PPAR-γ在類風濕關節(jié)炎患者外周血單個核細胞中的表達及與疾病活動度的關系

陳瑞林, 黃文輝, 黃成輝, 陶　怡

(廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 風濕免疫科, 廣東 廣州, 510260)

PPAR-γ在類風濕關節(jié)炎患者外周血單個核細胞中的表達及與疾病活動度的關系

陳瑞林, 黃文輝, 黃成輝, 陶怡

(廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 風濕免疫科, 廣東 廣州, 510260)

摘要:目的探討類風濕關節(jié)炎(RA)患者外周血單個核細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)的表達水平，及與病情活動度的關系。方法選取40例活動期RA患者及40例同期健康體檢人群，分別設為RA組和HC組。實時熒光定量PCR法檢測PPAR-γ mRNA的表達水平，分析其與病情活動度的關系。結果RA組患者PPAR-γ mRNA表達水平高于HC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以DAS28評分為5.1為界分組，DAS28<5.1患者(26例)PBMC中PPAR-γ mRNA的表達高于DAS28≥5.1患者(14例)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RA組患者PBMC中PPAR-γ mRNA的表達與DAS28-CRP評分呈負相關(r=-0.467, P<0.05)。結論RA患者疾病活動度越低，PPAR-γ越高表達，提示PPAR-γ的表達可能是反映RA疾病活動度的一個有用指標。

關鍵詞:類風濕關節(jié)炎; 過氧化物酶體增殖物激活受體γ; 疾病活動度; DAS28評分

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種以外周多關節(jié)慢性炎癥及滑膜增生為主要表現(xiàn)，繼而發(fā)展為關節(jié)軟骨及軟骨下骨破壞的自身免疫性疾病[1]。已有研究顯示，關節(jié)滑膜巨噬細胞分泌各種細胞因子包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等，使滑膜處于慢性炎癥狀態(tài), TNF-α進一步破壞關節(jié)軟骨和骨，造成關節(jié)畸形[2]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)在炎癥反應中的作用引起了人們的關注。研究[3]表明，激活 PPAR-γ可調控多種基因表達，并產生抗炎作用。前期研究[4]也顯示PPAR-γ激動劑吡格列酮可顯著抑制膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)。但少有研究報道外周血中PPAR-γ表達與疾病活動度的關系。因此，本研究通過檢測RA患者外周血單個核細胞(PBMC)中PPAR-γ的表達水平，以探討PPAR-γ在RA發(fā)病過程中的可能作用及與病情活動度的關系，進一步闡明RA的發(fā)病機制。

1資料與方法

1.1　一般資料

選取2010年9月—2011年1月門診及住院收治的40例活動期RA患者，設為RA組。均符合美國風濕病學會(ACR)聯(lián)合歐洲抗風濕并聯(lián)盟(EULAR)的RA分類標準[5]。其中男5例，女35例；年齡24～65歲，平均50.5歲?；顒悠谕瑫r滿足下列條件: ① 4個或以上的關節(jié)腫脹; ② 6個或以上的關節(jié)觸痛; ③ 符合以下任意1條：隨訪當日晨僵持續(xù)時間≥45 min, 血沉(ESR)≥28 mm/h, C反應蛋白(CRP)>10 mg/L。排除標準：有嚴重心、肝、腎等重要臟器、血液、內分泌系統(tǒng)病變及病史者; 3個月以內接受過生物制劑或關節(jié)皮質類固醇治療；正處于急、慢性感染期間；惡性腫瘤者。同期選取健康體檢人群40例，設為HC組。其中男5例，女35例；年齡20～70歲，平均47.2歲。2組間年齡、性別等一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2　試劑與儀器

胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限公司)。TRIzol Reagent(Invitrogen公司)，PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司), SYBR Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒(大連寶生物工程有限公司); PCR引物合成由大連寶生物工程有限公司完成, ABI 7500 Real Time PCR儀(美國ABI公司)，Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀(Eppendorf公司)。

1.3　方法

1.3.1PBMC的制備：抽取清晨空腹靜脈血4 mL, 肝素抗凝，F(xiàn)icoll淋巴細胞分離液分離獲得PBMC。

1.3.2熒光定量PCR檢測PPAR-γ mRNA的表達：按照TRIzol試劑盒說明，TRIzol Reagent裂解PBMC 提取總RNA，熒光定量PCR方法檢測PPAR-γ的mRNA水平，反應按照試劑盒說明采用2步法完成。引物序列分別為: PPAR-γ：上游5′-TGAACGACCAAGTAACTCTCCTC-3′, 下游5′-GCTTTCGCAGGCTCTTTAG-3′，擴增產物片段長度144 bp; GAPDH: 上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′, 下游5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′, 擴增產物片段長度138 bp; 以GAPDH為內參，反應條件95 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s→60 ℃ 34 s, 40個循環(huán)。以cDNA標準品為模板制作標準曲線，按雙標準曲線法計算和比較mRNA的相對表達。

1.4　評價標準

采用疾病活動性評分(DAS28-CRP)評估RA患者的活動度/嚴重度。DAS28-CRP 包括人體28個關節(jié)的壓痛計數(shù)，腫脹計數(shù)，CRP的水平以及患者的自身綜合評估四個項目，應用公式加以運算。DAS28≥5.1重度活動；DAS28 3.2～<5.1中度活動，DAS28<3.2低度活動；DAS28<2.6病情緩解。

2結果

2.1　2組PPAR-γ mRNA表達水平的比較

RA組患者PBMC中PPAR-γ mRNA表達水平高于HC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖1。以DAS28評分為5.1為界分組，DAS28<5.1患者(26例)PBMC中PPAR-γ mRNA的表達高于HC組及DAS28≥5.1患者(14例)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); DAS28≥5.1患者表達高于HC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.2　RA組患者PBMC中PPAR-γ mRNA表達水平與DAS28-CRP評分關系

RA組患者PBMC中PPAR-γ mRNA的表達與DAS28-CRP評分呈負相關(r=-0.467，P<0.05)。見圖3。

與HC組比較，*P<0.05

與HC組比較，*P<0.05;

圖3RA組患者PBMC中PPAR-γ mRNA表達水平

與DAS28-CRP評分關系

3討論

PPAR-γ具有抗炎效應，在類風濕關節(jié)炎、骨關節(jié)炎和其他一些慢性炎癥疾病的發(fā)病機制起重要作用。在RA動物模型的研究中，發(fā)現(xiàn)了PPAR-γ激動劑噻唑烷二酮類藥的治療可減輕滑膜炎癥、炎癥骨丟失和骨侵蝕[6-8]。PPAR-γ活化對關節(jié)炎的保護作用，被Setoguchi等[9]報道的敲除PPAR-γ大鼠模型在膠原誘導刺激下發(fā)生的關節(jié)炎加重所證實。PPAR-γ激動劑抑制RA滑膜細胞在體外的增殖，并抑制前列腺素E2在RA滑膜成纖維細胞中的合成[10]。在無并發(fā)癥的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中, PPAR-γ激動劑吡格列酮可降低CRP及血清淀粉樣蛋白A并改善胰島素敏感性[11]; 在一項銀屑病關節(jié)炎開放試驗中，吡格列酮能夠減少腫脹和壓痛關節(jié)計數(shù)[12]。一項單中心雙盲臨床試驗結果提示，在伴發(fā)糖尿病的活動性RA患者中，吡格列酮可改善疾病活動度，但因為缺乏適當?shù)膶φ战M，無法獲得一個確定的結論[8]。以上研究結果均支持PPAR-γ激動劑可作為RA輔助治療，并起到抗炎的重要作用。

但在RA患者體內PPAR-γ的表達水平及其與疾病活動度的相關性卻極少報道。由于RA是一種系統(tǒng)性炎癥性疾病，其免疫病理事件涉及循環(huán)中大部分的淋巴細胞、單核細胞等，且關節(jié)內的活化炎癥細胞均可由外周激活的細胞池中募集而來。因此，對PBMC的研究可能更能反映患者的整體病理狀況。本研究發(fā)現(xiàn)RA組患者PBMC中PPAR-γ mRNA表達水平高于HC組(P<0.05)，并與RA患者DAS28-CRP評分呈負相關(r=-0.467,P<0.05), 即在DAS28評分較低的患者中PPAR-γ mRNA的表達水平更高。

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Expression of peroxisome proliferator-activated receptor-γ in peripheral blood mononuclear cells of patients with rheumatoid arthritis and its relationship with disease activity

CHEN Ruilin, HUANG Wenhui, HUANG Chenghui, TAO Yi

(DepartmentofRheumatology,TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedical

University,Guangzhou,Guangdong, 510260 )

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the expression of peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients with rheumatoid arthritis (RA) and its relationship with disease activity. MethodsForty active RA patients and 40 healthy participants were assigned to RA group and HC group respectively. The expression of PPAR-γ mRNA was analyzed by real-time quantitative reverse transcription-PCR. ResultsThe level of PPAR-γ mRNA expression was higher in the RA group than that in the HC group (P<0.05). According to score of disease activity in 28 joints (DAS28), the level of PPAR-γ mRNA in PBMC of patients with DAS 28 less than 5.1 (n=26) was significantly higher than that in patients with DAS 28 over than 5.1 (n=14) (P<0.05). There was a negative correlation between expression of PPAR-γ mRNA and outcomes of DAS28. ConclusionThe expression of PPAR- may reflect the disease activity of patients with RA.

KEYWORDS:rheumatoid arthritis; peroxisome proliferator-activated receptor-γ; disease activity; DAS28

通信作者:黃文輝, E-mail: gyhwh@126.com

基金項目:中國高校醫(yī)學期刊臨床專項資金(11521476); 廣東省科技計劃項目(2011B031800327)

收稿日期:2014-06-20

中圖分類號:R 593.22

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)07-065-03DOI: 10.7619/jcmp.201507018