雷公藤內酯醇對前列腺癌PC-3細胞中的白細胞介素8的表達調節(jié)作用

劉彼得, 馮倩倩, 顧　曉, 李　巍

(1. 揚州大學醫(yī)學院 臨床醫(yī)學系, 江蘇 揚州, 225001;

2. 江蘇省中西醫(yī)結合老年病防治重點實驗室, 江蘇 揚州, 225001)

雷公藤內酯醇對前列腺癌PC-3細胞中的白細胞介素8的表達調節(jié)作用

劉彼得1,2, 馮倩倩1,2, 顧曉1,2, 李巍1,2

(1. 揚州大學醫(yī)學院 臨床醫(yī)學系, 江蘇 揚州, 225001;

2. 江蘇省中西醫(yī)結合老年病防治重點實驗室, 江蘇 揚州, 225001)

摘要:目的探討雷公藤內酯醇對前列腺癌PC-3細胞中白細胞介素8(IL-8)信號分子的表達影響。方法采用ELISA方法檢測雷公藤內酯醇(10、30、50 nmol/L)處理后PC-3細胞分泌至培養(yǎng)基中的IL-8蛋白水平變化；采用qRT-PCR方法檢測雷公藤內酯醇(10、30、50 nmol/L)作用下IL-8的mRNA水平變化；構建IL-8的啟動子熒光素酶報告基因，并轉染至前列腺癌細胞中，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測IL-8啟動子活性在雷公藤內酯醇作用下的變化情況。采用Wester Blotting方法檢測雷公藤內酯醇作用后細胞內的IL-8的兩個受體(CXCR1和CXCR2)的表達變化情況。結果雷公藤內酯醇處理后，PC-3細胞分泌至培養(yǎng)基中的IL-8的蛋白量有顯著下調，但IL-8的mRNA水平及其啟動子活性均未發(fā)生改變。對IL-8的受體的蛋白水平檢測結果表明，CXCR1和CXCR2受影響不顯著。結論雷公藤內酯醇通過下調IL-8的分泌來下調IL-8信號的活性，該作用是對IL-8的轉錄后的蛋白水平的調控機制。

關鍵詞:雷公藤內酯醇; 前列腺癌; 白細胞介素-8

前列腺癌(PCa)在美國男性腫瘤致死原因中排第2位[1], 近年來中國前列腺癌的發(fā)病率和死亡率也明顯上升[2]。前列腺癌患者血清白介素-8(IL-8)等炎癥分子的含量要明顯高于正常組，并且IL-8的血清含量可能作為此疾病的預后指標[3]。同時原位雜交實驗[4]表明，前列腺癌組織中腫瘤細胞內IL-8的mRNA表達隨疾病的惡化程度升高。免疫組化的研究[5-6]結果表明, 去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)細胞中高表達IL-8, 并且IL-8的高表達可能是激素去除治療引起的。IL-8的過表達與前列腺癌細胞的生長及對藥物治療的不敏感有關[7]。因此下調IL-8信號活性可能對前列腺癌治療有積極的意義。

雷公藤內酯醇(triptolide)提取自中藥雷公藤(tripterygiumwilfordii), 具有免疫抑制、抗腫瘤等生物活性。雷公藤內酯醇的14-琥珀酰鈉鹽被合成為前藥，進行過臨床I期實驗研究其抗腫瘤活性[8]。根據(jù)前期研究[9], 雷公藤內酯醇對前列腺癌PC-3細胞的生長有強烈的抑制作用。CRPC細胞株PC-3中有IL-8 組成型高表達[10]。本研究采用該細胞株對雷公藤內酯醇作用后細胞的IL-8分泌及其受體(CXCR1和CXCR2)的表達情況進行檢測，分析雷公藤內酯醇作用的可能機制。

1材料與方法

1.1　細胞培養(yǎng)

PC-3細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Clark)的Ham′s F12培養(yǎng)基(Hyclone)，在37 ℃、5% CO2的飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。每3～4 d傳代1次。

1.2　細胞分泌的IL-8水平檢測

細胞接種于24孔板(5×104/孔)，預培養(yǎng)24 h。更換培養(yǎng)基為含雷公藤內酯醇(0、10、30、50 nmol/L)的培養(yǎng)基(含0.1% DMSO), 培養(yǎng)48 h后，細胞刮刀將細胞從板底部分離，將全部孔內容物轉移至離心管，離心收集培養(yǎng)基上清，沉淀PBS清洗2次后采用細胞裂解液裂解并檢測裂解蛋白含量。培養(yǎng)基上清使用PBS 100倍稀釋后使用ELISA試劑盒(博士德)檢測細胞分泌的IL-8蛋白水平。ELISA結果使用細胞裂解液蛋白含量標準化。

1.3　qRT-PCR

PC-3細胞以2×105/孔的濃度接種于6孔板，預培養(yǎng)24 h。TP(0、10、30、50 nmol/L,n=3)處理48 h, Trizol法提取細胞總RNA, 使用反轉錄試劑盒(寶生物)進行反轉錄，并使用Sybr Green實時定量試劑盒(羅氏)對IL-8的mRNA表達量進行檢測。引物為IL-8 SY F和IL-8 SY R, 序列見表1。

表1　引物序列

1.4　雙熒光素酶報告基因實驗

采用RF克隆法[11-12]將IL-8上游啟動子片段克隆至pGL3-Basic質粒來構建報告基因載體。引物見表1。以人前列腺癌PC-3細胞的基因組DNA(采用Takara DNAiso試劑盒分離)為模板，使用引物IL-8 F和IL-8 R及PrimeSTAR-HS DNA聚合酶(寶生物)擴增IL-8基因-1164/+133序列，電泳并進行膠回收純化產物。采用RF克隆引物IL8-RF F和IL8-RF R(引物序列見表1，引物各含有25 bp的IL-8片段序列和25 bp pGL3-basic質粒待插入序列，大寫字母為載體互補序列，小寫字母為IL-8啟動子互補序列)，以上述膠回收產物為模板進行PCR，獲得帶有pGL3-Basic片段的IL-8引物片段，電泳后進行膠回收純化(Axygen小量膠回收試劑盒)。采用此產物作為RF克隆引物進行RF克隆，具體實驗流程如下: ① RF I反應體系包含200 ng pGL3-basic, 10 μL 5×PCR buffer, 560 ng引物，于95 ℃加熱2 min, 立即冷卻至4 ℃; ② RF II反應體系：向RF I中加入8 mmol/L dNTPs和1.25 U PrimeSTAR HS DNA聚合酶，進行PCR反應: 72 ℃ 5 min, 98 ℃ 10 s, 70 ℃ 5 s, 72 ℃ 5 min, 15個循環(huán)，每個循環(huán)降溫1 ℃; 98 ℃ 10 s, 55 ℃ 5 s, 72 ℃ 5 min, 20個循環(huán); 72 ℃ 7 min, 4 ℃結束反應。取10 μL RF II反應產物加入0.5 μL DpnI (10 U/μL), 37 ℃消化2 h以降解DNA甲基化的母質粒(pGL3-basic)。用熱激法將2 μL消化產物轉化至感受態(tài)大腸桿菌(DH5α, Takara)中，使用promega提供的引物序列RV3和GL2以及taq DNA聚合酶(Takara)進行菌落PCR鑒定。菌落PCR篩選出陽性菌落并進行測序鑒定。質粒命名為pGL3-IL8。

PC-3細胞接種至24孔細胞培養(yǎng)板, 37 ℃培養(yǎng)24 h至細胞達到70%～80%融合。更換opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco)，采用FuGene HD試劑(Promega)轉染0.7 μg質粒(包含0.6 ng熒光素酶報告質粒, 0.09 μg pcDNA3和0.01 μg pCMV-Renilla質粒)至PC-3細胞中。37 ℃孵箱培養(yǎng)6 h后換Ham′s F12(含10% FBS)培養(yǎng)基，孵箱培養(yǎng)過夜, TP (0、30、50 nmol/L)處理24 h。用PBS (pH 7.4)清洗細胞，每孔加入100 μL裂解液(Promega)裂解細胞，取10 μL細胞裂解產物，使用雙熒光素酶活性檢測試劑盒(Promega)檢測裂解液中的熒光素酶活性(熒光定量酶標儀, Synergy 2, BioTech), 計算螢火蟲熒光素酶的化學發(fā)光值與內參海腎熒光素酶化學發(fā)光值的比值(F/R)。

1.5　Western Blot分析

PC-3細胞以2×105/孔的濃度接種于6孔板，預培養(yǎng)24 h。TP(0、10、30、50 nmol/L,n=3)處理48 h, 提取細胞總蛋白，采用碧云天BCA試劑盒定量蛋白濃度。細胞提取物進行10% SDS/PAGE凝膠并電泳(上樣量30 μg), 轉移蛋白至PVDP膜，5%脫脂奶粉的TBS封閉；用TBST洗滌1次，分別加入抗CXCR1抗體(1∶1 000稀釋, Proteintech)、抗CXCR2抗體(1∶1 000稀釋，Proteintech)和抗β-actin抗體(1∶1 000稀釋，中杉金橋), 4 ℃搖床過夜，加入HRP-山羊抗兔二抗或HRP-山羊抗小鼠二抗(1∶5 000稀釋，中杉金橋)，室溫搖床孵育1 h, ECL顯色，用化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)成像(FluorChem FC2, Alpha Innotech)。

1.6　統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件，檢測結果以均數(shù)±標準差表示，組內比較采用one-way ANOVA檢測,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義

2結果

2.1　雷公藤內酯醇下調IL-8蛋白表達

雷公藤內酯醇作用人前列腺癌細胞PC-3后，采用ELISA方法對細胞分泌至培養(yǎng)基上清中的IL-8進行定量檢測，ELISA結果計算得到的培養(yǎng)基中的IL-8使用細胞蛋白濃度進行標準化。PC-3細胞分泌IL-8，而雷公藤內酯醇在10、30、50 nmol/L的濃度下，均顯著抑制了PC-3細胞向培養(yǎng)基中分泌IL-8。見圖1。

***P<0.001

圖1雷公藤內酯醇處理PC-3細胞48 h后

細胞分泌IL-8的變化情況

2.2　IL-8的mRNA水平和啟動子活性不受TP的調控

IL-8的調控可能是轉錄水平也可能是轉錄后水平，為進一步明確轉錄調控的機制，采用qRT-PCR和構建啟動子分別對IL-8的mRNA水平和啟動子的轉錄活性進行了分析。qRT-PCR結果顯示，雷公藤內酯醇雖然在10、30、50 nmol/L的濃度下引起了蛋白分泌的改變，但是PC-3細胞中的IL-8的mRNA水平在相同的藥物濃度下未見任何顯著變化(圖2)，提示對mRNA水平的調控可能不是關鍵的調控機制。為進一步確認轉錄調控不參與雷公藤內酯醇對PC-3細胞中IL-8的下調控機制，采用RF克隆法構建了IL-8啟動子報告基因，菌落PCR和測序鑒定證明插入片段正確且無突變，該質粒命名為pGL3-IL8。將pGL3-IL8和pRL-CMV共轉染至PC-3細胞，采用雙熒光素酶實驗對雷公藤內酯醇作用后IL-8的啟動子活性進行分析。如圖3所示，雷公藤內酯醇處理后相對熒光素酶活性無顯著變化，提示雷公藤內酯醇不影響IL-8的啟動子活性。

2.3　CXCR1和CXCR2的表達水平變化

IL-8通過作用于其受體(CXCR1和CXCR2)發(fā)揮作用，采用Western blotting方法對雷公藤內酯醇處理后PC-3細胞中的這兩個受體的表達情況進行了分析。在實驗中使用的各個雷公藤內酯醇的濃度下，CXCR1和CXCR2的蛋白水平均無顯著影響(圖4)。

圖2　雷公藤內酯醇處理PC-3細胞后48 h的qRT-PCR檢測細胞內IL-8的mRNA水平變化

圖3　雷公藤內酯醇(30、50 nmol/L)處理轉染了pGL3-IL8的啟動子報告基因載體的PC-3細胞后細胞內的熒光素酶活性的變化

圖4雷公藤內酯醇處理PC-3細胞48 h后Western blotting檢測細胞內的CXCR1和CXCR2的表達變化情況(TP: 雷公藤內酯醇)

3討論

本研究結果表明，雷公藤內酯醇對前列腺癌PC-3細胞中的IL-8的分泌有非常顯著的抑制作用。IL-8是重要的促炎癥因子，最初發(fā)現(xiàn)的活性為引發(fā)中性粒細胞趨化和脫顆粒。近年來的進一步研究發(fā)現(xiàn), IL-8也可作用于腫瘤細胞，刺激腫瘤細胞的增殖，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。體外利用激素敏感的前列腺癌細胞株LNCaP和LAPC4實驗研究[7, 13]表明，IL-8支持激素敏感的前列腺癌在激素去除的情況下生長，并IL-8可能是前列腺癌轉變?yōu)镃RPC的關鍵因子, IL-8通過誘導酪氨酸及絲氨酸/蘇氨酸激酶活性誘導前列腺癌細胞在激素去除的情況下增殖并轉移。對激素非依賴的前列腺癌細胞中IL-8信號通路的干擾可以抑制CRPC 細胞的生長[14]。IL-8對這些CRPC細胞生長的刺激和對凋亡的抑制作用也可能是AIPC對化療不敏感的機制之一。前列腺癌中過表達IL-8 造成前列腺癌細胞對多西紫杉醇耐藥[7]。此外，采用siRNA抑制IL-8表達可增強AIPC細胞株PC-3和DU145對多西紫杉醇、星狀孢子素和雷帕霉素這些化療藥物的敏感性[10,15]。這些報道提示，雷公藤內酯醇對IL-8的抑制可能會有助于CRPC的治療，可能是其對抗前列腺癌細胞的活性機制之一。

雖然雷公藤內酯醇對前列腺癌PC-3細胞中的IL-8的分泌有非常顯著的抑制作用，但是IL-8的轉錄調控及其他mRNA水平的調控作用均無顯著的變化。同時IL-8的細胞表明受體CXCR1和CXCR2在PC-3細胞中的表達也無顯著變化。提示雷公藤內酯醇對IL-8信號的作用主要是通過對IL-8的轉錄后的調控機制實現(xiàn)的。據(jù)報道[16-17]雷公藤內酯醇是蛋白酶體抑制劑，可抑制蛋白的泛素化降解過程，提示雷公藤內酯醇對蛋白水平可能有直接調控作用。NF-κB被認為與前列腺癌的進展有密切關系，其過表達與CRPC的發(fā)生有關[18]。有報道[19-20]認為NF-κB是IL-8轉錄調控的重要機制，而p38為IL-8 mRNA水平穩(wěn)定性調控的關鍵機制。但也有研究[21]證實NF-κB被證實有調控IL-8釋放的能力。NF-κB的主要調控途徑之一為PI3K/AKT信號通路[22], 但前列腺癌中最為常見的是PTEN的缺失導致PI3K/AKT過度活化，并降解NF-κB的抑制因子IκBα, 導致了NF-κB的過度活化。本研究也證實在PC-3細胞中，雷公藤內酯醇在10、30、50 nmol/L下可下調細胞內的NF-κB表達(該結果未發(fā)表)。提示雷公藤可能通過這些機制直接調節(jié)IL-8的水平。

綜上所述，本研究結果表明，雷公藤內酯醇對前列腺癌PC-3細胞中的IL-8的分泌有非常顯著的抑制作用。但是IL-8的轉錄調控及其他mRNA水平的調控作用均無顯著變化。同時雷公藤內酯醇對PC-3細胞表面的IL-8受體CXCR1和CXCR2表達也無顯著影響。雷公藤內酯醇對IL-8的抑制可能會有助于CRPC的治療，可能是其對抗前列腺癌細胞的活性機制之一。

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論著

Role of triptolide in expression and regulation of interleukin-8 in prostate cancer PC-3 cells

LIU Bide1,2, FENG Qianqian1,2, GU Xiao1,2, LI Wei1,2

(1.DepartmentofClinicalMedicine,MedicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,

Jiangsu, 225001; 2.JiangsuKeyLaboratoryofIntegratedTraditionalChineseandWestern

MedicineforPreventionandTreatmentofSenileDiseases,Yangzhou,Jiangsu, 225001)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the influence of triptolide on expression of signal molecula interleukin-8 (IL-8) in prostate cancer PC-3 cells.MethodsAfter PC-3 cells were treated with triptolide (10, 30 and 50 nmol/L), the ELISA assay was used to detect the changes of IL-8 secreted by PC-3 cells. The IL-8 mRNA change in PC-3 cells by triptolide (10, 30 and 50 nmol/L) was determined by qRT-PCR assay. The pGL3-IL8 promoter reporter plasmid was constructed, and pGL3-IL8 and pRL-CMV were transfected into PC-3 cells, and the luciferase activity was investigated by dual-luciferase reporter assay. The protein levels of IL-8 receptors (CXCR1 and CXCR2) were detected by Western Blotting assay. ResultsTriptolide decreased the secretion of IL-8 in PC-3 cells, but promoter activity and mRNA level showed no significant changes. The expressions of CXCR1 and CXCR2 did not change after triptolide treatment. ConclusionTriptolide can down regulate the IL-8 signaling activity by down regulating the secretion of IL-8 in PC-3 cells, and the mechanism might be a posttranscriptional protein level regulation.

KEYWORDS:triptolide; prostate cancer; interleukin-8

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81102460); 江蘇省高校教育廳自然基金面上項目(14KJB310026)

通信作者:李巍, E-mail: weili@yzu.edu.cn

收稿日期:2014-12-23

中圖分類號:R 737.25

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)07-001-05DOI: 10.7619/jcmp.201507001