乙型肝炎患者抗病毒治療過程中肝組織HBV cccDNA與血清學(xué)標(biāo)志物變化的動態(tài)變化研究

王春穎, 劉成永, 周冬青, 王　驥, 楊青松

(江蘇省徐州市傳染病醫(yī)院, 1. 傳染科; 2. 檢驗科, 徐州, 江蘇, 221004)

乙型肝炎患者抗病毒治療過程中肝組織HBV cccDNA與血清學(xué)標(biāo)志物變化的動態(tài)變化研究

王春穎1, 劉成永2, 周冬青2, 王驥1, 楊青松1

(江蘇省徐州市傳染病醫(yī)院, 1. 傳染科; 2. 檢驗科, 徐州, 江蘇, 221004)

摘要:目的探討慢性乙型病毒性肝炎患者抗病毒治療過程中肝組織乙型肝炎病毒(HBV)共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)與相關(guān)血清學(xué)標(biāo)志物變化。方法88例乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽性的慢性乙型病毒性肝炎患者給予恩替卡韋抗病毒治療96周。分別于0、24周、48周、96周檢測肝組織中和血清HBV cccDNA、血清HBV DNA、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBeAg定量，并分析肝組織HBV cccDNA與血清學(xué)標(biāo)志物變化的關(guān)系。結(jié)果與基線比較，治療后24周時患者肝組織HBV cccDNA, 血清HBV cccDNA, 血清HBV DNA和HBsAg均顯著降低(P<0.05或P<0.01); 治療后24周和48周比較：肝組織HBV cccDNA, 血清HBV cccDNA, 血清HBV DNA差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); 48周與96周檢測指標(biāo)相比：肝組織HBV cccDNA定量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 血清HBV DNA定量和血清HBV cccDNA定量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。血清HBsAg和HBeAg差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論血清HBV DNA定量和血清HBV cccDNA定量同步下降幅度大于肝組織cccDNA定量和HBsAg、HBeAg定量，肝組織HBV cccDNA定量、HBsAg、HBeAg定量在48周后逐步趨于穩(wěn)定。血清HBsAg、HBeAg定量與肝組織HBV cccDNA 具有較高的一致性，血清HBsAg、HBeAg定量檢測能更準(zhǔn)確、方便、快捷指導(dǎo)臨床診斷。

關(guān)鍵詞:肝炎; 乙型肝炎病毒;HBV cccDNA; HBV DNA; 乙型肝炎表面抗原; 乙型肝炎e抗原

肝細(xì)胞內(nèi)持續(xù)乙型肝炎病毒(HBV)感染是以HBV核內(nèi)共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)的存在為特征, HBV cccDNA 作為乙肝病毒基因組的復(fù)制中間體, mRNA和前基因組RNA的模板，是乙肝病毒持續(xù)感染的關(guān)鍵因素[1-2]。肝組織中HBV cccDNA的檢測是最直接反映體內(nèi)HBV感染與復(fù)制情況的證據(jù)，是評估乙肝患者病情療效的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3-4]。但肝組織HBV cccDNA檢測因取材困難、操作繁瑣，且具有創(chuàng)傷性，不能被患者所接受，不適宜普遍開展[5]。本研究旨在通過動態(tài)檢測乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽性的慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者抗病毒治療前后肝組織中HBV cccDNA、血清HBV cccDNA、HBV DNA及HBsAg、HBeAg定量，分析肝組織HBV cccDNA與血清學(xué)標(biāo)志物變化的相關(guān)性，以期通過無創(chuàng)手段，利用血清學(xué)指標(biāo)更準(zhǔn)確、方便、快捷指導(dǎo)臨床診斷，為評價抗病毒療效提供可靠依據(jù)。

1資料與方法

1.1　一般資料

選取2010年1月—2011年6月在徐州市傳染病醫(yī)院就診HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者88例為研究對象，其中男51例，女37例，年齡24～60歲，平均(38.9±10.1)歲，均符合中華醫(yī)學(xué)會《慢性乙型肝炎防治指南(2010版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。患者均經(jīng)血清免疫學(xué)檢查確診，無合并甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎。且均簽署知情同意，愿意在2年內(nèi)接受4次肝穿刺活檢并堅持檢查治療。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 酒精性肝病、非酒精性脂肪肝，自身免疫性肝病以及肝硬化失代償期患者; ② 入組前6個月接受抗病毒治療或免疫調(diào)節(jié)治療，有肝穿刺禁忌證或恩替卡韋用藥禁忌證。

1.2　方法

1.2.1樣本采集：所有患者采用恩替卡韋(江蘇正大天晴制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20120038)治療。治療前患者抽空腹靜脈血5 mL, 低溫冰箱保存，用于檢測肝功能、HBV標(biāo)志物、HBV DNA定量等。肝組織活檢采用1秒鐘快速穿刺法，送檢肝組織長度均在15 mm以上。部分10%甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片后行HE染色、網(wǎng)狀纖維染色及HBcAg免疫組織化學(xué)染色。其余肝組織立即放入-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。治療?4、48、96周行上述檢查。

1.2.2HBV cccDNA水平檢測: HBV cccDNA核酸定量檢測試劑盒購于廣州藍(lán)星生物科技開發(fā)有限公司, 采用德國羅氏公司LightCycler 定量PCR儀檢測，操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行,檢測范圍是2.50×103～2.5×109拷貝/mL; 取檢測結(jié)果對數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.3HBV血清標(biāo)志物和病毒載量檢測：HBV血清標(biāo)志物檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，試劑購自北京萬泰公司；生化檢測采用OLYMPAS AU-400全自動生化分析儀; HBsAg定量采用羅氏Elecsys HBsAg Ⅱ定量檢測方法，HBeAg檢測采用羅氏通過PEIU標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后實(shí)現(xiàn)定量檢測血清HBeAg水平。HBV DNA定量試劑盒購于深圳匹基生物工程有限公司，操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.3　觀察指標(biāo)

觀察患者基線時、治療后24、48和96周時肝組織HBV cccDNA、血清HBV cccDNA、HBV DNA、HBsAg、HBeAg和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的變化。

2結(jié)果

與基線比較，治療后24周時患者肝組織HBV cccDNA, 血清HBV cccDNA, 血清HBV DNA和HBsAg均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。治療后24周和48周比較：肝組織HBV cccDNA, 血清HBV cccDNA, 血清HBV DNA差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。治療后48周與96周比較：血清HBV DNA定量和血清HBV cccDNA定量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。肝組織HBV cccDNA定量、HBsAg定量和HBeAg差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　患者肝組織HBV cccDNA和血清相關(guān)標(biāo)志物水平

與前一觀察點(diǎn)比較, *P<0.05, **P<0.01

3討論

肝臟組織中HBV cccDNA存在與慢性陰性肝炎發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，治療后24周和48周，除血清HBeAg定量，肝組織HBV cccDNA、血清HBV DNA和HBsAg定量均較前一觀測點(diǎn)下降(P<0.05或P<0.01); 治療后48周和96周時比較，血清HBV DNA定量和血清HBV cccDNA有顯著差異，而肝組織HBV cccDNA定量、血清HBsAg定量和HBeAg定量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示血清HBV DNA和血清cccDNA同步下降幅度可能大于肝組織HBV cccDNA和血清HBsAg、HBeAg下降幅度。

肝細(xì)胞HBV cccDNA與血清HBV cccDNA、血清HBV DNA定量消長不完全同步。Singh等[7]研究發(fā)現(xiàn)，10例乙肝患者肝組織中HBV cccDNA呈陽性，但只有6例在血清中檢測到HBV cccDNA。陳嵬等[8]研究慢性HBV感染者肝組織中HBV cccDNA含量與血清病毒標(biāo)志物、HBV DNA的關(guān)系分析表明：肝組織cccDNA定量與血清中的HBV DNA含量無顯著相關(guān)性。本研究中，治療后48周，肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA尚維持一定水平，但血清中HBV cccDNA及HBV DNA下降顯著，考慮可能有以下幾種原因: ① 嗜肝病毒的特殊復(fù)制形式保護(hù)HBV cccDNA不被終止鏈的多聚酶抑制物直接清除，并且病毒處于低復(fù)制狀態(tài)時成熟的病毒體優(yōu)先用于補(bǔ)充HBV cccDNA池，上述因素共同作用使抗病毒藥物對HBV cccDNA無直接抑制作用，抗病毒藥物只通過長期的病毒抑制和激發(fā)的免疫反應(yīng)逐漸消耗細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA, HBV cccDNA很難被徹底清除，故HBV cccDNA能持續(xù)存在于肝細(xì)胞內(nèi)[9-10]; ② 血清HBV cccDNA、HBV DNA有可能是伴隨著患者病情活動、肝細(xì)胞破壞而出現(xiàn)的?；颊邫C(jī)體內(nèi)存在免疫反應(yīng)，肝細(xì)胞易受到宿主免疫攻擊，溶解破壞，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)容物釋放。因此，存在肝細(xì)胞核的HBV cccDNA釋放入血，從而能夠被檢測；給予患者持續(xù)抗病毒治療，病情逐漸穩(wěn)定，肝細(xì)胞修復(fù)，肝細(xì)胞內(nèi)容物釋放減少，故血清中HBV cccDNA、HBV DNA隨之減少。

肝組織cccDNA水平與HBsAg、HBeAg水平呈同步下降，且有一定的相關(guān)性。有研究提示，血清HBsAg水平與肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA數(shù)量相關(guān)[11]。Wursthorn等[12]發(fā)現(xiàn)26例HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者抗病毒治療過程中肝內(nèi)cccDNA水平與血清HBsAg呈同步下降。Maynard等[1]也報告拉米夫定聯(lián)合阿德福韋抗病毒治療后患者血清HBsAg的陰轉(zhuǎn)伴隨著肝組織HBV cccDNA的顯著下降[13]。另一項聚乙二醇干擾素α-2b治療30例HBeAg陽性患者48周臨床試驗中顯示, 10例發(fā)生HBeAg血清轉(zhuǎn)換率患者，在治療期間其血清HBsAg、HBeAg及HBV DNA滴度持續(xù)下降；基線與治療后降低的血清HBsAg、HBeAg滴度與肝內(nèi)總HBV DNA、cccDNA的相關(guān)性良好[14]。考慮肝組織HBV cccDNA與HBsAg、HBeAg下降較慢的原因可能是核苷(酸)類藥物是HBV的反轉(zhuǎn)錄抑制劑而非直接作用于cccDNA, HBsAg的轉(zhuǎn)錄和合成并沒有受影響; HBeAg合成與病毒復(fù)制途徑雖然是分離的， 即抑制病毒復(fù)制不直接影響HBeAg合成，但可減少前基因組RNA 的轉(zhuǎn)錄，因此可能間接影響HBeAg合成[15]。故肝組織cccDNA與HBsAg、HBeAg下降水平基本一致。

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Dynamic observation on hepatitis B virus cccDNA in liver tissue and serological markers changes in the process of antiviral therapy

WANG Chunying1, LIU Chengyong2, ZHOU Dongqing2, WANG Ji1, YANG Qingsong1

(1.DepartmentofInfectiousDisease; 2.DepartmentofLaboratory,XuzhouInfectious

DiseaseHospital,Xuzhou,Jiangsu, 221004)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore hepatitis B virus (HPV) covalently closed circular DNA (cccDNA) of liver tissue and levels of relative serological markers, including serum HBV cccDNA and serum HBV DNA and epatitis B surface antigen (HBsAg) quantitative and hepatitis B Antigen(HBeAg) quantitative in chronic hepatitis B (CHB) patients after antiviral treatment. MethodsEighty-eight HBeAg positive CHB viral hepatitis patients received entecavir antiviral treatment for 96 weeks. Their HBV cccDNA in liver tissue and serum HBV cccDNA, serum HBV DNA and HBsAg and HBeAg quantitative were detected respectively in 0, 24, 48 and 96 weeks. The relationship between liver tissue HBV cccDNA and serological markers was evaluated dynamically. ResultsCompared with the baseline, levels of HBV cccDNA in liver tissue，serum HBV cccDNA, HBV DNA and HbsAg decreased significantly at 24 weeks after treatment (P<0.05 or P<0.01). Levels of HBV cccDNA in liver tissue，serum HBV cccDNA and HBV DNA kept declined at 48 weeks (P<0.01).There was no significant difference in HBV cccDNA of liver tissue between 48 weeks and 96 weeks (P>0.05). Compared with those at 48 weeks, the serum HBV DNA and serum HBV cccDNA quantitative reduced significantly at 96 weeks (P<0.01). There were no significant differences in serum HBsAg and HBeAg quantitative between 48 weeks and 96 weeks (P>0.05).ConclusionThe findings indicate a higher synchronous declined in serum HBV DNA and serum HBV cccDNA quantitative than HBV cccDNA of liver tissue, serum HBsAg and HBeAg quantitative. Changes in HBV cccDNA of liver tissue, serum HBsAg and HBeAg quantitative are stabilized since 48 weeks after treatment, which may reveal a consistency between them. Quantitative detection of serum HBsAg and HBeAg may be more accurate, convenient and fast for guiding the clinical diagnosis.

KEYWORDS:hepatitis; hepatitis b virus; HBV cccDNA; HBV DNA; HBsAg; HBeAg

通信作者:劉成永, E-mail: crblt@126.com

基金項目:中國高校醫(yī)學(xué)期刊臨床專項資金(11520201)

收稿日期:2014-12-21

中圖分類號:R 512.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)07-044-03DOI: 10.7619/jcmp.201507012