富血小板纖維蛋白蓋髓的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

富血小板纖維蛋白蓋髓的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

李響1，孫淑芬1*，姜南1，武興2

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院)

直接蓋髓術(shù)是用藥物覆蓋在牙髓暴露處,以保護(hù)牙髓、保存牙髓活力的方法。而直接蓋髓術(shù)能否成功與蓋髓劑有著密切的關(guān)系,尋找一種性能優(yōu)越的蓋髓材料一直是學(xué)者們所關(guān)注的問(wèn)題。富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)是一種富含自體細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的新型生物材料。目前PRF已經(jīng)被應(yīng)用于口腔頜面外科、牙周科和口腔種植等領(lǐng)域，并均取得了較好的臨床療效，但關(guān)于將PRF作為蓋髓劑應(yīng)用于牙體的報(bào)道卻很少。據(jù)報(bào)道，PRF具有很好的促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖和分化的能力，且在組織愈合、炎癥調(diào)節(jié)和抗感染方面也具有良好的效果[1，2]。本實(shí)驗(yàn)以PRFDycal、Dycal及PRF分別作為蓋髓劑對(duì)家兔門(mén)齒進(jìn)行直接蓋髓術(shù)，觀察術(shù)后牙髓的炎癥情況和修復(fù)性牙本質(zhì)的形成程度。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選取3.0-3.5 kg的健康家兔21只及對(duì)照兔1只(購(gòu)于吉林大學(xué)口腔醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室)，左右上頜前牙共42顆實(shí)驗(yàn)牙，分為3組：PRFDycal組、Dycal組和PRF組，5 d和10 d兩個(gè)實(shí)驗(yàn)周期。

1.2主要材料和試劑Dycal(登士柏，美國(guó))、玻璃離子水門(mén)汀(上海醫(yī)療器械股份有限公司齒科材料廠)、臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(貝克曼儀器公司 美國(guó))、電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)、顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本)、自動(dòng)脫水處理機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)上海有限公司)、常規(guī)手術(shù)器械(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理科提供)

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)步驟自家兔耳中動(dòng)脈采血制備PRF膜[1]。按0.1 ml/kg注射氯眠寧麻醉動(dòng)物，仰臥固定；用3%的H2O2液清潔口腔，洗必泰消毒實(shí)驗(yàn)牙齒；用006球鉆在唇側(cè)頸部制洞，見(jiàn)洞底透紅后，用自制直徑0.5 mm的探針輕輕穿髓，生理鹽水沖洗，無(wú)菌棉球輕壓止血，將蓋髓劑分別放于漏髓處，然后以玻璃離子水門(mén)汀充填窩洞。

1.3.2組織學(xué)標(biāo)本制作分別在術(shù)后5 d和10 d灌流處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分離上下頜骨，4%多聚甲醛固定72 h，15%EDTA(pH=7.2-7.4)脫鈣6周，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，包埋，以平行于牙長(zhǎng)軸方向做頰舌向連續(xù)切片，HE染色，樹(shù)膠封片，光鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 17.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。卡方檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。P<0．05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

PRFDycal、Dycal及PRF分別作為蓋髓劑對(duì)家兔門(mén)齒進(jìn)行直接蓋髓術(shù)，術(shù)后5d組織學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。PRFDycal組(圖1a)：均未見(jiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成。4例露髓口下方可見(jiàn)散在的鈣化團(tuán)塊，大量炎癥細(xì)胞聚集。2例無(wú)鈣化物形成，露髓口下方大量中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞聚集，血管數(shù)量增加，擴(kuò)張充血明顯。1例牙髓細(xì)胞壞死或崩解，髓腔空虛。Dycal組(圖1b)：均未見(jiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成。4例露髓口下方可見(jiàn)散在的鈣化團(tuán)塊，大量炎癥細(xì)胞聚集。3例牙髓細(xì)胞壞死或崩解，髓腔空虛。PRF組(圖1c)：均未見(jiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成。4例無(wú)鈣化物形成，露髓口下方大量中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞聚集，血管數(shù)量增加，擴(kuò)張充血明顯。3例牙髓細(xì)胞壞死或崩解，髓腔空虛。術(shù)后10d組織學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。PRFDycal組(圖1d)：3例可見(jiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成，髓腔內(nèi)可見(jiàn)散在的鈣化團(tuán)塊，露髓口下方可見(jiàn)少量炎細(xì)胞或無(wú)炎細(xì)胞。4例無(wú)完整修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成，但髓腔內(nèi)可見(jiàn)大量鈣化團(tuán)塊形成，隔絕損傷處與健康牙髓，露髓口下方可見(jiàn)中等程度炎細(xì)胞聚集及血管增生、擴(kuò)張充血。Dycal組(圖1e)：1例可見(jiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成，髓腔內(nèi)可見(jiàn)散在的鈣化團(tuán)塊，中等程度炎細(xì)胞聚集。2例無(wú)完整修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成，但髓腔內(nèi)可見(jiàn)大量鈣化團(tuán)塊，呈彌漫性鈣化。4例牙髓細(xì)胞壞死或崩解，髓腔空虛。PRF組(圖1f)：1例髓腔內(nèi)可見(jiàn)少量鈣化團(tuán)塊形成，2例未見(jiàn)鈣化團(tuán)塊形成，此3例牙髓內(nèi)均有大量炎癥細(xì)胞聚集，血管數(shù)量增加，擴(kuò)張充血明顯。4例牙髓細(xì)胞壞死或崩解，髓腔空虛。

a PRFDycal直接蓋髓后5 d(HE×40)；b Dycal直接蓋髓后5 d(HE×40)；c PRF直接蓋髓后5 d(HE×40)；d PRFDycal直接蓋髓后10 d(HE×40)；e Dycal直接蓋髓后10 d(HE×40)；f PRF直接蓋髓后10 d(HE×40)；g 正常牙髓組織(HE×40)

圖1HE染色圖片

3討論

目前臨床常用的蓋髓材料中，以氫氧化鈣制劑的應(yīng)用最為廣泛，且療效也相對(duì)肯定，是常規(guī)蓋髓材料的金標(biāo)準(zhǔn)[3]，故選作本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照材料。有機(jī)生物材料對(duì)修復(fù)性牙本質(zhì)形成具有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，但異體生物材料存在潛在的排異反應(yīng)，獲取成本也較高，不適合臨床推廣應(yīng)用[4]。富血小板纖維蛋白(PRF)是新一代自體有機(jī)生物材料，取材簡(jiǎn)便，成本低廉，且不存在免疫排斥反應(yīng)。PRF中含有大量的血小板和白細(xì)胞，其纖維蛋白將血小板與生物因子以化學(xué)鍵的方式相結(jié)合，并可緩慢釋放其中的生物因子，包括血小板衍生生長(zhǎng)因子AB(PDGF-AB) 、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF )、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)、表皮生長(zhǎng)因子 (EGF) 等[5]。

本實(shí)驗(yàn)選取家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，由于家兔屬大型嚙齒類(lèi)動(dòng)物，身體抵抗力好，便于取血，牙齒生長(zhǎng)速度快，牙髓自身修復(fù)能力較強(qiáng)，雖然與人類(lèi)牙齒存在較大差異，但其快速修復(fù)能力可使我們能夠在PRF有效釋放主要生物因子期間觀察到PRF在牙髓損傷修復(fù)中的作用。有研究指出，PRF能夠緩慢釋放生物因子持續(xù)7-10天[6]，最長(zhǎng)可達(dá)28 d[7]。故本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)5 d和10 d兩個(gè)周期，本實(shí)驗(yàn)周期的設(shè)計(jì)與家兔牙齒的生長(zhǎng)速度和PRF的生物因子釋放速度相吻合。

體外研究指出，PRF促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖和分化，顯著上調(diào)堿性磷酸酶(ALP)和骨保護(hù)素(OPG)的表達(dá)，促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成[2]。另有大量研究證明，PRF主要通過(guò)緩慢釋放生物因子實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)作用，PRF釋放的生物因子在牙髓損傷修復(fù)中具有重要的作用，其中，PDGF-AB對(duì)多種細(xì)胞均具有強(qiáng)效的趨化作用，促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖和分化，同時(shí)它又是成纖維細(xì)胞的有絲分裂劑，促使成纖維細(xì)胞增殖[8,9]。TGF-β1和EGF均可促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖、遷移和分化，且TGF-β1 在損傷的牙髓中還參與基質(zhì)的分泌和免疫反應(yīng)過(guò)程[10,11]。

以上研究均是PRF在體外的諸多促進(jìn)表現(xiàn)，根據(jù)其表現(xiàn)我們推測(cè)，PRF可能會(huì)在牙髓損傷修復(fù)中發(fā)揮其積極的生物學(xué)作用，故我們進(jìn)行了此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究，但PRF組卻得到了與預(yù)期相反的結(jié)果。PRF組結(jié)果顯示：術(shù)后5 d時(shí)和10 d時(shí)，幾乎無(wú)修復(fù)性牙本質(zhì)形成，且牙髓內(nèi)呈現(xiàn)不同程度的炎癥表現(xiàn)。為什么性能優(yōu)越的PRF在本實(shí)驗(yàn)中卻沒(méi)有優(yōu)越的結(jié)果出現(xiàn)，我們分析原因可能是：試驗(yàn)中我們?cè)赑RF外以玻璃離子水門(mén)汀封洞，而玻璃離子對(duì)牙髓具有一定的刺激性，會(huì)引起牙髓壞死；另外，PRF膜直接覆蓋在露髓口上，其封閉性能較差，加之PRF膜表面濕度較大，而玻璃離子遇水不易固化，影響其封閉性，易形成邊緣微滲漏[12]。術(shù)后難以避免細(xì)菌侵入牙髓，使牙髓受到了外界的污染刺激，而刺激程度超過(guò)了PRF的修復(fù)能力，導(dǎo)致PRF的優(yōu)越性能不能體現(xiàn)出來(lái)，至牙髓崩解壞死，這可能是引起本實(shí)驗(yàn)PRF組出現(xiàn)陰性結(jié)果的主要原因。

雖然PRF組的結(jié)果不盡如人意，但本實(shí)驗(yàn)還出現(xiàn)了另外一種非常值得我們思考的結(jié)果：術(shù)后5 d，PRFDycal組與Dycal組均無(wú)牙本質(zhì)橋形成，但牙髓內(nèi)均有修復(fù)性牙本質(zhì)鈣化團(tuán)塊形成，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而術(shù)后10 d，PRFDycal組除了有多例牙本質(zhì)橋形成外，牙髓內(nèi)還有大量的修復(fù)性牙本質(zhì)的鈣化團(tuán)塊形成，且形成量及例數(shù)均明顯較Dycal組多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們還觀察到，在PRFDycal組所形成的大量修復(fù)性牙本質(zhì)鈣化團(tuán)塊中多處可見(jiàn)被包裹的成牙本質(zhì)細(xì)胞(如圖d)。這可能由于PRFDycal激活牙髓內(nèi)的未分化的間充質(zhì)細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞或?yàn)閾p傷的成牙本質(zhì)細(xì)胞，在損傷部位快速分泌牙本質(zhì)基質(zhì)，由于形成速度過(guò)快，導(dǎo)致部分成牙本質(zhì)細(xì)胞被包裹在鈣化團(tuán)塊中，形成一種骨樣牙本質(zhì)狀的鈣化物。PRFDycal組之所以出現(xiàn)如此顯著的療效，我們分析原因可能由于兩種材料互相促進(jìn)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，各自發(fā)揮優(yōu)勢(shì)導(dǎo)致的。因?yàn)镈ycal的顆粒小，流動(dòng)性好，可以覆蓋PRF及其邊緣，并很快凝固，故邊緣封閉性良好，且硬度及強(qiáng)度較大[3]，彌補(bǔ)了PRF封閉性差、濕度大的缺點(diǎn)，并保持了PRF緩慢釋放生物因子和促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及修復(fù)性牙本質(zhì)形成的優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)PRF也緩沖了Dycal的強(qiáng)堿性，減輕了Dycal的細(xì)胞毒性，彌補(bǔ)了Dycal生物相容性差的缺點(diǎn)[14]，并保持了其抗菌性及促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成的優(yōu)點(diǎn)[3,13]。兩個(gè)周期內(nèi)，PRFDycal組均無(wú)變性和壞死現(xiàn)象出現(xiàn)，而Dycal組出現(xiàn)多例牙髓彌漫性鈣化、變性和壞死，可能由于Dycal具有強(qiáng)堿性，易造成與之相接觸的牙髓組織出現(xiàn)局部變性和壞死導(dǎo)致的[14]。

更值得關(guān)注的是，PRFDycal組有鈣化橋形成的樣本中炎癥明顯減輕甚至無(wú)炎癥，而Dycal組和PRF組均存在不同程度的炎癥?？赡苡捎赑RF中富含大量與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞因子， Dohan DM 等分析PRF中存在的主要白細(xì)胞，包括3種促炎細(xì)胞因子IL-1β，IL-6,TNF-α，一個(gè)抑炎細(xì)胞因子IL-4和一個(gè)血管生成促進(jìn)因子VEGF，它們通過(guò)分泌細(xì)胞因子作用于止血和炎癥反應(yīng)過(guò)程，研究結(jié)果顯示PRF具有促進(jìn)組織愈合，在炎癥調(diào)節(jié)和抵抗感染方面可能發(fā)揮一定的積極作用[1]。說(shuō)明PRF在有Dycal存在時(shí)的抗炎調(diào)節(jié)作用更加顯著。

本實(shí)驗(yàn)以PRF作為蓋髓劑應(yīng)用于牙髓損傷的修復(fù)治療中，對(duì)其可行性和應(yīng)用方式進(jìn)行初步探索，從本次試驗(yàn)的結(jié)果中可以得出結(jié)論：PRFDycal可以更好的發(fā)揮促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成和抗炎調(diào)節(jié)的作用。但單獨(dú)以PRF膜作為蓋髓材料在封閉性能上存在著一定的缺陷，有望在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將此材料的應(yīng)用方式改良，使其更有效的發(fā)揮優(yōu)勢(shì)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Dohan DM,Choukroun J,Diss A,et al.Platelet-rich fibrin(PRF):a second-generation platelet concentrate[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2006,101:e37.

[2]Huang FM,Yang SF,Zhao JH,et al.Platelet-rich fibrin increases proliferation and differentiation of human dental pulp cells[J].J Endod,2010,36(10):1628.

[3]Parolia A,Kundabala M,Rao NN,et al.A comparative histological analysis of human pulp following direct pulp capping with Propolis,mineral trioxide aggregate and Dycal[J].Aust Dent J,2010,55(1):59.

[4]Ko H，Yang W，Park K，et al.Cytotoxicity of mineral trioxide aggregate ( MTA) and bone morphogenetic protein 2(BMP-2) andresponse of rat pulp to MTA and BMP-2[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2010，109(6):e103.

[5]Kang YH，Jeon SH，Park JY，et al.Platelet-rich fibrin is a bio-scaffold and reservoir of growth factors for tissue regeneration[J]．Tissue Eng Part A，2011，17(3-4):349.

[6]Dohan Ehrenfest DM,de Peppo G M,Doglioli P,et al.Slow release of growth factors and thrombospondin-1 in Choukroun's platelet-rich fibrin (PRF):a gold standard to achieve for all surgical platelet concentrates technologies[J].Growth Factors,2009,27(1):63.

[7]He L，Lin Y，Hu X，et al.A comparative study of platelet-rich fibrin ( PRF) and platelet-rich plasma ( PRP) on the effect of proliferation and differentiation of rat osteoblasts in vitro[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2009，108:707.

[8]Yokose S,Kadokura H,Tajima N .Platelet-derived growth factor exerts disparat e effect s on odontoblast differentiation depending on the dimers in rat dental pulp cells[ J] .Cell Tissue Res,2004 ,315(3):375.

[10]FargesJ C,Romeas A,Melin M,et al.TGF-beta1 induces accumulation of dendritic cells in the odontoblast layer[J].J Dent Res,2003,82(8):652.

[11]Melin M,Joffre-Romeas A,FargesJ C,et al.Effects of TGF-beta 1 on dental pulp cells in cultured human tooth slices[J].J Dent Res,2000,79(9):1689.

[12]崔愷,陳吉華,趙三軍.玻璃離子水門(mén)汀的研究進(jìn)展[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2008,11:644.

[13]Leye Benoist F，Gaye Ndiaye F,Wakhade Kane A,et al.Evaluation of mineral trioxide aggregate ( MTA) versus calcium hydroxide cement(Dycal) in the formation of a dentine bridge:a randomized controlled trial[J].Int Dent J，2012，62(1):33.

[14]Guven EP，Yalvac ME，Sahin F，et al． Effect of dental materials calcium hydroxide-containing cement，mineral trioxide aggregate，and enamel matrix derivative on proliferation and differentiation of human tooth germ stem cells[J]． J Endod，2011，37(5):650.

收稿日期：(2013-09-27)

文章編號(hào)：1007-4287(2015)03-0363-03

通訊作者*