miR-1976在細(xì)菌性陰道病中的作用及其機(jī)制

馬致南, 徐　揚(yáng), 鄔姝陽(yáng), 曾　新, 李　萍

(1. 江蘇省揚(yáng)州市婦幼保健院 婦產(chǎn)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225000;

江蘇省2. 南京市玄武區(qū)婦幼保健所 婦科 江蘇 南京, 210029;

3. 江蘇省南京市婦幼保健院 婦幼醫(yī)學(xué)研究中心, 江蘇 南京, 210004;

4. 江蘇省南京市婦幼保健院 婦科 內(nèi)分泌科, 江蘇 南京, 210004)

miR-1976在細(xì)菌性陰道病中的作用及其機(jī)制

馬致南1, 徐揚(yáng)1, 鄔姝陽(yáng)2, 曾新3, 李萍4

(1. 江蘇省揚(yáng)州市婦幼保健院 婦產(chǎn)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225000;

江蘇省2. 南京市玄武區(qū)婦幼保健所 婦科 江蘇 南京, 210029;

3. 江蘇省南京市婦幼保健院 婦幼醫(yī)學(xué)研究中心, 江蘇 南京, 210004;

4. 江蘇省南京市婦幼保健院 婦科 內(nèi)分泌科, 江蘇 南京, 210004)

摘要:目的闡述miR-1976及CD105, 整合素αvβ6的關(guān)系,探討三者在陰道感染中的作用及機(jī)制。方法采用Real-Time PCR方法檢測(cè)健康及細(xì)菌性陰道病患者陰道黏膜組織中miR-1976與CD105、整合素αvβ6的表達(dá)；評(píng)估陰道上皮細(xì)胞系VK2/E6E7過(guò)表達(dá)miR-1976后其CD105, 整合素αvβ6的表達(dá)情況；闡述過(guò)表達(dá)miR-1976對(duì)VK2/E6E7細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果細(xì)菌性陰道病患者陰道黏膜組織中miR-1976顯著低表達(dá)，而CD105, 整合素αvβ6的mRNA顯著高表達(dá)(P<0.05); VK2/E6E7細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-1976后，其增殖和凋亡未受明顯影響，而CD105和整合素 αvβ6的mRNA則顯著低表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論miR-1976通過(guò)CD105調(diào)節(jié)整合素αvβ6的表達(dá)，從而影響陰道上皮細(xì)胞的黏附能力，參與細(xì)菌性陰道病的發(fā)生。

關(guān)鍵詞:細(xì)菌性陰道病; miR-1976; CD105; 整合素αvβ6

病原微生物定植于陰道黏膜表面是陰道炎發(fā)生的第一步。當(dāng)發(fā)生病原微生物入侵時(shí)，陰道黏膜上皮細(xì)胞迅速脫落(剝離)，以保護(hù)機(jī)體免受感染；但大多數(shù)病原微生物可通過(guò)改變陰道黏膜上皮細(xì)胞的黏著能力，阻斷細(xì)胞的遷移與脫落，從而定植于陰道黏膜，破壞其防御，導(dǎo)致陰道炎。治療陰道炎，從陰道黏膜本身的防御功能及機(jī)制出發(fā)，尋找新的治療靶標(biāo)，有可能改變目前陰道炎治療效果不佳的現(xiàn)狀[1-3]。

整合素是細(xì)胞表面黏附分子家族成員之一，介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的黏附反應(yīng)及信號(hào)傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生物學(xué)行為，對(duì)細(xì)胞黏附、生存、生長(zhǎng)、增殖、凋亡起主要調(diào)節(jié)作用[4]。其中，整合素的亞型αvβ6在腸道黏膜的感染與防御中具有重要的調(diào)控作用[5-6], 考慮到不同部位的黏膜具有相似特性，因此整合素家族成員αvβ6也可能是參與了陰道黏膜感染與防御的關(guān)鍵分子。

本研究檢測(cè)了細(xì)菌性陰道病女性陰道黏膜組織中miR-1976與CD105、整合素αvβ6的表達(dá)情況，并檢測(cè)了miR-1976在陰道上皮細(xì)胞VK2/E6E7中過(guò)表達(dá)后對(duì)其增殖和凋亡的影響以及對(duì)CD105與整合素αvβ6表達(dá)的影響，以期闡述miR-1976與CD105、整合素 αvβ6在陰道感染中的關(guān)系、作用及機(jī)制。

1資料與方法

1.1　標(biāo)本收集和處理

收集2013年9月—2014年5月由于子宮良性腫瘤在本院行全子宮切除術(shù)的健康與細(xì)菌性陰道病女性的陰道黏膜組織各30 例，術(shù)中黏膜組織離體后以4 ℃無(wú)菌PBS緩沖液沖洗后迅速置入液氮，保存待用。

1.2　材料來(lái)源

人陰道上皮細(xì)胞系VK2/E6E7購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC); K-SFM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco); miR-1976慢病毒過(guò)表達(dá)載體(上海吉?jiǎng)P); Trizol(美國(guó)Invitrogen); Real-Time PCR試劑盒(美國(guó)Thermo); PR-7-AAD凋亡試劑盒(美國(guó)BD)；未提及試劑均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.3　方法

1.3.1Real-Time PCR:檢測(cè)健康女性與細(xì)菌性陰道病女性陰道黏膜中miR-1976, CD105、整合素 αvβ6的mRNA表達(dá)。按Trizol說(shuō)明書提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度法定量后，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)法檢測(cè)細(xì)胞中CD105、整合素β6亞基、內(nèi)參GAPDH基因mRNA表達(dá)水平。β6亞基上游引物序列: 5′-GAAGGAATGATCACGTACAAGGT-3′, 下游引物序列: 5′-AGCAGGCAGTCTTCACAGGT-3′; GAPDH基因上游引物序列: 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′, 下游引物序列: 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR采用Taqman探針?lè)?，反?yīng)體系20 μL: 熒光定量探針?lè)磻?yīng)預(yù)混液10 μL, 探針和引物預(yù)混液1 μL, 模板cDNA 1 μL, 水8 μL。cDNA模板擴(kuò)增反應(yīng)條件: 95 ℃ 10 min變性; 95 ℃ 15 s、57 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共40個(gè)循環(huán)。RT-PCR每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng): VK2/E6E7細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于K-SFM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞貼壁后達(dá)到90%融合時(shí)，以0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA消化液消化8 min, 倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞形態(tài)變圓漂浮后，加入含10% FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基，吸取細(xì)胞懸液至10 mL離心管, 1 000 r/min離心10 min, 棄上清, 1∶3轉(zhuǎn)移細(xì)胞至25 cm培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.3.3慢病毒轉(zhuǎn)染: 克隆人miR-1976所在區(qū)域500 bp左右的基因組序列(minigene), 構(gòu)建慢病毒過(guò)表達(dá)載體(GFP作為 marker); 以只含GFP的慢病毒載體為對(duì)照，包被成慢病毒顆粒，感染VK2/E6E7細(xì)胞; 72 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光蛋白表達(dá)，判斷病毒感染效率。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后確定感染復(fù)數(shù)(MOI)=10, 將3×105個(gè)細(xì)胞接種至25 cm小瓶中(融合度約30%), 貼壁后加入miR-1976過(guò)表達(dá)慢病毒約12 μL(濃度為1×109TU/mL), 同時(shí)加入polybrene 3 μL(20 mg/mL)以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率；在37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP熒光蛋白表達(dá)以判定轉(zhuǎn)染效果；采用Real-Time PCR技術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)成熟miR-1976是否過(guò)表達(dá)。同法轉(zhuǎn)染只含GFP的空白載體病毒。

1.4　MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染miR-1976過(guò)表達(dá)慢病毒載體72 h后，將VK2/E6E7細(xì)胞以4 000個(gè)/孔置入96孔板中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72 h，于每孔加入濃度為5 μg/mL的MTT溶液10 μL, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 棄上清，每孔加100 μL DMSO溶液終止反應(yīng)，搖床震蕩10 min, 在酶標(biāo)儀上測(cè)出每孔490 nm波長(zhǎng)的吸光度值，繪制細(xì)胞增殖曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5　PE-7AAD雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1976過(guò)表達(dá)慢病毒載體培養(yǎng)72 h后收獲細(xì)胞, PBS洗滌2次，重懸于100 μL 1×Binding Buffer, 混勻，加入5 μL PE和5 μL 7-AAD, 室溫避光反應(yīng)15 min; 300 g、4℃離心5 min, 棄上清，加400 μL 1×Binding Buffer, 混勻。1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。設(shè)置空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Real-Time PCR法檢測(cè)CD105與整合素αvβ6在過(guò)表達(dá)miR-1976的VK2/E6E7細(xì)胞與其對(duì)照組細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法同前。

2結(jié)果

2.1　miR-1976、CD105及整合素αvβ6在細(xì)菌性陰道病女性陰道黏膜組織中的表達(dá)

表達(dá)三PCR: glycumtance ogy, Nan Nanjing, Nanjing, Jiangsu, Real-Time PCR檢測(cè)健康與細(xì)菌性陰道病女性的陰道黏膜組織各30例，細(xì)菌性陰道病女性陰道黏膜組織中miR-1976表達(dá)下調(diào)6.3倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明細(xì)菌性陰道病女性陰道黏膜中miR-1976明顯下調(diào)(圖1A)。Real-Time PCR檢測(cè)健康與細(xì)菌性陰道病女性的陰道黏膜組織，可見CD105在細(xì)菌性陰道病女性陰道黏膜組織中表達(dá)增高3.1倍，整合素αvβ6在細(xì)菌性陰道病女性陰道黏膜組織中表達(dá)增高2.4倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明CD105、整合素αvβ6在細(xì)菌性陰道病女性的陰道黏膜組織中顯著高表達(dá)(圖1 B、1C)。

A. miR-1976在細(xì)菌性陰道病組低表達(dá)

B. CD105在細(xì)菌性陰道病組高表達(dá)

C. 整合素αvβ6在細(xì)菌性陰道病組高表達(dá)

圖1miR-1976與CD105、整合素αvβ6在

細(xì)菌性陰道病女性陰道黏膜組織中的表達(dá)

2.2　過(guò)表達(dá)miR-1976對(duì)VK2/E6E7細(xì)胞中miR-1976與CD105、整合素αvβ6表達(dá)的影響

熒光顯微鏡結(jié)果如圖2B示，綠色熒光為GFP表達(dá)，可見轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率>80%，慢病毒轉(zhuǎn)染成功。

2.3　Real-Time PCR及MTT結(jié)果

VK2/E6E7細(xì)胞中miR-1976表達(dá)增高(約5.5倍)(圖3 A); MTT結(jié)果示慢病毒轉(zhuǎn)染后，過(guò)表達(dá)miR-1976細(xì)胞與空載慢病毒細(xì)胞均于細(xì)胞培養(yǎng)約36 h達(dá)增殖平臺(tái)期，慢病毒載體對(duì)細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯影響(圖3B)。

2.4　細(xì)胞凋亡

慢病毒轉(zhuǎn)染VK2/E6E7細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率明顯增加，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡率為1%，而轉(zhuǎn)染空載慢病毒載體的細(xì)胞凋亡率為60.2%; 但轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-1976慢病毒載體的細(xì)胞凋亡率較空載慢病毒凋亡率低，僅為32.5%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明miR-1976過(guò)表達(dá)后慢病毒載體對(duì)VK2/E6E7細(xì)胞凋亡有明顯影響，而miR-1976過(guò)表達(dá)則對(duì)其凋亡無(wú)明顯影響(圖4)。

A. 攝于白光

B. 攝于綠光

A. miR-1976慢病毒感染VK2/E6E7

B. miR-1976慢病毒感染VK2/E6E7

細(xì)胞后對(duì)其增殖的影響情況

圖3miR-1976慢病毒感染VK2/E6E7細(xì)胞

2.5　miR-1976過(guò)表達(dá)的VK2/E6E7細(xì)胞中CD105及整合素αvβ6的表達(dá)

miR-1976過(guò)表達(dá)的VK2/E6E7細(xì)胞中CD105表達(dá)下調(diào)2.3倍，整合素αvβ6表達(dá)下調(diào)2.1倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明VK2/E6E7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-1976后CD105及整合素αvβ6表達(dá)明顯下調(diào)(圖5)。

A. 為對(duì)照組細(xì)胞的凋亡情況; B. 為空載慢病毒載體對(duì)細(xì)胞凋亡的影響; C. 為miR-1976過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

圖4過(guò)表達(dá)miR-1976對(duì)VK2/E6E7細(xì)胞凋亡的影響

3討論

越來(lái)越多的研究[7]顯示，具有調(diào)控功能的非編碼RNA-miRNAs是有潛力的生物標(biāo)志物，其大小20～25個(gè)核苷酸。成熟的miRNA在RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)引導(dǎo)下在轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶基因mRNA的表達(dá)實(shí)施調(diào)控。在哺乳動(dòng)物中，多數(shù)情況是與部分互補(bǔ)mRNA的3′-UTR區(qū)片段完全或不完全配對(duì)，降解靶mRNA或阻遏其轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)的翻譯，即負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)。microRNA

圖5 miR1976過(guò)表達(dá)對(duì)CD105與整合素αvβ6表達(dá)的影響

在人類多種疾病中發(fā)揮調(diào)控作用，可以作為潛在的診斷標(biāo)志、預(yù)后標(biāo)志及治療靶標(biāo)[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-1976在細(xì)菌性陰道病患者陰道黏膜組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)CD105及整合素αvβ6的表達(dá)明顯上升; miR-1976過(guò)表達(dá)慢病毒載體不影響VK2/E6E7細(xì)胞的增殖和凋亡，但其過(guò)表達(dá)后陰道上皮細(xì)胞VK2/E6E7中CD105及整合素αvβ6表達(dá)明顯下調(diào)。這一結(jié)果提示miR-1976可能通過(guò)調(diào)節(jié) CD105的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)整合素αvβ6的表達(dá)，從而影響陰道上皮細(xì)胞的黏著能力，進(jìn)而參與陰道黏膜的感染與防御功能。

CD105是一類比較新的細(xì)胞黏附分子，主要與細(xì)胞的增殖有關(guān)并參與腫瘤血管的生成；細(xì)胞表面的αvβ6通過(guò)胞外區(qū)與其配體結(jié)合后，通過(guò)胞內(nèi)區(qū)與細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白如肌動(dòng)蛋白、踝蛋白和紐蛋白等相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞黏附，并將細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)所承載的信號(hào)經(jīng)過(guò)復(fù)雜的通路傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，從而影響細(xì)胞基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、增殖、分化、凋亡[9]。本研究結(jié)果證實(shí)，細(xì)菌性陰道病女性陰道黏膜組織中整合素αvβ6的表達(dá)顯著高于正常女性陰道黏膜組織，提示整合素αvβ6在細(xì)菌性陰道病中發(fā)揮重要作用。miR-1976在VK2/E6E7細(xì)胞過(guò)表達(dá)后使CD105表達(dá)下調(diào)、同時(shí)使整合素αvβ6的表達(dá)下調(diào)，提示miR-1976可能在陰道上皮細(xì)胞中直接調(diào)控CD105、整合素αvβ6。

Muenzner等[10]在Science發(fā)表的研究論文證實(shí)，陰道中的淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)與黏膜上皮細(xì)胞表面的癌胚抗原相關(guān)的細(xì)胞黏附分子(CEACAMs)結(jié)合將引發(fā) CD105的從頭合成, CD105通過(guò)激活整合素的內(nèi)向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能使整合素的活性增加，增強(qiáng)受感染的黏膜上皮細(xì)胞的黏著能力，避免其遷移與脫落，有利于淋病奈瑟菌的定植及感染。這與本研究結(jié)果具有一致性。分析細(xì)菌性陰道病發(fā)病機(jī)制可能為miR-1976低表達(dá)，解除了對(duì)靶基因CD105的抑制作用, CD105從頭合成增加，增強(qiáng)整合素αvβ6的活性，使陰道壁上皮細(xì)胞的黏附能力增強(qiáng)，脫落減少，有利于致病菌定植于陰道壁上皮細(xì)胞并感染細(xì)胞，從而導(dǎo)致細(xì)菌性陰道病的發(fā)生。

本研究通過(guò)比較miR-1976過(guò)表達(dá)前后VK2/E6E7細(xì)胞中CD105和整合素αvβ6表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)miR-1976過(guò)表達(dá)可以下調(diào)CD105和整合素αvβ6的表達(dá)，這將有助于闡明 miR-1976 在陰道上皮細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其參與陰道黏膜感染與防御功能的分子機(jī)制，提示miR-1976可能成為一個(gè)新的極具前景的陰道炎治療的靶點(diǎn)。

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Function and mechanism of miR-1976 in bacterial vaginosis

MA Zhinan1, XU Yang1, WU Shuyang2,

ZENG Xin3, LI Ping4

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,YangzhouMaternalandChildHealthCare

Hospital,Yangzhou,Jiangsu, 225000; 2.DepartmentofGynecology,Maternaland

ChildHealthCareCenterofXuanwuDistrictinNanjing,Nanjing,Jiangsu, 210029;

3.TheResearchCenterofMaternalandChildMedicine,NanjingMaternal

andChildHealthCareHospital,Nanjing,Jiangsu, 210004; 4.Departmentof

Gynecology,NanjingMaternalandChildHealthCareHospital,Nanjing,Jiangsu, 210004)

ABSTRACT:ObjectiveTo clarify the relationship among miR-1976, CD105and integrin αvβ6 and to evaluate the function and mechanism of miR-1976, CD105and integrin αvβ6 in vaginal mucosa infection.MethodsThe expression levels of miR-1976, CD105and integrin αvβ6 in vaginal mucosa of healthy women and vaginitis ones were detected by real-time PCR, and the expression levels of CD105and integrin αvβ6 in VK2/E6E7 cell lines were investigated under the circumstance of miR-1976 over-expressed. Meanwhile, flow cytometry was used to evaluate the influence of lentivirus on cell proliferation and apoptosis.ResultsThe expression of miR-1976 was significantly lower in vaginitis mucosa than in healthy ones(P<0.05), and the mRNA of CD105and integrin αvβ6 were much higher reversely(P<0.05). After miR-1976 was over-expressed in VK2/E6E7 cell lines, the cell proliferation and apoptosis were scarcely impacted by the lentivirus, and the mRNA of CD105and integrin αvβ6 were much lower than before(P<0.05). ConclusionIt has been verified that miR-1976 can regulate the expression of integrin αvβ6 through CD105, and miR-1976 also participate in vaginal mucosa infection through influencing the adhesion ability of vaginal mucosa cells.

KEYWORDS:bacterial vaginal disease; miR-1976；CD105; integrin αvβ6

通信作者:李萍, E-mail:liping0099@126.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81370679); 江蘇省揚(yáng)州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014189)

收稿日期:2014-12-20

中圖分類號(hào):R 711.73

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)07-006-05DOI: 10.7619/jcmp.201507002