| 久久久久国产网址| 久久九九热精品免费| 日日啪夜夜撸| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产高清视频在线观看网站| 国产伦在线观看视频一区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 欧美一区二区国产精品久久精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 给我免费播放毛片高清在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 男人和女人高潮做爰伦理| 在线观看免费视频日本深夜| 毛片一级片免费看久久久久| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲av成人av| 日本在线视频免费播放| 亚洲国产精品sss在线观看| 少妇熟女欧美另类| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久韩国三级中文字幕| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品久久久久久久久av| 十八禁国产超污无遮挡网站| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产91av在线免费观看| 精品久久久久久久久亚洲| 欧美丝袜亚洲另类| 久久精品人妻少妇| 亚洲国产精品成人久久小说 | 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 少妇的逼好多水| 特级一级黄色大片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩精品青青久久久久久| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲内射少妇av| 久久久久国产网址| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 天堂影院成人在线观看| 乱人视频在线观看| 在线天堂最新版资源| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲av.av天堂| 日韩欧美在线乱码| 97热精品久久久久久| 日韩精品青青久久久久久| 日本在线视频免费播放| 淫秽高清视频在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美三级亚洲精品| 精品无人区乱码1区二区| 久久99热这里只有精品18| 精品久久久噜噜| 麻豆国产97在线/欧美| 午夜日韩欧美国产| 一边摸一边抽搐一进一小说| 最好的美女福利视频网| 十八禁国产超污无遮挡网站| 欧美日韩乱码在线| 国产精品一区二区性色av| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产毛片a区久久久久| 人妻少妇偷人精品九色| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲欧美日韩高清专用| 看非洲黑人一级黄片| 日韩一区二区视频免费看| 久久6这里有精品| 国产爱豆传媒在线观看| 直男gayav资源| 91久久精品国产一区二区三区| 在线观看66精品国产| 美女 人体艺术 gogo| 午夜a级毛片| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产精品三级大全| 日韩成人伦理影院| 校园人妻丝袜中文字幕| 在线a可以看的网站| 夜夜爽天天搞| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 久久久久久大精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美性感艳星| 黄色一级大片看看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产精品无大码| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 人人妻人人看人人澡| 精品免费久久久久久久清纯| 日韩精品中文字幕看吧| 男女视频在线观看网站免费| 国产午夜福利久久久久久| 日韩 亚洲 欧美在线| av中文乱码字幕在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 99久久精品热视频| 可以在线观看毛片的网站| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 欧美成人免费av一区二区三区| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 老司机午夜福利在线观看视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 一级黄色大片毛片| 国产精品伦人一区二区| 欧美精品国产亚洲| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 九九在线视频观看精品| 免费看日本二区| 久久久久久久午夜电影| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲最大成人av| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| or卡值多少钱| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久久久久久久久丰满| 日本免费a在线| 日韩人妻高清精品专区| 国产色爽女视频免费观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 99精品在免费线老司机午夜|