溶髓方干預(yù)大鼠頸椎動(dòng)力平衡失調(diào)后椎間盤髓核細(xì)胞體的體視學(xué)研究*

溶髓方干預(yù)大鼠頸椎動(dòng)力平衡失調(diào)后椎間盤髓核細(xì)胞體的體視學(xué)研究*

★章友財(cái)1*第一作者：章友財(cái)(1973—)，男，學(xué)士，主治醫(yī)師。研究方向：四肢及脊柱相關(guān)疾病。劉金浪1,2(1.永修縣中醫(yī)院江西 永修 330300；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院研究生南寧 530001)

摘要：目的：觀察全國名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方溶髓方對大鼠頸椎動(dòng)力平衡失調(diào)模型中椎間盤髓核組織超微結(jié)構(gòu)的影響，探索研究溶髓方防治頸椎間盤退行性病變的作用機(jī)制。方法：選取健康wistar大白鼠36只，隨機(jī)分為空白組、對照組和實(shí)驗(yàn)組各12只。實(shí)驗(yàn)組和對照組建立wista大鼠動(dòng)靜力失衡性頸椎間盤退變模型;空白組為假手術(shù)組，僅切開頸椎后緣皮膚后即縫合。造模后2周開始灌胃，實(shí)驗(yàn)組給溶髓方湯劑，對照組和空白組分別給生理鹽水，每日1次，持續(xù)喂藥1個(gè)月，分別于造模后第9周、第18周、第36周處死三組大鼠，并取下頸椎第4/5、5/6椎間盤。行椎間盤髓核HE染色，并從組織超微結(jié)構(gòu)線粒體層面，透射電鏡觀察來評定溶髓方干預(yù)本病的療效。結(jié)果：造模期滿后，透射電鏡下大鼠椎間盤細(xì)胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)退變細(xì)胞，核膜皺縮，細(xì)胞質(zhì)濃縮，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。給藥后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)大部分可見完整的結(jié)構(gòu)，嵴結(jié)構(gòu)清晰，腫脹消失，其基質(zhì)呈深暗色，數(shù)量增加。而對照組線粒體無明顯恢復(fù)，細(xì)胞則繼續(xù)呈現(xiàn)凋亡表現(xiàn)。再從線粒體體視學(xué)層面上觀察分析，藥物干預(yù)后的實(shí)驗(yàn)組、對照組的線粒體體密度接近空白組，兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而實(shí)驗(yàn)組的線粒體數(shù)密度、比表面積、比膜面積數(shù)值都較對照組有明顯增大，有可比性(P<0.05)，上述表現(xiàn)隨著時(shí)間推移更加明顯。結(jié)論：大鼠頸椎間盤退行性病變初期，予溶髓方口服治療，從超微結(jié)構(gòu)線粒體水平上觀察，其細(xì)胞恢復(fù)效果較顯著，基本證實(shí)溶髓方能防治早期頸椎間盤退行性病變。

關(guān)鍵詞：椎間盤退變；頸椎；動(dòng)力平衡失調(diào)；線粒體；體視學(xué)

頸椎間盤的退行性病變是導(dǎo)致頸椎病的病理學(xué)基礎(chǔ)，椎間盤髓核組織在退變中會(huì)較早發(fā)生組織形態(tài)學(xué)改變，因此，通過研究椎間盤髓核組織的退變這一始動(dòng)因素，揭示髓核的超微結(jié)構(gòu)變化，從而認(rèn)識其退變過程，鑒于中藥方劑在干預(yù)椎間盤退變動(dòng)物模型中對髓核組織超微結(jié)構(gòu)的研究較少，本研究選用已在臨床上具有較好效果的全國名老中醫(yī)方劑經(jīng)驗(yàn)方溶髓方作為干預(yù)藥物，通過動(dòng)物造模實(shí)驗(yàn)對頸椎間盤的超微結(jié)構(gòu)及線粒體的觀察，對其療效機(jī)制層面做進(jìn)一步研究?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料

1.1　動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選擇6月齡wistar大鼠，雌雄各半，體重90～120g。廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心對本研究提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，動(dòng)物合格證號(SCXK桂2003-0003)。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置參照科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)。

1.2　試藥

溶髓方：當(dāng)歸15g,白芍15g,赤芍12g,乳香9g,沒藥9g,田七9g,雞血藤20g,秦艽12g,五加皮12g,川續(xù)斷12g,牛膝10g,延胡索12g。蘇木色精、伊紅(水溶性)(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3　儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)公司)；全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(德國美康公司)；H-7650型透射電子顯微鏡(HITACHI)。

2方法

2.1　動(dòng)物模型的建立

2.1.1動(dòng)物分組將36只健康的wistar大鼠隨機(jī)分成3組：空白組、對照組、實(shí)驗(yàn)組，每組12只，雌雄分開喂養(yǎng)。亞組分組：按照處死時(shí)間每組再隨機(jī)分3個(gè)亞組，分別是9周、18周、36周，4只樣本每個(gè)亞組，隨機(jī)編號并記錄。

2.1.2建立動(dòng)物模型空白組行假手術(shù)，僅切開頸椎后緣皮膚后縫合。對實(shí)驗(yàn)組及對照組行實(shí)驗(yàn)造模，造模采用wista大鼠頸椎動(dòng)力平衡失調(diào)椎間盤退變模型，頸椎的兩柱或三柱結(jié)構(gòu)破壞(動(dòng)靜力平衡失調(diào)，Static nonequilibrium)可引起或加速椎間盤退變已被大量研究證實(shí)[1-2]，本實(shí)驗(yàn)使用3%的戊巴比妥溶液腹腔注射麻醉,術(shù)前定位后，行手術(shù)區(qū)域常規(guī)碘伏消毒。沿頸背部棘突做后正中切口,切開皮膚后,沿棘突兩側(cè)切斷椎旁肌，分離附著于椎板、棘突及小關(guān)節(jié)的肌肉，暴露棘突、椎板和關(guān)節(jié)突,使用椎板鉗依次去除頸3～7的棘上韌帶、棘間韌帶及兩側(cè)關(guān)節(jié)突的后外1/2,切斷雙側(cè)豎棘肌，誘發(fā)脊柱及椎間盤加速退變，然后依次縫合各層組織，關(guān)閉手術(shù)切口，術(shù)畢，最后給予術(shù)后大鼠肌注一次青霉素抗感染治療。

2.2　給藥方法

實(shí)驗(yàn)組予以溶髓方煎至湯劑后灌胃，所用生藥劑量按照人與動(dòng)物千克體重?fù)Q算，溶髓方用生藥0.74 g/(kg·d)，相當(dāng)于臨床60kg體重人的等效劑量，于造模2周后灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃1個(gè)月?？瞻捉M和對照組予以等容量生理鹽水灌胃。

2.3　觀察項(xiàng)目及方法

分別在術(shù)后第9周、第18周、第36周以大劑量腹腔注射戊巴比妥溶液處死各組大鼠。使用手術(shù)顯微鏡下切取頸椎第4、5椎間盤(C4/5)髓核組織，將所取得的椎間盤髓核組織做成病理切片，進(jìn)行椎間盤HE染色，使用HE染色觀察椎間盤細(xì)胞形態(tài)，從而評估腰椎間盤髓核細(xì)胞凋亡狀況。同時(shí)在手術(shù)顯微鏡下切取頸椎第5、6椎間盤(C5～6)髓核組織，制備超微結(jié)構(gòu)透射電鏡切片，將各組制作好的切片，采用H-7650型透射電子顯微鏡觀察骨組織內(nèi)超微結(jié)構(gòu)線粒體在形狀、數(shù)目、結(jié)構(gòu)等層面的具體變化情況。

2.3.1HE染色法將所取各組C4/5髓核標(biāo)本標(biāo)本用4%多聚甲醛固定24h后取出后，梯度酒精脫水，無水酒精與二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，將包埋后的組織塊在切片機(jī)上連續(xù)切片，厚度為4um。經(jīng)蘇木精及伊紅液染色5～10min，中性樹膠封片，各組取6張×40倍椎間盤切片HE染色照片，觀察椎間盤髓核組織各切片組織形態(tài)學(xué)改變。

2.3.2超微結(jié)構(gòu)透射電鏡切片制備將所取各組C5/6髓核標(biāo)本投入2%戊二醛溶液中固定48 h(4℃條件下)；經(jīng)0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS液，pH 7.0)漂洗3次，每次15 min；2%鋨酸固定2 h，經(jīng)PBS液漂洗3次，每次15 min；乙醇逐級脫水：50%→70%→80%→90%→100%→100%，至丙酮，每次20 min；樣品用Epon 812包埋，包埋塊經(jīng)瑞典LKB-V超薄切片機(jī)切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色各15min。

圖1　椎間盤髓核HE染色(×40)

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1　各組頸椎間盤髓核組織HE染色結(jié)果

造模第9周后，實(shí)驗(yàn)組與對照組椎間盤髓核組織中可見大量炎性細(xì)胞浸潤并伴有新鮮肉芽組織及新生血管的形成，而空白組椎間盤髓核組織在9、18周未出現(xiàn)明顯退變，僅在36周是組織邊緣出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組與對照組髓核組織退變呈現(xiàn)進(jìn)行性加重，其中以對照組更加明顯，溶髓方對大鼠椎間盤髓核組織有明顯的干預(yù)作用，主要表現(xiàn)為減少細(xì)胞凋亡、抑制炎性細(xì)胞浸潤從而減緩髓核組織纖維化。見圖1。

3.2　各組頸椎間盤髓核組織透射電鏡觀察結(jié)果

空白組(第9、18、36周)：髓核細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器豐富，線粒體數(shù)量較多，呈橢圓形，基本無腫脹，雙層膜及嵴結(jié)構(gòu)清晰，嵴呈同心圓或縱形排列且密集清晰，細(xì)胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，細(xì)胞周圍可見分泌的粘多糖，罕見線粒體的腫脹或空泡樣變性，見圖2。

圖2　空白組髓核細(xì)胞(第9、18、36周)

實(shí)驗(yàn)組與對照組(第9周)：髓核細(xì)胞線粒體數(shù)量減少，近圓形，腫脹，嵴變短或消失，排列紊亂，結(jié)構(gòu)模糊，嵴溶解呈絮狀物沉積。髓核中活性軟骨細(xì)胞旁出現(xiàn)退變細(xì)胞，核膜皺縮，細(xì)胞質(zhì)濃縮。見圖3。

圖3　實(shí)驗(yàn)組與對照組髓核細(xì)胞(第9周)

實(shí)驗(yàn)組(第18、36周)：線粒體數(shù)量增多，腫脹較前消退，形態(tài)基本恢復(fù)橢圓形桿狀，嵴、膜結(jié)構(gòu)變清晰。見圖4。

圖4　實(shí)驗(yàn)組(第18、36周)

對照組(第18、36周)：線粒體數(shù)量依舊較少，腫脹變形，嵴、膜結(jié)構(gòu)模糊，出現(xiàn)大量大小不等的空泡，溶酶體明顯增多，可見“髓鞘樣”小體，出現(xiàn)大量嚴(yán)重退變細(xì)胞。見圖5。

圖5　對照組(第18、36周)

3.3　體視學(xué)參數(shù)計(jì)量結(jié)果

見表1。

表1　予造模后藥物干預(yù)后，對

注：與對照組比較，※P<0.001。

4討論

本實(shí)驗(yàn)造模方法采用大鼠頸椎動(dòng)靜力平衡失調(diào)模型，通過破壞大鼠頸椎周圍肌群，使其穩(wěn)定性喪失，從而加速椎間盤退變，間接造成椎間盤損傷，此方法來源于Ariga[6]所使用的實(shí)驗(yàn)方法。但是由于此方法造成椎間盤退變?yōu)榉e累漸進(jìn)的損傷過程，要求對大鼠進(jìn)行較長時(shí)間觀察，所以在本實(shí)驗(yàn)中時(shí)間最長的一組為36周。

椎間盤退變隸屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”“筋傷”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病病因常與肝腎不足、氣血虧虛有關(guān)。通常是虛實(shí)夾雜而至，當(dāng)人體正虛或外傷致瘀時(shí)，趁勢而入，彼此互為影響，合而為病。全國名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方溶髓方為李桂文教授的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)過長期的臨床使用及觀察，其有效性及安全性得到了廣大患者的認(rèn)可。該方以“益氣活血、通絡(luò)化瘀、表里兼顧、臟腑同治、整體調(diào)攝”的原則為主，依據(jù)中醫(yī)學(xué)“君臣佐使”的方劑原則，按上述治療頸椎病的治療原則，結(jié)合李教授多年用藥經(jīng)驗(yàn)，溶髓方組方而成。該方具有祛瘀通絡(luò)、行氣活血、滋養(yǎng)肝腎、散結(jié)止痛的功效。方中使用當(dāng)歸、白芍、赤芍之味，乃遵循“治風(fēng)先治血,血行風(fēng)自滅”之法，以達(dá)活血化瘀，疏達(dá)經(jīng)絡(luò)之效，使氣血生化有源；又用乳香、沒藥、田七、香附活血化瘀，使血得補(bǔ)而不滯，并能消腫止痛；以五加皮、川續(xù)斷補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋骨、兼祛風(fēng)濕，使正盛則邪自祛，牛膝、川續(xù)斷合用使氣血得以生化，強(qiáng)筋骨止疼痛；秦艽、延胡索可除周身痹痛；另加雞血藤使化瘀之力倍增[7]；用甘草理氣健脾，防滋補(bǔ)藥滋膩礙胃，并調(diào)和諸藥。以上諸藥合用，可達(dá)通經(jīng)絡(luò)、行氣血、益肝腎、止痹痛之效，可使瘀去壅解，經(jīng)絡(luò)氣血暢達(dá)，標(biāo)本兼治而除痹證之目的。

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(收稿日期：2015-07-29)編輯：曾文雪

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

基金項(xiàng)目：廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥科技專項(xiàng)課題(GZKZ1128)。