慢性阻塞性肺疾病大鼠支氣管肺泡灌洗液中CD80、CD86的變化及意義

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

慢性阻塞性肺疾病大鼠支氣管肺泡灌洗液中CD80、CD86的變化及意義

顧延會，符丹丹，饒習(xí)敏，歐陽瑤

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 研究樹突狀細(xì)胞(DCs)表面因子CD80、CD86在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠造模過程中不同時間段支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的表達(dá)變化，進(jìn)而深入探討DCs在COPD發(fā)病過程中的作用。方法 將48只大鼠隨機(jī)分為正常對照組(n=24)和COPD模型組(n=24)。COPD模型組大鼠4周內(nèi)間斷予氣道內(nèi)注入脂多糖(LPS)溶液2次，并予被動吸煙2次/日(注入脂多糖當(dāng)天除外)。兩組大鼠分別于第7、14、21及28天隨機(jī)選取6只，取其肺組織行病理蘇木精-伊紅染色(HE染色)以觀察病理形態(tài)學(xué)改變，同時收集BALF，采用流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測兩組大鼠4個時間段BALF中CD80、CD86的百分比表達(dá)。結(jié)果 隨時間進(jìn)展COPD大鼠氣道炎癥和肺氣腫表現(xiàn)逐漸出現(xiàn)，且日漸加重，第28天顯示明顯氣道阻塞和肺氣腫表現(xiàn)。正常對照組大鼠BALF中CD80和CD86百分比在第7、14、21和28天無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與正常對照組同時間段相比，COPD模型組第7、14、21、28天BALF中CD80和CD86百分比均有所增加，但第7、14天增加不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，第21、28天增加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 利用煙熏及氣道內(nèi)注LPS方法4周后成功建立大鼠COPD模型。COPD模型組大鼠造模早期、中期BALF中CD80、CD86百分比表達(dá)不明顯，后期增加明顯，提示DCs可能隨疾病進(jìn)展逐漸參與到COPD的炎癥反應(yīng)過程中，并導(dǎo)致后期不可逆的疾病進(jìn)展，同時提示早期預(yù)防和治療可能減少免疫反應(yīng)引起的炎癥反應(yīng)并阻止疾病進(jìn)一步進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞]慢性阻塞性肺疾病；樹突狀細(xì)胞；肺泡灌洗液； CD80；CD86

慢性阻塞性肺疾病(COPD)簡稱慢阻肺，是一種嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的疾病，其發(fā)病率高、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，且病死率高、致殘率高[1]，故揭示COPD的發(fā)病機(jī)制及有效防治措施已經(jīng)成為目前研究的主要課題。目前認(rèn)為吸煙是世界范圍內(nèi)引起COPD最常見的危險因素，長期大量吸煙可以引起氣道慢性炎癥和肺氣腫，反復(fù)感染可導(dǎo)致COPD患者病情逐漸加重，且進(jìn)展快，二者共同作用導(dǎo)致逐漸加重的氣流受限和肺功能減退。基于我們以前的研究基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)DC參與的免疫炎癥反應(yīng)在COPD的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用[2-6]，但DCs在該發(fā)病過程中具體變化趨勢不清楚。支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢查在下呼吸道感染性疾病中的研究起到重要作用，利于細(xì)胞學(xué)和免疫學(xué)的檢查[7]。故本研究通過4周時間煙熏和氣道內(nèi)注入LPS 2次的聯(lián)合方法制備COPD大鼠模型，觀察COPD大鼠造模過程中的不同時期肺組織病理形態(tài)學(xué)改變和BALF中DCs表面因子CD80和CD86的變化，以探討DCs在COPD發(fā)病早期、中期或晚期中的作用。

1材料與方法

1.1主要試劑LPS(E.coli 055:B5)由美國Sigma公司提供； PE anti-rat CD80 PE Mouse IgG1、FITC anti-rat CD86及其同型對照FITC Mouse IgG1由eBioscience公司提供。

1.2研究方法

1.2.1動物選取、飼養(yǎng)及模型制備選取SPF級雄性Wistar大鼠48只，約8周齡，體重約(200±20)g，由重慶市大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于符合SPF級實驗動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的動物房內(nèi)，均予正常喂養(yǎng)。正常對照組大鼠不予任何干預(yù)措施。COPD模型組大鼠第1、15天氣道內(nèi)注入LPS溶液(200 μg/200 μL)0.2 mL，第2～14、16～28天每天被動吸煙2次，每次30 min×12支。

1.2.2標(biāo)本采集分別于第7、14、21及28天時收集，開胸后立即結(jié)扎右肺，取右肺下葉組織約1 cm×1 cm×1 cm大小固定于10%福爾馬林中，用于病理切片；充分暴露氣管、左主支氣管及肺組織，行氣管插管，輕柔注入生理鹽水約5 mL，混勻并停留5 min，回抽，回收率>80%，共3次，即為BALF標(biāo)本，離心后上清液用于FCM檢查。

1.2.3肺組織病理標(biāo)本處理和形態(tài)學(xué)測量方法于我院病理科制作肺組織石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，采用計算機(jī)圖象分析軟件IPWin32采圖系統(tǒng)對各切片進(jìn)行采圖。

1.2.4應(yīng)用FCM檢測BALF中DCs表面因子CD80、CD86表達(dá)BALF標(biāo)本處理后上清液中加熒光抗體，室溫避光25 min，PBS漂洗2次，加固定液至200 μL，上機(jī)。

2結(jié)果

組別第7天第14天第21天第28天健康對照組252.67±9.87278.76±9.68296.30±10.12324.18±12.89COPD組251.42±14.59247.50±14.76*245.83±15.17*242.31±14.71*

與健康對照組比較，*P<0.01。

2.2兩組大鼠不同時間段肺組織病理特點正常對照組鏡下觀察第7、14、21及28天肺組織表現(xiàn)無明顯變化，主要表現(xiàn)為氣管表面未見腺體及炎性細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)正常連續(xù)。COPD模型組鏡下觀察第7、14、21及28天肺組織表現(xiàn)有明顯變化[8]，主要表現(xiàn)在氣道分泌物逐漸增多，氣道慢性炎癥、氣道阻塞情況、肺泡結(jié)構(gòu)改變等均提示病變逐漸加重。與正常組比，主要表現(xiàn)為第7天：小支氣管管壁見少許中性粒和淋巴細(xì)胞浸潤；第14天：支氣管上皮增生增厚，黏膜下腺增生肥大，管壁及周圍見大量中性粒和淋巴細(xì)胞浸潤，腔內(nèi)見少許分泌物，肺泡壁變薄，見少量斷裂；第21天：個別小氣道壁的平滑肌層明顯增厚，管腔中粘液腺及杯狀細(xì)胞增生肥大明顯，肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯；第28天：支氣管黏膜上皮脫落,管壁及周圍大量單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡壁變薄、斷裂,肺泡腔擴(kuò)大,部分融合成肺大皰。

2.3兩組大鼠BALF中CD80、CD86的表達(dá)正常對照組大鼠第7、14、21及28天BALF中CD80、CD86的表達(dá)變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果(見表2)。

與正常對照組同時間段相比，COPD模型組大鼠BALF中CD80和CD86百分比在7、14、21、28 d均有所增加，但7、14 d增加不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，21、28 d增加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果(見表2)。

時間段(d)CD80正常對照組COPD組tPCD86正常對照組COPD組tP70.37±0.210.38±0.170.030.9800.65±0.170.69±0.170.070.980140.38±0.180.51±0.111.560.1500.66±0.080.70±0.140.150.880210.37±0.081.09±0.1410.640.0030.65±0.131.12±0.165.190.006280.36±0.211.45±0.1111.210.0040.67±0.081.73±0.1118.400.005F0.010.3575.5268.17P0.990.790.0060.002

3討論

COPD是一種以持續(xù)性氣流受限為特征的可防和可治的常見肺部疾病，主要臨床表現(xiàn)為漸進(jìn)性的呼吸困難[1]。本實驗遵循實驗動物倫理學(xué)理論制備COPD大鼠模型，與正常對照組大鼠相比，COPD模型組一般情況較差，表現(xiàn)出逐漸加重的呼吸困難，符合人類COPD特征性的癥狀表現(xiàn)；病理HE染色顯示隨時間進(jìn)展逐漸出現(xiàn)氣道炎癥和肺氣腫表現(xiàn)，且氣道阻塞及肺氣腫逐漸加重，第28天肺組織病理顯示明顯氣道阻塞和肺氣腫表現(xiàn)，已符合人類COPD肺組織的特征性改變，與以往研究結(jié)論[9]相符，綜上提示COPD大鼠模型制備成功，為COPD大鼠相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。

近來越來越多的研究顯示COPD可能是一種“自身免疫性疾病”[10]，免疫發(fā)病過程基本為吸煙初始反應(yīng)(先天性免疫反應(yīng))、T細(xì)胞激活和增殖、適應(yīng)性免疫反應(yīng)(組織損傷)，發(fā)病過程可能與中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DCs等炎癥細(xì)胞參與的異常免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)[11]， DCs是肺組織中存在的功能強(qiáng)大的專職性抗原遞呈細(xì)胞(APCs)，決定著免疫反應(yīng)的發(fā)生和走向。關(guān)于DCs與COPD相關(guān)研究， Demedts等[12]及本課題組[2-6]人體及動物研究均發(fā)現(xiàn)COPD氣道、肺組織內(nèi)DCs的含量增加，且與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。但在COPD造模過程中隨時間進(jìn)展氣道內(nèi)DCs表達(dá)變化趨勢不清。本實驗通過測定COPD造模過程中第7、14、21及28天BALF中CD80、CD86的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討DCs在COPD發(fā)病早期、中期和后期過程中的作用和意義。實驗結(jié)果顯示正常對照組大鼠第7、14、21及28天BALF中CD80、CD86百分比變化不大，即隨時間進(jìn)展正常對照組大鼠氣道內(nèi)DCs未見明顯改變。與正常對照組同時間段相比，COPD模型組大鼠BALF中CD80和CD86百分比在第7、14天有所增加，但變化不明顯，即COPD發(fā)病早期或中期氣道內(nèi)DCs增加不明顯，與煙霧刺激或LPS感染早期，引起的機(jī)體反應(yīng)以先天性免疫反應(yīng)為主有關(guān)，尚未引起明顯的免疫炎癥反應(yīng)過程，同時肺組織示肺泡結(jié)構(gòu)未見明顯破壞，提示COPD發(fā)病早期或中期停止外界刺激可能能阻止疾病進(jìn)一步進(jìn)展；CD80和CD86百分比在第21、28天均有所增加，且第28、21天比較亦有所增加，提示COPD發(fā)病后期DCs介導(dǎo)并參與免疫炎癥反應(yīng)，同時肺組織HE染色示肺泡結(jié)構(gòu)破壞，且隨時間進(jìn)展逐漸加重，提示COPD發(fā)病后期疾病進(jìn)展迅速且不可逆轉(zhuǎn)。

總之，該實驗結(jié)果提示隨時間進(jìn)展DCs逐漸參與到COPD的免疫炎癥反應(yīng)過程中，并最終導(dǎo)致不可逆的疾病進(jìn)展，但在COPD發(fā)病早期未出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)性改變，故早期預(yù)防和治療可能能減少免疫反應(yīng)引起的炎癥反應(yīng)并阻止COPD疾病的進(jìn)一步進(jìn)展，進(jìn)一步研究將著重于早期用藥對COPD治療的影響。

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[收稿2015-10-10;修回2015-11-12]

(編輯：王靜)

The role of CD80 and CD86 in rats with chronic obstructive pulmonary disease

GuYanhui，F(xiàn)uDandan，RaoXimin，OuyangYao

(Department of Respiratory Medicine，The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Zunyi Guizhou 563099，China)

[Abstract]Objective To study the expression changes of CD80 and CD86，as the costimulatory molecules of dendritic cell(DCs),in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) at different time periods in rats, and the effect of DCs in this pathogenesis.Methods 48 rats were randomly divided into control group (n=24) and COPD model group (n=24). The rats of COPD model group were established via intra-tracheal injection of lipopolysaccharide (LPS) solution twice in 4 weeks and cigarette inhalation twice daily. Then lung tissue and BALF of rats were investigated at 7-day, 14-day, 21-day and 28-day, respectively,Lung tissue pathology was examined by hematoxylin-eosin (HE staining), while the percentage of CD80 and CD86 was determined by FCM in the BALF.Results There was severe gradually inflammation in the airway and emphysema in COPD model, and the changes of pathology at 28-day were the same as those of COPD patients. There were no significant changes of CD80 and CD86 in BLAF at 7-day, 14-day, 21-day and 28-day in the control groups.Compared with the control group, the percentages of CD80 and CD86 in BALF were increased in COPD groups，but there were no significant increase at 7-day and 14-day，and significantly increased at 21-day and 28-day.Conclusion After four weeks, the COPD rat models were established successfully by this method. The percentages of CD80 and CD86 in BALF of COPD rat model groups were significantly upregulated, especially at 21-day and 28-day , suggesting that DCs may be gradually involved in COPD for inflammatory reaction, leading to the progression and irreversible COPD later. Early prevention and prompt treatment may reduce inflammation caused by the immune response and prevent further disease progression.

[Key words]chronic obstructive pulmonary disease; dendritic cells; BALF; CD80; CD86

[中圖法分類號]R563.3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1000-2715(2015)06-0595-04

[通信作者]歐陽瑤，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：COPD發(fā)病機(jī)制，E-mail:ouyangyao116@sohu.com。

[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(NO：81460008)。