小鼠Stra8基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

鄭　哲, 鄭　英

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 1. 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室; 2. 臨床醫(yī)學(xué)系, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

小鼠Stra8基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

鄭哲1,2, 鄭英1

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 1. 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室; 2. 臨床醫(yī)學(xué)系, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

摘要:目的探討GV341質(zhì)粒構(gòu)建小鼠Stra8基因的慢病毒表達(dá)載體的方法。方法應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物插入慢病毒質(zhì)粒GV341, 通過(guò)PCR篩選及測(cè)序?qū)﹃?yáng)性克隆進(jìn)行鑒定。將慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞后，提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白，用Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中Stra8蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 成功構(gòu)建了GV341-Stra8慢病毒表達(dá)載體。結(jié)論Stra8慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建為體外研究Stra8基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:小鼠Stra8基因; 慢病毒載體; 293T細(xì)胞

Stra8是一種受視黃酸(RA)調(diào)控的基因，是哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞由有絲分裂轉(zhuǎn)變?yōu)闇p數(shù)分裂前特異表達(dá)的基因[1]。研究[2]表明，Stra8是胚胎和出生后性腺中特異性表達(dá)的基因，同時(shí)其在生殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)，且當(dāng)細(xì)胞處于不同功能狀態(tài)時(shí)，Stra8可在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間進(jìn)行穿梭，從而發(fā)揮不同的功能。Stra8基因敲除小鼠雄性不育，出現(xiàn)與減數(shù)分裂細(xì)胞周期、染色質(zhì)濃縮、基因同源重組、DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡相關(guān)的異常表型[3]。據(jù)報(bào)道[4]，Stra8的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性的遺傳變異可能與中國(guó)男性原發(fā)性無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥有相關(guān)性。Stra8在人類及小鼠的精子發(fā)生的過(guò)程中都是必不可少的，但Stra8在精子發(fā)生中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未闡明。本研究構(gòu)建了Stra8慢病毒表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中能夠特異性高表達(dá)Stra8蛋白。該載體構(gòu)建后，作者將應(yīng)用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)包裝慢病毒，感染小鼠精原細(xì)胞株，構(gòu)建具有穩(wěn)定表達(dá)Stra8蛋白的生精細(xì)胞系，為體外研究Stra8的分子調(diào)控機(jī)制提供模型。

1材料與方法

1.1　材料與試劑

GV341載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，293T細(xì)胞由揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室程宏博士惠贈(zèng), DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、dNTP、Age I、BamH I及T4連接酶購(gòu)自Takara公司, Taq polymerase 購(gòu)自上海生工生物有限公司，引物由華大基因生物公司合成，質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Axygen公司，脂質(zhì)體lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司, DMEM、胰酶及胎牛血清購(gòu)自Gibco公司, Flag鼠抗購(gòu)自Sigma公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司, GAPDH兔多克隆抗體購(gòu)自Santa cruz公司, Plus-20離心超濾裝置購(gòu)自Millipore公司, ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自北京普利來(lái)基因技術(shù)有限公司。

江蘇省創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201311117094X); 揚(yáng)州大學(xué)大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Stra8片段的擴(kuò)增：以pCR-Blunt-Stra8質(zhì)粒為模板進(jìn)行Stra8編碼閱讀框區(qū)域的擴(kuò)增，上游擴(kuò)增引物為: 5′-CCAACTTTGTGCCAACCGGTCGCCACCATGGCCACCCCTGGAGAAGG-3′; 下游擴(kuò)增引物為: 5′-AATGCCAACTCTGAGCTTCAGATCGTCAAAGGTCTCCAG-3′; PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃ 5 min, 94 ℃ 45 s、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán), 72 ℃ 10 min。反應(yīng)體系為: 10×Taq Buffer 5 L, 10 mmol/L dNTP 1 L, 10 mol/L上游引物2 L, 10 mol/L下游引物2 L, 10 ng/μL模板2 L, Taq酶1 L, H2O 37 L, 預(yù)計(jì)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1182 bp。瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.2GV341-Stra8重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將上述PCR產(chǎn)物及GV341空載質(zhì)粒分別用Age I和BamH I進(jìn)行雙酶切，然后用T4連接酶進(jìn)行連接，將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，利用PCR法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，篩選出陽(yáng)性克隆。PCR上游引物為: 5′-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3′; 下游引物為: 5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′; 預(yù)計(jì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物片段為1281 bp, 陰性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物片段為212 bp。PCR反應(yīng)條件同上。將經(jīng)PCR鑒定后的陽(yáng)性克隆送上海華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3慢病毒重組質(zhì)粒表達(dá)的鑒定:將慢病毒重組質(zhì)粒GV341-Stra8轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞中，觀察其能否在細(xì)胞中表達(dá)Stra8蛋白。轉(zhuǎn)染前1 d將293T細(xì)胞接種于6孔板中，次日細(xì)胞融合度約80%左右。按照Lipofectamine TM2000說(shuō)明書的要求，將GV341-Stra8表達(dá)載體DNA 10 g轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞。

1.2.4細(xì)胞總蛋白質(zhì)的提取:收集轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞，用200 L蛋白裂解液冰上裂解細(xì)胞30～60 min, 4 ℃高速離心20 min, 取上清保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5Western Blot分析:在細(xì)胞總蛋白(約50 μg)中加入等體積2×loading buffer, 將樣品在水中煮5～10 min, 冰上冷卻5～10 min, 13 000 r/min離心15 min后取上清；將樣品加入到聚丙烯酰胺凝膠(125 g/L)上樣孔，先10 mA恒流電泳30 min, 后用20 mA恒流電泳，直至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠下緣；將凝膠中的蛋白用電轉(zhuǎn)膜儀(0.8 mA/cm2)轉(zhuǎn)移到PVDF膜；將PVDF膜放入含50 g/L脫脂奶粉的TBS中封閉2 h; 加入Flag鼠抗(以1∶3 000稀釋于TBS中), 4 ℃過(guò)夜；次日用TBS洗3次, 10 min/次；加入HRP-conjugated goat anti-mouse 二抗(1∶4 000稀釋), 37 ℃, 1 h; TBS洗3次, 10 min/次；用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(ECL kit, Amersham Bioscience)顯色，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)雜交信號(hào)。

2結(jié)果

2.1　慢病毒重組質(zhì)粒GV341-Stra8的構(gòu)建

應(yīng)用前述引物，以質(zhì)粒pCR-Blunt-Stra8為模板進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察, PCR產(chǎn)物大小在1 200 bp左右，與預(yù)計(jì)片段長(zhǎng)度相一致(圖1)。將PCR產(chǎn)物與線性慢病毒載體GV341連接后，應(yīng)用PCR擴(kuò)增，獲得含插入片段的陽(yáng)性克隆(圖2)，經(jīng)序列測(cè)定后，證實(shí)插入片段的序列正確無(wú)誤。

M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);

1. Stra8 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

圖1Stra8 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2　Western blot分析結(jié)果

以未轉(zhuǎn)染慢病毒重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞為對(duì)照，轉(zhuǎn)染了慢病毒重組質(zhì)粒GV341-Stra8的293T細(xì)胞中可檢測(cè)到約55 kD大小的片段，其大小與Stra8蛋白相比偏大，但與試劑公司檢測(cè)的大小相一致(圖3)，而沒(méi)有轉(zhuǎn)染慢病毒表達(dá)載體的293T細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到相應(yīng)大小的條帶。上述結(jié)果提示，用慢病毒重組質(zhì)粒GV341-Stra8轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后能夠表達(dá)Stra8蛋白，提示慢病毒重組質(zhì)粒GV341-Stra8構(gòu)建成功并具有表達(dá)能力。

M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1. 陰性對(duì)照(空載自連對(duì)照);

1. 陽(yáng)性對(duì)照SURVIVIN-3FLAG-GFP蛋白;

2. 未轉(zhuǎn)染慢病毒表達(dá)載體的293T細(xì)胞;

3. GV341-Stra8慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

圖3Western blot檢測(cè)慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染

293T細(xì)胞后Stra8蛋白的表達(dá)

3討論

精子發(fā)生過(guò)程是一個(gè)特殊的細(xì)胞分化過(guò)程，在這一過(guò)程中表現(xiàn)出許多體細(xì)胞分化過(guò)程中所沒(méi)有的現(xiàn)象，如減數(shù)分裂及精子變態(tài)成形。生殖細(xì)胞獨(dú)特的形態(tài)與功能導(dǎo)致其表達(dá)的基因必然在一定程度上不同于機(jī)體的體細(xì)胞，具有在不同時(shí)空、組織結(jié)構(gòu)和發(fā)育模式中的表達(dá)方式[5]，一旦這些基因的表達(dá)方式發(fā)生變化，必然會(huì)引起精子發(fā)生和受精過(guò)程的病理改變，導(dǎo)致不育癥的產(chǎn)生[6]。

維生素A在哺乳動(dòng)物多種生理過(guò)程中起著必不可少的作用。維生素A一般儲(chǔ)存于肝臟，以視黃醇的形式在血液中運(yùn)輸，而在靶器官或靶組織中發(fā)揮作用的是其活性形式RA。RA在生殖細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程發(fā)揮著非常重要的作用[7-9]。RA對(duì)精子發(fā)生過(guò)程也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[9-13]。成年雄性小鼠缺乏維生素A時(shí)，生精小管中所有分化后的生精細(xì)胞完全消失，僅殘留A型精原細(xì)胞和支持細(xì)胞。而這種分化后消失的生精細(xì)胞在注射RA或給予補(bǔ)充含維生素A飼料后可以重新恢復(fù)[14]。因而，RA對(duì)于正常的精子發(fā)生過(guò)程必不可少的[10,14-15]。研究[8,16-17]發(fā)現(xiàn)，在胚胎期睪丸中RA氧化酶Cyp26b1的表達(dá)使RA失去活性，從而抑制了RA的作用，使精子發(fā)生處于未啟動(dòng)狀態(tài)；從青春期開始，Cyp26b1表達(dá)減少，RA開始發(fā)揮作用，精子發(fā)生啟動(dòng)直至性成熟。

為了研究生殖細(xì)胞中受RA調(diào)控的基因，1995年法國(guó)Bouillet P等[17]研究小組用RA處理小鼠全能的P19胚胎癌細(xì)胞，篩選出50個(gè)RA反應(yīng)基因，Stra8是新發(fā)現(xiàn)的基因之一[18-20]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該基因定位在小鼠第6號(hào)染色體上，全長(zhǎng)1 455 bp，含有9個(gè)外顯子，編碼一個(gè)含393個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，在人類也有小鼠Stra8的同源基因，二者的同源性為80%[19]。此外，在其他種屬動(dòng)物如大鼠、牛、狗、恒河猴、大猩猩、灰色短尾負(fù)鼠、家雞、紅原雞等中均有Stra8的同源基因，提示Stra8基因是一種進(jìn)化上高度保守的基因[19]。在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期睪丸組織中Stra8均未見表達(dá)，而在成年小鼠的多組織中，Stra8僅在睪丸中表達(dá)，而在腦、心、肺、肝、腎、脾臟及卵巢等其他組織中均未見表達(dá)[12]。應(yīng)用免疫組織化學(xué)等多種技術(shù)，Zhou Q等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)，Stra8在成年小鼠睪丸生精小管VI-VIII期中Stra8 mRNA水平最高。對(duì)Stra8蛋白的亞細(xì)胞定位研究表明：Stra8蛋白可同時(shí)表達(dá)于生殖細(xì)胞的胞漿和胞核內(nèi)，并根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)不同在這兩種部位進(jìn)行穿梭，從而發(fā)揮不同的功能[1-2,19]。

為探討Stra8的作用，Mark M[3]小組構(gòu)建了Stra8基因敲除小鼠，表型分析發(fā)現(xiàn)，除生殖功能外其他器官未見異常表型。雄性小鼠精子發(fā)生功能嚴(yán)重缺陷，睪丸體積變小，重量減少，不能生育。20%生精小管中僅見精原細(xì)胞和支持細(xì)胞，在大多數(shù)生精小管中可見細(xì)線前期及細(xì)線期的初級(jí)精母細(xì)胞，只有少量初級(jí)精母細(xì)胞呈現(xiàn)出偶線期及粗線期的細(xì)胞核，而粗線中期和偶線期的初級(jí)精母細(xì)胞及減數(shù)分裂后的精子細(xì)胞等均缺乏。上述表型顯示，在Stra8缺乏的情況下，B型精原細(xì)胞可以進(jìn)行一輪DNA復(fù)制，分化為細(xì)線前期的精母細(xì)胞，進(jìn)入減數(shù)分裂，進(jìn)一步表型分析發(fā)現(xiàn)，進(jìn)入減數(shù)分裂的精母細(xì)胞中聯(lián)會(huì)復(fù)合體缺乏或畸形，產(chǎn)生了異型聯(lián)會(huì)[12]。提示Stra8可能在染色體配對(duì)過(guò)程中發(fā)揮作用。Anderson EL等[22]也構(gòu)建了不同遺傳背景的Stra8缺陷小鼠，表型分析進(jìn)一步證實(shí)青春期小鼠中Stra8對(duì)于細(xì)線前期精母細(xì)胞的DNA復(fù)制過(guò)程中并非必須，但對(duì)細(xì)線前期精母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂的染色體濃縮、聯(lián)會(huì)及DNA同源重組過(guò)程是必不可少的。

對(duì)Stra8表達(dá)調(diào)控的研究主要集中在其上游調(diào)控分子上，如RA的調(diào)控通路[7-13]。研究[23-24]表明，生精細(xì)胞在RA作用下可促進(jìn)Stra8基因的表達(dá)，因而RA的合成、來(lái)源及降解是調(diào)節(jié)該基因表達(dá)的關(guān)鍵。RA激活Stra8基因的表達(dá)，可能是通過(guò)RA與核受體RXR-RARγ結(jié)合形成二聚體，識(shí)別并結(jié)合在Stra8基因上游的RA反應(yīng)元件序列而致。CYP26B1可將RA氧化為無(wú)活性的形式，降低Stra8的表達(dá)，進(jìn)而阻礙精子發(fā)生過(guò)程[25-27]。其他研究小組的研究[23-28]發(fā)現(xiàn)，SHP和Nanos2蛋白可促進(jìn)CYP26B1表達(dá)，使局部RA濃度降低，進(jìn)而抑制Stra8基因表達(dá)來(lái)影響精子發(fā)生，同時(shí)SHP還可以直接抑制RARs的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致Stra8的表達(dá)減少。DMRT1則在生精細(xì)胞中通過(guò)限制RA依賴的轉(zhuǎn)錄，結(jié)合到Stra8兩個(gè)啟動(dòng)子附近的RA反應(yīng)元件上抑制Stra8的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控精子發(fā)生過(guò)程[29]。

目前對(duì)Stra8調(diào)控的下游分子相關(guān)研究鮮有報(bào)道。由于Stra8表達(dá)于特定階段的生精細(xì)胞[10]，且在目前僅有的兩種小鼠永生化的生精細(xì)胞株中Stra8蛋白并不表達(dá)，這也在一定程度上限制了Stra8功能的體外研究及其下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的探索。因此，構(gòu)建具有穩(wěn)定表達(dá)Stra8蛋白的生精細(xì)胞系，并應(yīng)用該細(xì)胞模型進(jìn)行Stra8功能的研究迫在眉睫。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷I型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。同時(shí)慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)能持續(xù)數(shù)月，且無(wú)可觀察到的病理學(xué)現(xiàn)象。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，永生化小鼠精原細(xì)胞株在進(jìn)行真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)轉(zhuǎn)染效率較低，穩(wěn)定表達(dá)蛋白的性狀維持時(shí)間較短且易丟失。因此，慢病毒表達(dá)系統(tǒng)為構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Stra8蛋白的精原細(xì)胞系提供了可能。

本研究首先通過(guò)PCR擴(kuò)增法，成功獲得了Stra8基因全長(zhǎng)開放閱讀框，并將其重組到慢病毒載體GV341上，獲得了慢病毒重組質(zhì)粒GV341-Stra8，經(jīng)PCR篩選及序列測(cè)定證實(shí)插入片段序列準(zhǔn)確無(wú)誤。將慢病毒重組載體GV341-Stra8轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞中，用Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞中能夠表達(dá)大量的Stra8蛋白。在GV341載體中Stra8插入片段的氨基端含有Flag標(biāo)簽，因此，作者用Flag的抗體來(lái)識(shí)別Stra8蛋白。慢病毒載體構(gòu)建完成后，作者將在此基礎(chǔ)上進(jìn)行慢病毒的包裝和制備，進(jìn)而用慢病毒感染生精細(xì)胞，從而構(gòu)建一種穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Stra8蛋白的生精細(xì)胞系，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行Stra8基因的功能研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體GV341-Stra8，該表達(dá)載體能夠通過(guò)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)的Stra8蛋白。該研究為進(jìn)一步探索Stra8基因的功能及其作用的分子機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Construction and identification of mouse Stra8 gene recombinant lentivirus vector

ZHENG Zhe1,2, ZHENG Ying1

(1.DepartmentofHistologyandEmbryology; 2.DepartmentofClinicalMedicine,Medical

CollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the method for construction and identification of Stra8 gene lentiviral expression vector. MethodsStra8 was synthesized with particular primer, amplified by PCR and cloned into the lentiviral vector expression plasmid GV341. After digestion and sequencing, GV341-Stra8 was transfected into 293T cells．Expression of Stra8 protein was detected by Western blot. ResultsThe lentiviral expression vector GV341-Stra8 was constructed. 293T cells transfected with GV341-Stra8 vector were able to express Stra8 protein. ConclusionConstruction of GV341-Stra8 lentiviral expression vector can provide an experiment foundation for further studies of Stra8 function.

KEYWORDS:mouse Stra8; lentivirus vector; 293T cells

通信作者:鄭英, E-mail: yzzkl@163.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 31371174); 江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20131230);

收稿日期:2014-12-24

中圖分類號(hào):R 596.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)07-011-05DOI: 10.7619/jcmp.201507003