吸煙和不同飼養(yǎng)方式對大鼠動脈粥樣硬化的影響

韓婷姣，許建英

吸煙和不同飼養(yǎng)方式對大鼠動脈粥樣硬化的影響

韓婷姣1，許建英2

摘要：目的探討吸煙和不同飼養(yǎng)方式對大鼠動脈粥樣硬化形成的影響及其可能的機制。方法將48只6周齡清潔級雄性SD大鼠按吸煙與否和不同飼養(yǎng)方式隨機分為吸煙正常、高脂和饑餓組及非吸煙正常、高脂和饑餓組，分別給予香煙煙霧或空氣暴露和正常、高脂及饑餓飼養(yǎng)。24周后檢測大鼠Lee’s指數(shù)，觀察主動脈粥樣硬化病理學改變，免疫組化法檢測主動脈血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和脂聯(lián)素(APN)水平。結(jié)果吸煙影響Lee’s指數(shù)，主動脈VEGF，血清TNF-α、IL-6和APN水平(F值分別為27.710，55.370，47.310，37.405，7.064；P<0.05)。吸煙使Lee’s指數(shù)降低，使主動脈VEGF，血清TNF-α和IL-6水平增高。不同飼養(yǎng)方式影響Lee’s指數(shù)，主動脈VEGF，血清TNF-α、IL-6和APN水平(F值分別為95.290，3.915，7.276，9.791，48.877；P<0.05)。吸煙組和非吸煙組內(nèi)均高脂組Lee’s指數(shù)高于正常組和饑餓組，正常組高于饑餓組。吸煙組內(nèi)：高脂組主動脈VEGF水平高于正常組和饑餓組；高脂組和饑餓組血清TNF-α和IL-6水平均高于正常組；高脂組血清APN水平低于正常組和饑餓組，正常組低于饑餓組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對于血清APN，吸煙和不同飼養(yǎng)方式有交互作用(F=10.675，P<0.05)。非高脂飼養(yǎng)(正常組和饑餓組)大鼠，吸煙使血清APN水平升高；高脂組大鼠，吸煙使血清APN水平降低。吸煙組主動脈VEGF與血清TNF-α和IL-6水平呈正相關(guān)(r值分別為0.471，0.448；P<0.05)。鏡下觀察主動脈，發(fā)現(xiàn)非吸煙組無動脈粥樣硬化發(fā)生，吸煙組可見早期動脈粥樣硬化改變。結(jié)論吸煙和不同飼養(yǎng)方式均可影響動脈粥樣硬化形成，吸煙且高脂飼養(yǎng)狀態(tài)動脈粥樣硬化最顯著，系統(tǒng)性炎癥反應可能參與其中。

關(guān)鍵詞：動脈粥樣硬化；飼養(yǎng)方式；吸煙

動脈粥樣硬化是多種心血管系統(tǒng)疾病的基本病理改變，且是一種復雜的炎性病變疾病，有多種因素共同參與[1]，包括遺傳、年齡、性別等不可控因素和飲食習慣、吸煙、肥胖、高脂血癥、高血壓等可控因素，而其確切發(fā)病機制尚不明確，可能有血管內(nèi)皮細胞功能紊亂、炎癥反應、氧化應激、血脂代謝異常等機制參與其中。而當前隨著社會經(jīng)濟條件的改善，人們飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，肥胖、吸煙人群增多，動脈粥樣硬化的患病率也逐年增高。因此本實驗擬通過觀察正常、高脂和饑餓飼養(yǎng)的吸煙及非吸煙大鼠動脈粥樣硬化程度及血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和脂聯(lián)素(APN)的水平，探討不同飼養(yǎng)方式和吸煙對動脈粥樣硬化的影響及其可能的機制。

1材料與方法

1.1動物分組和模型建立清潔級健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量200 g±20 g，由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供；按吸煙與否和不同飼養(yǎng)方式隨機均分為吸煙正常組、吸煙高脂組、吸煙饑餓組、非吸煙正常組、非吸煙高脂組和非吸煙饑餓組。參照文獻[2]自制大鼠實驗性吸煙裝置，卷煙為市場銷售的紅旗渠牌卷煙，焦油含量每支11 mg，煙堿含量每支0.9 mg。吸煙組大鼠于裝置內(nèi)給予煙霧暴露，每周熏煙6 d，每天上、下午各1次，每次15支，每支香煙點燃15 min后換煙，每次1.5 h。非吸煙組同時放至相同裝置內(nèi)給予空氣暴露。正常組給予脂肪能量百分比為10%的D12450B普通飼料(100 g體重10 g/d)；高脂組給予脂肪能量百分比為45%的D12451高脂飼料(100 g體重10 g/d)；饑餓組給予脂肪能量百分比為10%的D12450B普通飼料(100 g體重6 g/d)，飼料均購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。余飼養(yǎng)條件相同。每周記錄大鼠體重(g)及體長(cm)，以監(jiān)測大鼠生長狀況。共建造模型24周。

作者單位：1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院(太原 030001)；2.山西醫(yī)科大學附屬山西大醫(yī)院

1.2Lee’s指數(shù)測定24周后腹腔注射麻醉大鼠，測量其體重(g)及體長(cm)(大鼠鼻尖至肛門的距離)，計算Lee’s指數(shù)=(體重×1 000)1/3/體長。

1.3血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和脂聯(lián)素(APN)檢測腹主動脈采血，離心，分裝血清，-80 ℃凍存。用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定血清TNF-α、IL-6和APN水平(APN試劑盒購自美國R&D生物科技有限公司，TNF-α和IL-6試劑盒購自上海藍基生物科技有限公司)。

1.4主動脈病理學分析及VEGF測定取主動脈根至胸主動脈血管，同上述步驟制成HE染色切片。觀察主動脈病理學改變。采用改良鏈酶親和素-生物素-過氧化物霉復合物(SABC)法檢測主動脈VEGF水平。試劑，一抗：VEGF兔抗大鼠多克隆抗體(1∶150稀釋)；二抗：SABC免疫組化染色試劑盒DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司?；静襟E：上述蠟塊同步制成帶電荷切片，常規(guī)脫蠟至水，過氧化氫10 min，抗原修復，封閉，先后加一抗、二抗及SABC、DAB顯色劑。陽性結(jié)果為細胞質(zhì)棕黃色。每只大鼠取1個切片，每張切片×400下隨機選取5個視野進行圖像采集，用Image-Pro Plus 6.0軟件處理分析，計算平均積分光密度(積分光密度/面積)。

2結(jié)果

2.1Lee’s指數(shù)析因分析及各組比較吸煙和不同飼養(yǎng)方式均影響Lee’s指數(shù)水平(F值分別為27.710，95.290；P<0.05)，兩者間無交互作用(F=0.455，P>0.05)。吸煙組與非吸煙組比較，Lee’s指數(shù)降低。吸煙組和非吸煙組內(nèi)均高脂組Lee’s指數(shù)高于正常組和饑餓組，正常組高于饑餓組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1、表2。

表1　各指標析因分析結(jié)果

表2　6組各指標的比較(±s)

2.2主動脈病理學改變和VEGF水平析因分析鏡下發(fā)現(xiàn)非吸煙組無動脈粥樣硬化發(fā)生，內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)完整，無增生，層次較為清楚；吸煙組可見早期動脈粥樣硬化改變，內(nèi)皮細胞水腫，平滑肌細胞遷移和增生。吸煙和不同飼養(yǎng)方式均影響主動脈VEGF水平(F值分別為55.370，3.951；P<0.05)，兩者間無交互作用(F=1.261，P>0.05)。吸煙組與非吸煙組比較，主動脈VEGF水平增高。吸煙組內(nèi)高脂組主動脈VEGF水平高于正常組和饑餓組，差異均有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。吸煙組內(nèi)正常組和饑餓組主動脈VEGF表達水平、非吸煙組內(nèi)3組主動脈VEGF表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1、表2。

2.3血清TNF-α和IL-6水平析因分析吸煙和不同飼養(yǎng)方式均影響血清TNF-α和IL-6水平(F值分別為47.310，7.276，37.405，9.791，P<0.05)，兩者間均無交互作用(F值分別為0.413，0.499；P>0.05)。吸煙組與非吸煙組比較，血清TNF-α和IL-6水平增高。吸煙組內(nèi)高脂組和饑餓組血清TNF-α和IL-6水平均高于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，高脂組與饑餓組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1、表2。

2.4血清APN水平析因分析吸煙和不同飼養(yǎng)方式均影響血清APN水平(F值分別為7.064，48.877；P<0.05)，兩者間有交互作用(F=10.675，P<0.05)。非高脂飼養(yǎng)(正常組和饑餓組)大鼠吸煙使血清APN水平升高，高脂組大鼠吸煙使血清APN水平降低。吸煙組內(nèi)高脂組血清APN水平低于正常組和饑餓組，正常組低于饑餓組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1、表2。

2.5吸煙組各因子相關(guān)性分析吸煙組主動脈VEGF與血清TNF-α和IL-6水平呈正相關(guān)(r值分別為0.471，0.448；P<0.05)。

3討論

本研究通過分析各組大鼠Lee’s指數(shù)水平，發(fā)現(xiàn)不同飼養(yǎng)方式影響Lee’s指數(shù)，吸煙及非吸煙大鼠均為高脂飼養(yǎng)狀態(tài)Lee’s指數(shù)最高和饑餓飼養(yǎng)狀態(tài)Lee’s指數(shù)最低。并觀察了各組大鼠主動脈病理學改變，發(fā)現(xiàn)吸煙大鼠主動脈有早期動脈粥樣硬化改變。Celletti等[3]研究表明VEGF可促進動脈粥樣硬化進展的速度和程度，本研究發(fā)現(xiàn)吸煙和不同飼養(yǎng)方式均影響大鼠主動脈VEGF，吸煙且高脂飼養(yǎng)大鼠動脈粥樣硬化VEGF水平最高，故吸煙和高脂飼養(yǎng)均可促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。這證實了目前的臨床研究結(jié)論，吸煙[4]和肥胖均為冠心病的危險因素。目前關(guān)于吸煙和肥胖促進動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的作用機制尚不確切?，F(xiàn)認為動脈粥樣硬化是一種炎性病變疾病，本研究推測以上兩因素可能通過炎癥反應參與其中，故進一步觀測了各組大鼠血清TNF-α、IL-6、APN的水平。

本研究發(fā)現(xiàn)吸煙使大鼠血清TNF-α和IL-6的水平增高，且吸煙大鼠TNF-α、IL-6與動脈粥樣硬化程度呈正相關(guān)。TNF-α[5]和IL-6可通過促進黏附分子分泌、介導內(nèi)皮細胞損傷、促進血栓形成等途徑促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。故表明吸煙可能通過系統(tǒng)性炎癥反應促進動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展。

有研究證實APN具有抗炎和抗動脈粥樣硬化作用，低APN血癥是冠心病的獨立危險因素[6]。本研究發(fā)現(xiàn)吸煙和不同飼養(yǎng)方式對血清APN影響存在交互作用。吸煙且高脂飼養(yǎng)大鼠血清APN水平較非吸煙且高脂飼養(yǎng)大鼠低，血清TNF-α和IL-6水平較吸煙且正常飼養(yǎng)大鼠高。APN可通過抑制成熟巨噬細胞功能、粒-單系祖細胞的生長、TNF-α在血漿中的濃度等多種途徑發(fā)揮抗炎作用，通過保護血管內(nèi)皮細胞[7]、抑制巨噬細胞對膽固醇酯的攝取[8]、抑制平滑肌細胞增生遷移[9-10]等多種機制發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。故推測吸煙且高脂飼養(yǎng)大鼠可能由于血清APN水平的降低，抗炎、抗動脈粥樣硬化作用減弱，且系統(tǒng)炎癥反應增強，導致動脈粥樣硬化最為顯著。本研究還發(fā)現(xiàn)吸煙且饑餓飼養(yǎng)大鼠血清APN、TNF-α和IL-6水平均比吸煙且正常飼養(yǎng)大鼠高，兩組大鼠主動脈VEGF雖差異無統(tǒng)計學意義，但吸煙且饑餓飼養(yǎng)大鼠有增高趨勢。腫瘤疾病厭食惡病質(zhì)和維持性血液透析消瘦病人炎癥因子顯著升高[11]，故推測上述結(jié)果原因為吸煙和饑餓狀態(tài)均為系統(tǒng)性炎癥反應增高，而增高的APN尚不足以對抗所致。但尚需進一步的研究予以證實。

綜上所述，本研究結(jié)果提示吸煙和不同飼養(yǎng)方式均可影響動脈粥樣硬化形成，吸煙且高脂飼養(yǎng)狀態(tài)動脈粥樣硬化最顯著，炎癥反應可能參與其中。

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(本文編輯郭懷印)

(收稿日期：2015-05-11)

通訊作者：許建英，E-mail：xujyty@126.com

中圖分類號：R543.5R256.2

文獻標識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2015．18．011

文章編號：1672-1349(2015)18-2064-03